Name: generating a "humanized" drosophila s2 cell line sensitive to pharmacological inhibition of kinesin-5
Uploaded: 2016-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5 at JoVE.com

Nos gustaría dar las gracias a Patricia Wadsworth por el don de la kinesin-5 construcción. Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH (5 R01 GM107026) a TJM y por Research Grant N º 5-FY13-205 de la Fundación March of Dimes a TJM, así como el apoyo de la Fundación Charles H. Hood, Inc., Boston, MA. a TJM

1. transfectar células S2 <ol><li> Desde un cultivadas previamente matraz de 25 cm 2, añadir células GFP-alfa-tubulina-expresión de S2 10 a un volumen final de 2 ml a 100% de confluencia, y les permiten semi-adherirse a la parte inferior de una 35 mm placa de cultivo de tejidos para aproximadamente 1 hr. </li><li> Retire el soporte de la antena. Transfectar 2 g de la Eg5-mCherry construir 11 con 1 ml de medio de Schneider suplementado con 10% FBS (denominado en lo sucesivo como medios de Schneider) y reactivo de transfección, siguiendo el protocolo del fabricante. Sellar el plato con Parafilm y se incuban las células a 25 ° C durante 16-18 horas. </li><li> Añadir 1 ml de medio de Schneider. Células Regreso a 25 ° C incubadora. </li><li> El día 3 después de la transfección, transferir 500 l de células transfectadas en un nuevo 35 mm placa de cultivo de tejido que contiene 1,5 ml de medio de Schneider para una inducción de prueba. Inducir la expresión de Eg5-mCherry mediante la adición de CuSO 4 </sub&gt; a una concentración final de 500 mM. Sellar el plato en Parafilm y se incuba a 25 ° CO / N. </li><li> Para hacer cubreobjetos A recubierto concanavalina, pipeta suficiente volumen de concanavalina Una solución (0,5 mg / ml disuelto en H 2 O) para cubrir un ácido lava cubreobjetos, eliminar el exceso, y permitir que el cubreobjetos se seque al aire. </li><li> Colocar un 22 mm x 22 mm concanavalina A-recubierto cubreobjetos en un lugar limpio 35 mm placa de cultivo tisular, a continuación, las semillas 500 l en 100% de confluencia de las células inducidas en el cubreobjetos y permitir que las células se adhieran durante 1 hora a RT. </li><li> Para comprobar si la expresión Eg5-mCherry, montar el cubreobjetos en una cámara de rosa (o embarcación de imagen apropiado) con los medios de comunicación para obtener imágenes a temperatura ambiente en un microscopio de fluorescencia. Utilice fuentes de luz adecuadas y conjuntos de filtros para visualizar las células. Por ejemplo, el microscopio usado en este estudio tiene una fuente de luz blanca LED y EGFP (FITC / Cy2) y DsRed (TRITC / Cy3) cubos de filtros. Eg5-mCherry localiza a los microtúbulos y se enriquece neapolos r husillo. </li><li> Después de asegurarse de que las células están expresando tanto Eg5-mCherry y GFP-α-tubulina, transferir el resto de las células no inducidas, transfectadas a un 25 cm 2 matraz de cultivo tisular que contiene 4 ml de medio de Schneider. </li><li> Añadir Blasticidin S HCl a una concentración final de 25 mg / ml al matraz de células transfectadas y continuar la división en la presencia de / ml S HCl Blasticidin 25 g hasta la muerte celular deja de ser seguro de comprobar para la expresión de Eg5-mCherry periódicamente. Incubar líneas celulares en 25 ° C incubadora. NOTA: El porcentaje de células que expresan los aumentos Eg5-mCherry lo largo del tiempo. </li><li> Una vez que las células son transfectadas de forma estable, continúe para dividir en ausencia de fármaco y congelar 12 células para uso futuro. </li></ol> 2. ARN de interferencia <ol><li> PCR amplificar una región pb ~ 500 de KLP61F de ADNc (LD15641) usando el cebador con adición de secuencia del promotor T7 (secuencia proporcionada en la Lista de Materiales) para serutilizado como una plantilla para la síntesis de dsRNA. <ol><li> Establecer cuatro reacciones de PCR, 50 l cada uno, conteniendo 100 ng de ADN plantilla, 25 mM de cada cebador, tampón apropiado, y la polimerasa. Ajuste el protocolo de PCR en el termociclador de acuerdo con el protocolo del fabricante de la polimerasa. </li><li> Piscina y limpias cuatro reacciones de PCR utilizando una PCR limpiar kit de acuerdo con el protocolo del fabricante. Guarde la plantilla limpia a -20 ° C. </li></ol></li><li> Preparar RNA de doble hebra (dsRNA) de la plantilla utilizando un kit de transcripción de ARN T7, siguiendo las instrucciones del fabricante. Esperar ~ concentración de 5-15 mg / ml de ARN de doble cadena. Guarde dsRNA a -20 ° C. </li><li> Para Knockdown KLP61F con dsRNA, permiten que las células S2 expresan Eg5-mCherry al 25% de confluencia semi-se adhieren a la parte inferior de una 35 mm placa de cultivo de tejido durante 1 hora. </li><li> Quite el papel de los platos y añadir 5 g de dsRNA contra KLP61F (Drosophila kinesin-5) diluido en 1 ml de Schneider sin suero &#39;s medios de comunicación. </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora, a continuación, añadir 1 ml de medio de Schneider con 10% de SFB. Se incuban las células a 25 ° C. </li><li> 24 hr después del tratamiento dsRNA, inducir la expresión de Eg5-mCherry mediante la adición de CuSO 4 a una concentración final de 500 mM. Se incuban las células a 25 ° C durante otras 24 hr. </li></ol> 3. Imágenes de células vivas <ol><li> Coloque un 22 mm x 22 mm concanavalina A cubreobjetos recubierto en una limpia de 35 mm placa de cultivo de tejidos. </li><li> Seed 500 l de las células que han sido tratadas con dsRNA e inducidos O / N a la concanavalina A cubreobjetos recubiertos y permitir que se adhieran durante aproximadamente 1 hr. </li><li> Montar el cubreobjetos en una cámara de rosa (o recipiente apropiado) para obtener imágenes. </li><li> Encuentra células mitóticas que expresan tanto Eg5-mCherry y GFP-α-tubulina. NOTA: Las células mitóticas que expresan sólo GFP-α-tubulina debe tener husos monopolares desde KLP61F, que se requiere para la bipolaridad husillo, es derribado 10,13. </li><li> Recoge imágenes time-lapse de husillos bipolares (por ejemplo, 1 cuadro por minuto) en las células que expresan tanto Eg5-mCherry y GFP-α-tubulina. </li><li> Si bien la imagen, retire el soporte de la cámara de color de rosa, y reemplazarlo con los medios de comunicación de Schneider contiene 1 M STLC más de 3 intercambios consecutivos medios (~ 5 ml en total) en la cámara para visualizar colapso husillo. </li><li> Al lavado por la droga y revertir el colapso de husillo, retire con cuidado los medios de comunicación que contiene STLC-de la cámara de color de rosa, y lavar en medios de Schneider 4x (total de 6.8 ml) antes de rellenar la cámara de rosa por última vez con medio fresco. Continuar formación de imágenes. </li></ol> 4. Error Ensayo Corrección <ol><li> Coloque un 22 mm x 22 mm concanavalina A cubreobjetos revestidos en 35 mm placas de cultivo de tejidos limpios. </li><li> Semilla de 500 l de células que han sido tratados con KLP61F dsRNA sobre la concanavalina A cubreobjetos recubiertos y permitir que se adhieran. </li><li> Después las células son ADHERed, añadir 1,5 ml de medio de Schneider a cada plato para llevar el volumen