Wir möchten Patricia Wadsworth für das Geschenk des Kinesin-5-Konstrukt danken. Diese Arbeit wurde von einer NIH Zuschusses (5 R01 GM107026) nach TJM und Research Grant No. 5-FY13-205 vom March of Dimes Foundation nach TJM, sowie die Unterstützung von der Charles H. Hood Foundation, Inc. unterstützt, Boston, MA. nach TJM

1. Transfektion von S2-Zellen <ol><li> Aus einer zuvor gezüchteten 25 cm 2 -Kolben, fügen GFP-α-Tubulin-exprimierenden S2-Zellen 10 bis zu einem Endvolumen von 2 ml zu 100% Konfluenz und ihnen erlauben, halb haften an den Boden eines 35 mm-Gewebekulturschale für ca. 1 Std. </li><li> Entfernen Sie das Medium aus dem Gericht. Transfizieren 2 ug der Eg5-mCherry konstruieren 11 mit 1 ml Schneiders Medium mit 10% FBS (bezeichnet als Schneiders Medien bezeichnet) und Transfektionsreagenz nach dem Protokoll des Herstellers. Dichten Sie das Gericht mit Parafilm und inkubieren Zellen bei 25 ° C für 16-18 Stunden. </li><li> 1 ml der Schneider Medien. Zurückzukehren Zellen auf 25 ° C Inkubator. </li><li> Am Tag 3 nach der Transfektion übertragen 500 ul transfizierter Zellen in eine neue 35-mm-Gewebekulturschale, enthaltend 1,5 ml des Schneiders Medien für eine Test Induktion. Induzieren die Expression von Eg5-mCherry durch Zugabe von CuSO 4 </sub&gt;, um eine Endkonzentration von 500 uM. Dichten Sie das Gericht in Parafilm und Inkubation bei 25 ° CO / N. </li><li> Um Concanavalin A-beschichtete Deckgläser, Pipetten genug Volumen von Concanavalin A (0,5 mg / ml in H 2 O gelöst) zu beschichten, machen eine Säure gewaschen Deckglas, entfernen Sie das überschüssige, und lassen Sie das Deckglas an der Luft trocknen. </li><li> Platzieren eines 22 mm x 22 mm Concanavalin-A-beschichtete Deckgläschen in einer sauberen 35-mm-Gewebekulturschale, dann Samen 500 ul zu 100% Konfluenz der induzierten Zellen auf dem Deckglas und damit die Zellen für 1 h bei RT halten. </li><li> Um Eg5-mCherry Ausdruck zu überprüfen, montieren Sie die Deckgläschen in eine Rose Kammer (oder entsprechende Abbildungsgefäß) mit Medien für die Bildgebung bei RT auf einem Fluoreszenzmikroskop. Verwenden Sie geeignete Lichtquellen und Filter-Sets, um die Zellen zu visualisieren. Beispielsweise das Mikroskop in dieser Studie verwendet wird, besitzt einen LED-Weißlichtquelle und EGFP (FITC / Cy2) und DsRed (TRITC / Cy3) Filterwürfel. Eg5-mCherry lokalisiert an Mikrotubuli und angereichert near Spindelpole. </li><li> Nachdem sichergestellt ist, dass die Zellen, die sowohl Eg5-mCherry und GFP-α-Tubulin, übertragen den Rest der transfizierten, nicht-induzierten Zellen auf eine 25 cm2 Zellkulturflasche mit 4 ml Schneiders Medien. </li><li> In Blasticidin S HCL in einer Endkonzentration von 25 ug / ml in den Kolben von transfizierten Zellen und weiter Aufteilen in Gegenwart von 25 ug / ml Blasticidin S HCl bis zum Zelltod nicht mehr sicher zu sein, um für die Expression von Eg5-mCherry in regelmäßigen Abständen überprüfen. Inkubieren Zelllinien in 25 ° C-Inkubator. HINWEIS: Der Prozentsatz von Zellen, die Eg5-mCherry Zeit zunimmt. </li><li> Sobald Zellen stabil transfizierten, weiterhin in der Abwesenheit von Arzneimittel aufgeteilt und gefrier 12 Zellen für zukünftige Verwendung. </li></ol> 2. RNA-Interferenz <ol><li> PCR zu amplifizieren ein ~ 500 bp Region Klp61F von cDNA (LD15641) unter Verwendung des Primers mit Mehr T7-Promotorsequenz (Sequenz in der Materialliste zur Verfügung gestellt) zu sein,als Matrize für dsRNA-Synthese eingesetzt. <ol><li> Vier PCR-Reaktionen, die jeweils 50 ul, enthaltend 100 ng Template-DNA, 25 &amp; mgr; M von jedem Primer, geeignete Puffer und Polymerase eingestellt. Stellen Sie den PCR-Protokoll auf dem Thermocycler nach der Polymerase Herstellerprotokoll. </li><li> Pool und sauber vier PCR-Reaktionen unter Verwendung eines PCR bereinigen Kit