final hasta 2 ml. </li><li> Para detener las células en la mitosis, añadir MG132 a una concentración final de 10 mM a cada uno de los platos, y se incuba durante 1 hr. </li><li> Añadir 1 M STLC e incubar durante 1 hora para permitir que los monopolos se formen. </li><li> Lave la STLC enjuagando cubreobjetos 3 veces con 2 ml de medio de Schneider frescas cada vez. </li><li> Incubar cubreobjetos con medios de Schneider, además de alguna droga farmacológicos (por ejemplo, inhibidores de quinasa Aurora) o DMSO como un control. Nota: concentraciones de inhibidor varían y concentraciones finales apropiadas deben ser determinados por el experimentador. Las soluciones madre se hacen típicamente de tal manera que el inhibidor se diluye 1: 1000 en medios de comunicación. En este caso una dilución 1: 1000 de DMSO (o disolvente apropiado) sirve como el control del vehículo. Usamos el inhibidor de Aurora B Binucleine 2 a una concentración final de 40 mM. </li><li> Fijar las células en diferentes puntos de tiempo to observar la progresión de la formación del huso bipolar y para evaluar los estados de fijación cinetocoro. Arreglar: <ol><li> Rápidamente enjuagar los cubreobjetos con 2 ml de 1x BRB-80. </li><li> Fijar las células mediante la adición de 2 ml de 10% de paraformaldehído diluidas en 1x BRB-80 durante 10 min. Pipet paraformaldehído cuidadosamente en una campana química. </li><li> Permeabilizar las células con 2 ml de 1x PBS + 1% de Triton-X para 8 min. </li><li> Lavar los portaobjetos 3x con 2 ml de 1x PBS + 0,1% de Triton-X. </li><li> Transferencia cubreobjetos lado celular boca arriba sobre una lámina de Parafilm (use un marcador para etiquetar Parafilm apropiada para realizar un seguimiento de las diapositivas) en una placa de Petri de 150 mm. </li><li> Cubrir los cubreobjetos con 150 l de suero de burro hervida (BDS) e incubar a temperatura ambiente durante 1 hr para bloquear anticuerpo unión no específica. Nota: En este caso, el protocolo de fijación se puede detener a continuar en un momento posterior. Los cubreobjetos se pueden almacenar en una cámara de humedad a 4 ° C durante un máximo de 24 hr. Para hacer que la cámara de humedad, alinear el borde de un plato de 150 mmcon un laboratorio toallita húmeda y cubrir con el plato tapa Petri. </li><li> Eliminar bloque, e incubar los cubreobjetos durante 1 h a RT con 150 l de anticuerpos primarios diluidos apropiadamente en BDS a manchar para cinetocoros y los microtúbulos a concentraciones finales de 2 g / ml (o de acuerdo con las recomendaciones del fabricante) y 1 g / ml, respectivamente . Nota: En este caso, el protocolo de fijación se puede detener a continuar en un momento posterior. Los cubreobjetos se pueden almacenar en una cámara de humedad a 4 ° C durante un máximo de 24 hr. </li><li> Wash cubreobjetos 3x con 500 l de 1x PBS + 0,1% de Triton-X. </li><li> Incubar cubreobjetos durante 30-60 minutos a temperatura ambiente con los anticuerpos secundarios fluoróforo conjugado apropiadas diluidos en BDS. </li><li> Wash cubreobjetos 3x con 500 l de 1x PBS + 0,1% de Triton-X. </li><li> Incubar cubreobjetos con 150 l de BDS que contienen / ml DAPI concentración final 1 g durante 5 min. </li><li> Lave cubreobjetos 2x con 1x PBS + 0,1% Triton-X, y montar coverslips células hacia abajo sobre un portaobjetos de 3x1 &quot;con 8 l de medio de montaje. Pinte las esquinas con esmalte de uñas para inmovilizar los cubreobjetos en portaobjetos. </li></ol></li><li> Celdas de imagen con husillos bipolares que están expresando Eg5-mCherry. Tome una serie Z que consta de 30 aviones a 0.2 micras intervalos en todos los canales utilizando un objetivo de 100X. Analizar cuidadosamente los cinetocoros y los microtúbulos para determinar los estados de fijación (biorientado o accesorios syntelic). </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Visualización de corrección de errores es una técnica valiosa para estudiar los pasos implicados en esta importante y complejo proceso celular. Para ello, los archivos adjuntos erróneas se generan utilizando inhibidores reversibles, y corrección de errores se observa sobre lavado de la droga. Este ensayo fue desarrollado originalmente usando células de cultivo de tejidos de mamíferos 5. Sin embargo la presencia de gran número de cinetocoros en muchos tipos de células de mamíferos modelo plantea un desafío en la observación de eventos de corrección de errores individuales. Células Drosophila S2 poseen tan sólo 4 pares de cinetocoros, por lo que una línea celular más preferible para la observación de la corrección de errores. Sin embargo, un inconveniente importante es que muchos inhibidores son ineficaces en las células S2 de Drosophila. Por lo tanto, la capacidad de generar una línea celular humanizado Drosophila S2 humana que expresa kinesin-5 proporciona una valiosa herramienta para estudiar la corrección de errores. Aunque las células S2 de Drosophila pueden ser unamejor línea de células para estudiar la corrección de errores, los múltiples pasos involucrados en la obtención de la línea celular y derribando genes esenciales plantea algunos retos para esta técnica. Por ejemplo, la eficacia de transfección puede ser muy baja. Si es menos de 20% de las células están expresando el Eg5-mCherry, la transfección se debe repetir el proceso de selección como se necesitará más tiempo. Además, el porcentaje de células que expresan ambas proteínas fluorescentes puede disminuir con el tiempo. Esto se puede superar mediante la división de las células en presencia de Blasticidin S HCl e higromicina B para seleccionar las células que expresan Eg5-mCherry y GFP-α-tubulina, respectivamente. También es importante tener en cuenta que las células S2 de Drosophila tienen orthologues a muchas proteínas humanas y; por lo tanto, es crítico para optimizar las condiciones desmontables para las proteínas endógenas. Las condiciones óptimas desmontables pueden variar en la cantidad de ARN de doble cadena y la duración del tratamiento. Teniendo en cuenta la aparición y la rápida mejora de CRISPR-Cas9 Technologies 15-17, generación de una línea celular de Drosophila con el gen KLP61F sustituido por Eg5 humana presenta una poderosa alternativa que superar las limitaciones de la transfección y el enfoque de caída. Nuestro trabajo demuestra que volar-a humano sustitución de genes debe ser una opción viable en este caso, a pesar de los reactivos necesarios para hacerlo en las células S2 de Drosophila se están desarrollando actualmente. Este procedimiento no se limita a Eg5, pero se puede aplicar para estudiar la función de otras proteínas de interés. Si el uso de inhibidores que han sido previamente establecidos para ser ineficaz en las células S2 de Drosophila, este protocolo puede ser modificado para estudiar el efecto directo de los inhibidores en células vivas sin preocupaciones sobre los efectos de destino fuera. La línea celular producida usando este protocolo también podría utilizarse en el cribado de alto rendimiento de los análisis para identificar potenciales fármacos dirigidos a proteínas implicadas en la corrección de errores.

Igualdad de segregación del genoma durante la división celular requiere interacciones correctas entre el ADN y el huso microtúbulos replicados. Los microtúbulos interactuar físicamente con los cromosomas a través de un conjunto de proteínas que se reúne en centrómeros conocido como el cinetocoro 1. Distribución correcta de los cromosomas requiere que cinetocoros hermanos se biorientado, en el que cada hermana se asocia con los microtúbulos procedentes de polos del huso opuestas. Microtúbulos cinetocoro (kt-MT) archivos adjuntos que no están en la conformación biorientado se forma rápida y eficiente desestabilizó para proporcionar la oportunidad de establecer biorientación en un proceso conocido como la corrección de errores. Un ensayo de corrección de errores que se estableció previamente en células de mamífero requiere el montaje de los husillos 5 monopolares usando inhibidores de moléculas pequeñas reversibles contra Eg5 (kinesin-5). El tratamiento de la droga genera una multitud de archivos adjuntos syntelic erróneas en las que botcinetocoros h hermanas se unen al mismo polo del huso. Un lavado posterior de la droga permite la visualización del proceso de corrección de errores. El ensayo de corrección de errores se puede realizar en presencia de inhibidores de moléculas pequeñas o caídas para estudiar la contribución de las proteínas candidatas a corregir erróneas adjuntos kt-MT. La capacidad de visualizar la corrección de errores en las células vivas es una poderosa herramienta para comprender mejor el mecanismo molecular implicado en este proceso complejo. Sin embargo, el gran número de cromosomas presentes en la mayoría de líneas celulares plantea un reto en la observación de los archivos adjuntos individuales kt-MT. Células Drosophila S2 serían ideales para aplicar el ensayo de corrección de errores, ya que contienen tan pocos como 4 cromosomas 6, pero inhibidores de molécula pequeña de kinesin 5 tales como S-tritil-L-cisteína (STLC) y monastrol 7-9 no afectan conjunto del husillo o la función motora kinesin-5 en células de Drosophila. Por lo tanto, génerosted una línea de células de Drosophila S2 expresando kinesin-5 humana bajo un promotor inducible que es sensible a los inhibidores de kinesina-5. Este protocolo se describe cómo la caída endógena Drosophila kinesin-5 homólogo, KLP61F, y el uso de esta línea celular en el ensayo de corrección de errores basado en células.