gemäß Herstellerprotokoll. Bewahren Sie die saubere Vorlage bei -20 ° C. </li></ol></li><li> Bereiten doppelsträngige RNA (dsRNA) aus Vorlage unter Verwendung eines T7-RNA-Transkription-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Erwarten Sie ~ 5-15 mg / ml Konzentration der dsRNA. Speichern dsRNA bei -20 ° C. </li><li> Um Klp61F mit dsRNA Knockdown, ermöglichen S2-Zellen, die Eg5-mCherry bei 25% Konfluenz auf halb haften an den Boden eines 35 mm-Gewebekulturschale für 1 h. </li><li> Entfernen Sie die Medien aus den Schalen und fügen Sie 5 ug dsRNA gegen Klp61F (Drosophila Kinesin-5) in 1 ml Serum-freien Schneider verdünnt &quot;s Medien. </li><li> Inkubation bei RT für 1 h, dann fügen Sie 1 ml Schneider-Medien mit 10% FBS. Inkubiere Zellen bei 25 ° C. </li><li> 24 h nach der dsRNA Behandlung induziert die Expression von Eg5-mCherry durch Zugabe von CuSO 4 bis zu einer Endkonzentration von 500 uM. Zellen inkubieren bei 25 ° C für weitere 24 Stunden. </li></ol> 3. Live Cell Imaging <ol><li> Legen Sie eine 22 mm x 22 mm Concanavalin A beschichtete Deckglas in eine saubere 35-mm-Gewebekulturschale. </li><li> Samen 500 ul der Zellen, die mit dsRNA behandelt worden und induzierte O / N auf die Concanavalin A beschichteten Deckglas und ihnen erlauben, für etwa 1 Stunde zu halten. </li><li> Montieren Sie die Deckgläschen in eine Rose Kammer (oder andere geeignete Behälter) für die Bildgebung. </li><li> Finden mitotischen Zellen, die sowohl Eg5-mCherry und GFP-α-Tubulin. HINWEIS: Mitotische Zellen nur GFP-α-Tubulin-ausdrücken sollte monopolare Spindeln seit Klp61F, die für Spindel Bipolarität erforderlich sind, wird zu Boden geworfen 10,13. </li><li> Sammeln Sie Zeitrafferbilder von bipolarer Spindeln (zB 1 Frame pro Minute) in Zellen, die sowohl Eg5-mCherry und GFP-α-Tubulin. </li><li> Während Bildgebung, entfernen Sie die Medien aus dem Rosenkammer, und ersetzen Sie es mit Schneider-Medium, das 1 &amp; mgr; M STLC über 3 aufeinanderfolgende Medienaustausch (~ 5 ml insgesamt) in die Kammer, um Spindel Zusammenbruch zu visualisieren. </li><li> Um das Medikament Auswaschen und umgekehrt die Spindel Kollaps, entfernen Sie vorsichtig die STLC haltigen Medien aus dem Rosenkammer, und waschen in Schneiders Medien 4x (6-8 ml gesamt) vor dem Nachfüllen der Rose Kammer ein letztes Mal durch frische Medien. Weiter Bildgebung. </li></ol> 4. Error Correction Assay <ol><li> Legen Sie eine 22 mm x 22 mm Concanavalin A beschichtete Deckgläser in saubere 35-mm-Gewebekulturschalen. </li><li> Samen 500 ul Zellen, die mit Klp61F dsRNA auf die Concanavalin A beschichteten Deckglas behandelt wurden und es ihnen zu haften. </li><li> Nachdem die Zellen ADHERed, fügen Sie 1,5 ml Schneider Medien zu jeder Schale, um das endgültige Volumen auf 2 ml zu bringen. </li><li> Um Zellen zu verhaften in der Mitose, fügen MG132 bis zu einer Endkonzentration von 10 uM zu jedem der Gerichte, und Inkubation für 1 Std. </li><li> 1 &amp; mgr; M STLC und Inkubation für 1 Stunde, damit Monopole zu bilden. </li><li> Auswaschen des STLC durch Spülen Deck 3x mit 2 ml frischem Schneiders Medien jedes Mal. </li><li> Deckgläser mit Schneiders Medien inkubieren zusätzlich zu pharmakologischen Medikamente (zB Aurora-Kinase-Inhibitoren) oder DMSO als Kontrolle. Hinweis: Inhibitorkonzentrationen variieren und ordnungsgemäße Endkonzentrationen muss vom Versuchsleiter bestimmt werden. Stammlösungen werden in der Regel so getroffen, daß der Inhibitor, verdünnt 1: 1.000 in Medien. In diesem Fall wird eine 1: 1000 Verdünnung dient DMSO (oder geeigneten Lösemittel), wie der Fahrzeugsteuerung. Wir verwenden den Aurora-B-Hemmstoff Binucleine 2 bei einer Endkonzentration von 40 uM. </li><li> Fixieren Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten to beobachten, das Fortschreiten der bipolaren