<table><tbody><tr><td>Effectine Transfection Reagent</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Klp61F cDNA</td><td>Drosophila Genomic Resource Center</td><td>13690</td><td>Gene Name LD15641</td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s Media</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, certified</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>Heat Inactivated, US origin</td></tr><tr><td>Copper(II) Sulfate (CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>C8027-500G</td><td>500&amp;nbsp;mM stock</td></tr><tr><td>S-trityl-L-cysteine</td><td>Sigma</td><td>164739-5G</td><td>1&amp;nbsp;mM stock in DMSO</td></tr><tr><td>Blasticidin HCl</td><td>Invitrogen</td><td>R21001</td><td>5&amp;nbsp;mg/ml stock in 1x PBS</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Invitrogen</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>T7 Large scale RNA Production System</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td>The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15&amp;nbsp;&amp;micro;g/&amp;micro;l</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi F primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi R primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC</td></tr><tr><td>PCR clean-up kit</td><td>Mo Bio Laboratories, Inc</td><td>1250</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma</td><td>C5275</td><td>0.5&amp;nbsp;mg/ml solution made by dissolving in 1x PBS.</td></tr><tr><td>Boiled Donkey Serum</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs</td><td>017-000-121</td><td>5% stock solution in 1x PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4&amp;nbsp;&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Mounting Media</td><td></td><td></td><td>20&amp;nbsp;mM Tris pH 8.0,&amp;nbsp; 0.5% &lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4&amp;nbsp;&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>1x BRB-80</td><td></td><td></td><td>80 mM PIPES pH 6.9; 1&amp;nbsp;mM EGTA; 1 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>White Light Source</td><td>Lumencor Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET EGFP Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>49002</td><td></td></tr><tr><td>DSRed Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>49005</td><td></td></tr><tr><td>anti-NDC80 antibody&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Custom made by the Maresca Lab</td></tr><tr><td>DM1&amp;alpha; (anti-&amp;alpha;-tubulin)</td><td>Sigma</td><td>T6199</td><td></td></tr><tr><td>anti-CID antibody</td><td>AbCam</td><td>ab10887</td><td></td></tr></tbody></table>

generating a &#34;humanized&#34; drosophila s2 cell line sensitive to pharmacological inhibition of kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.

KLP61F se requiere para formar husillos bipolares. El kinesin-5 humana, Eg5, puede rescatar la función de KLP61F en las células S2 de Drosophila (Figura 1A y D). Tras la adición de la quinesina-5 inhibidor (STLC), los niveles asociadas a los microtúbulos de la caída de motor (Figura 1B y E), y los colapsos de husillo, lo que resulta en un monopolo (Figura 1C y F) en las células que carecen endógeno KLP61F sobre RNAi éxito (película Suplementario 1). Es de destacar que los husillos bipolares colapsan tras la adición de STLC en las células S2 humanizados debido a kinesin-5 actividad no es necesaria para mantener la bipolaridad husillo en células humanas. Esta discrepancia interesante puede ser el resultado de diferencias en la superposición de microtúbulos interpolar y / o estabilidad en los dos sistemas modelo 14. Kinesin-5 la inhibición (Figura 2 A y E) se pueden Reve<html> RSED lavando la droga y la recuperación de un huso bipolar se puede seguir a través del tiempo. Tras la eliminación del inhibidor (Figura 2B y F), Eg5-mCherry re-asocia con los microtúbulos como un bipolares ensambla husillo (Figura 2C y G), y las células puede progresar en una anafase bipolar (Figura 2D y H, película Suplementario 2 ). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig1.jpg" /> Figura 1. La adición de 1 M STLC conduce a husos monopolares en células de Drosophila S2. Imágenes representativas de proyección de imagen de lapso de tiempo de una célula Drosophila S2 que expresan Eg5-mCherry (AC) y GFP-α-tubulina (DF) durante la adición de 1 M STLC. El inhibidor de Eg5 se añadió a 3 min. Barra de escala = 5 micras. Timestamp = min: seg.<html> w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig2.jpg" /> Figura 2. A bipolares reformas huso Al retirar STLC. Imágenes representativas de time-lapse de una célula Drosophila 2 expresando Eg5-mCherry (AD) y GFP-α-tubulina (EH) durante un experimento de lavado STLC. STLC se lavó a cabo a los 5 min. A bipolares reformas huso dentro de 1 hora de eliminar el STLC. Barra de escala = 5 micras. Marca de hora: min: seg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Película 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov1.jpg" /> ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Película Suplementario 1. (clic derecho para descargar). imágenes de fluorescencia Widefield de un ejemplo representativo de una célula Drosophila S2 expresando Eg5-mCherry ( izquierda) y GFP-α-tubulina (derecha). 1 M STLC se añadió a 2 min, y las formas de husillo un monopolo dentro de 10 min después de la adición del inhibidor. Las imágenes fueron adquiridas cada 1 min y jugó a una velocidad de 10 fotogramas por segundo. La barra de escala = 5 micras. <img alt="Película 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/washout.mov" target="_blank">Película Suplementario 2. (Haga clic derecho para descargar).</a> Imágenes Widefield fluorescencia de un ejemplo representativo de una célula Drosophila S2 expresando Eg5-mCherry (izquierda) y GFP-α-tubulina (derecha). Los medios que contienen 1 mM STLC se retiró y seenjuagados en 5 min. A bipolares reformas huso dentro de 1 hora de eliminar el inhibidor. Las imágenes fueron adquiridas cada 1 min y jugaron a un ritmo de 10 fotogramas por segundo. Barra de escala = 5 micras.

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Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Generación de un &quot;humanizado&quot;<em&gt; Drosophila</em&gt; S2 Línea Celular Sensible a farmacológico Inhibición de la Kinesin-5

This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

7.2K vistas.  University of Massachusetts, Amherst. This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined. 

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Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a rapid and high-throughput manner. S2 cells have proven amenable to both fixed- and live-cell imaging applications. Notably, live-cell imaging can yield valuable information about how loss or knockdown of a gene can affect the kinetics and dynamics of key events during cell division, including mitotic spindle assembly, chromosome congression, and segregation, as well as overall cell cycle timing. Here we utilize S2 cells stably transfected with fluorescently tagged mCherry:&#945;-tubulin to mark the mitotic spindle and GFP:CENP-A (referred to as &#8216;CID&#8217; gene in Drosophila) to mark the centromere to analyze the effects of key mitotic genes on the timing of cell divisions, from prophase (specifically at Nuclear Envelope Breakdown; NEBD) to the onset of anaphase. This imaging protocol also allows for the visualization of the spindle microtubule and chromosome dynamics throughout mitosis. Herein, we aim to provide a simple yet comprehensive protocol that will allow readers to easily adapt S2 cells for live imaging experiments. Results obtained from such experiments should expand our understanding of genes involved in the cell division by defining their role in several simultaneous and dynamic events. Observations made in this cell culture system can be validated and further investigated in vivo using the impressive toolkit of genetic approaches in flies.

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Cell divisions can be visualized in real time using fluorescently tagged proteins and time-lapse microscopy. Using the protocol presented here, users can analyze cell division timing dynamics, mitotic spindle assembly, and chromosome congression and segregation. Defects in these events following RNA interference (RNAi)-mediated gene knockdown can be assessed and quantified.

Uso de células Drosophila S2 para imágenes en vivo de la división celular

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

Investigación

Genética

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a cost-effective in vivo method to identify heterochromatin-promoting compounds by using Drosophila. The Drosophila&#39;s DX1 strain, having a variegated eye color phenotype that reflects the extents of heterochromatin formation, thereby providing a tool for a heterochromatin-promoting drug screen. In this screening method, eye variegation is quantified based on the surface area of red pigmentation occupying parts of the eye and is scored on a scale from 1 to 5. The screening method is straightforward and sensitive and allows for testing compounds in vivo. Drug screening using this method provides a fast and inexpensive way for identifying heterochromatin-promoting drugs that could have beneficial effects in cancer therapeutics. Identifying compounds that promote the formation of heterochromatin could also lead to the discovery of epigenetic mechanisms of cancer development.

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is a widely used experimental model suitable for screening drugs with potential applications for cancer therapy. Here, we describe the use of Drosophila variegated eye color phenotypes as a method for screening small-molecule compounds that promote heterochromatin formation.

Un método de detección para la identificación de medicamentos que promueven la heterocromatina utilizando Drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

Ex cultivo in vivo de la Plenaria, los cerebros en desarrollo de Drosophila

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Neurociencias

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted epithelial morphogen. In this assay, Fog is used as an agonist to activate Rho through a signaling cascade that includes a G-protein-coupled receptor (Mist), a G&#945;12/13 protein (Concertina/Cta), and a PDZ-domain-containing guanine nucleotide exchange factor (RhoGEF2). Fog signaling results in the rapid and dramatic reorganization of the actin cytoskeleton to form a contractile purse string. Soluble Fog is collected from a stable cell line and applied ectopically to S2R+ cells, leading to morphological changes like apical constriction, a process observed during developmental processes such as gastrulation. This assay is amenable to high-throughput screening and, using RNAi, can facilitate the identification of additional genes involved in this pathway.

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

Here we describe a contractility assay using Drosophila S2R+ cells. The application of an exogenous ligand, folded gastrulation (Fog), leads to the activation of the Fog signaling pathway and cellular contractility. This assay can be used to investigate the regulation of cellular contractility proteins in the Fog signaling pathway.

Un ensayo basado en células para investigar la miosina no muscular II contractilidad a través de la gastrulación doblado señalización camino en Drosophila S2R + células

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted ...

Biología del Desarrollo

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Descongelación, cultivo y criopreservación de líneas de células de Drosophila

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Preparación de Drosophila Células S2 para microscopía de luz

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Biología

Inhibición optogenética de la contractilidad de la actomiosina mediada por Rho1 en Drosophila

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at multiple length scales, such as cell division, cell migration, epithelial folding, and branching morphogenesis. An in-depth understanding of the role of actomyosin contractility in morphogenesis requires approaches that allow the rapid inactivation of actomyosin, which is difficult to achieve using conventional genetic or pharmacological approaches. The presented protocol demonstrates the use of a CRY2-CIBN based optogenetic dimerization system, Opto-Rho1DN, to inhibit actomyosin contractility in Drosophila embryos with precise temporal and spatial controls. In this system, CRY2 is fused to the dominant negative form of Rho1 (Rho1DN), whereas CIBN is anchored to the plasma membrane. Blue light-mediated dimerization of CRY2 and CIBN results in rapid translocation of Rho1DN from the cytoplasm to the plasma membrane, where it inactivates actomyosin by inhibiting endogenous Rho1. In addition, this article presents a detailed protocol for coupling Opto-Rho1DN-mediated inactivation of actomyosin with laser ablation to investigate the role of actomyosin in generating epithelial tension during Drosophila ventral furrow formation. This protocol can be applied to many other morphological processes that involve actomyosin contractility in Drosophila embryos with minimal modifications. Overall, this optogenetic tool is a powerful approach to dissect the function of actomyosin contractility in controlling tissue mechanics during dynamic tissue remodeling.

Autor destacado: Inhibición optogenética de la contractilidad de la actomiosina mediada por Rho1 junto con la medición de la tensión epitelial en embriones de Drosophila  

Actomyosin contractility plays an important role in cell and tissue morphogenesis. However, it is challenging to manipulate actomyosin contractility in vivo acutely. This protocol describes an optogenetic system that rapidly inhibits Rho1-mediated actomyosin contractility in Drosophila embryos, revealing the immediate loss of epithelial tension after the inactivation of actomyosin in vivo.

Inhibición optogenética de la contractilidad de la actomiosina mediada por Rho1 junto con la medición de la tensión epitelial en embriones de Drosophila

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Aislamiento y purificación de Kinesin desde Drosophila Los embriones

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Generación de un "humanizado"

Resumen

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Uso de células Drosophila S2 para imágenes en vivo de la división celular

Un método de detección para la identificación de medicamentos que promueven la heterocromatina utilizando Drosophila

Ex cultivo in vivo de la Plenaria, los cerebros en desarrollo de Drosophila

Un ensayo basado en células para investigar la miosina no muscular II contractilidad a través de la gastrulación doblado señalización camino en Drosophila S2R + células

Descongelación, cultivo y criopreservación de líneas de células de Drosophila

Preparación de Drosophila Células S2 para microscopía de luz

Inhibición optogenética de la contractilidad de la actomiosina mediada por Rho1 junto con la medición de la tensión epitelial en embriones de Drosophila

Inhibición optogenética de la contractilidad de la actomiosina mediada por Rho1 junto con la medición de la tensión epitelial en embriones de Drosophila

Inhibición optogenética de la contractilidad de la actomiosina mediada por Rho1 junto con la medición de la tensión epitelial en embriones de Drosophila

Aislamiento y purificación de Kinesin desde Drosophila Los embriones