Spindelbildung und Kinetochor Befestigungsstaaten zu beurteilen. Reparieren: <ol><li> Schnell spülen Sie die Deckgläser mit 2 ml 1x BRB-80. </li><li> Fixieren Zellen durch Zugabe von 2 ml von 10% igem Paraformaldehyd in 1x BRB-80 für 10 min verdünnt. Pipet Para sorgfältig in einer chemischen Abzugshaube. </li><li> Permeabilisieren Zellen mit 2 ml 1X PBS + 1% Triton-X für 8 min. </li><li> Wasch gleitet 3mal mit 2 ml 1X PBS + 0,1% Triton-X. </li><li> Überdeckgläser Zell-Seite nach oben auf ein Blatt Parafilm (verwenden Sie eine Markierung, um Parafilm beschriften angemessen, den Überblick über die Objektträger zu halten) in einer 150 mm Petrischale. </li><li> Decken Sie die Deckgläser mit 150 ul gekocht Eselserum (BDS) und Inkubation bei RT für 1 h auf nicht-spezifischen Antikörper zu blockieren verbindlich. Hinweis: Hier kann die Fixierung Protokoll angehalten, um zu einem späteren Zeitpunkt fortgesetzt werden kann. Deckgläser in einer feuchten Kammer bei 4 ° C für bis zu 24 Stunden gelagert werden. Um den Feuchtigkeitskammer stellen, säumen den Rand eines 150 mm-Schalemit einem feuchten Labortuch geben und mit der Petrischale Deckel. </li><li> Entfernen Block und inkubiere die Deckgläser für 1 h bei RT mit 150 &amp; mgr; l primärer Antikörper in geeigneter Weise in BDS verdünnt, um Haftstellen und Mikrotubuli zu Endkonzentrationen von 2 ug / ml-Abstrichen (oder entsprechend den Empfehlungen des Herstellers) und 1 &amp; mgr; g / ml . Hinweis: Hier kann die Fixierung Protokoll angehalten, um zu einem späteren Zeitpunkt fortgesetzt werden kann. Deckgläser in einer feuchten Kammer bei 4 ° C für bis zu 24 Stunden gelagert werden. </li><li> Waschdeckgläser 3x mit 500 ul 1x PBS + 0,1% Triton-X. </li><li> Deck Inkubieren für 30-60 min bei RT mit den entsprechenden fluorophorkonjugierten Sekundärantikörper in BDS verdünnt. </li><li> Waschdeckgläser 3x mit 500 ul 1x PBS + 0,1% Triton-X. </li><li> Inkubieren Deckgläser mit 150 ul BDS, enthaltend 1 ug / ml DAPI Endkonzentration 5 min. </li><li> Waschen Sie Deckgläschen 2x mit 1x PBS + 0,1% Triton-X, und montieren coverslips Zellenseite nach unten auf eine 3x1 &quot;Objektträger mit 8 ul Montage Medien. Malen Sie die Ecken mit Nagellack, um die Deckgläser auf Objektträger zu immobilisieren. </li></ol></li><li> Bildzellen mit bipolarer Spindeln, die zum Ausdruck bringen Eg5-mCherry werden. Werfen Sie einen Z-Serie, bestehend aus 30 Flugzeugen bei 0,2 &amp; mgr; m Abständen in allen Kanälen mit einem 100x Objektiv. Sorgfältig zu analysieren, die Kinetochoren und Mikrotubuli, die Befestigungszustände (biorientierte oder syntelic Anhänge) zu bestimmen. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Visualisierung von Fehlerkorrektur ist eine wertvolle Technik, um die Schritte in diesem wichtigen und komplexen zellulären Prozess beteiligt zu studieren. Um dies zu tun, werden fehlerhafte Anhänge mit reversible Inhibitoren erzeugt und die Fehlerkorrektur nach Auswaschen des Arzneimittels beobachtet. Dieser Test wurde ursprünglich unter Verwendung von Säugetier-Gewebekulturzellen 5 entwickelt. Jedoch ist die Anwesenheit einer großen Anzahl von Haftstellen in vielen Modellsäugetierzelltypen stellt eine Herausforderung bei der Beobachtung einzelner Fehlerkorrekturereignisse. Drosophila S2 Zellen besitzen so wenige wie 4 Paare von Haftstellen, so dass sie eine mehr bevorzugte Zelllinie zur Beobachtung der Fehlerkorrektur. Jedoch ist ein großer Nachteil, dass viele Inhibitoren unwirksam Drosophila S2 Zellen. Somit stellt die Fähigkeit, eine humanisierte Drosophila S2 Zelllinie zu generieren, die menschliche Kinesin-5 ein wertvolles Werkzeug, um eine Fehlerkorrektur zu studieren. Obwohl Drosophila S2 Zellen sein kannbessere Zelllinie, um eine Fehlerkorrektur zu studieren, die mehrere Schritte bei der Erlangung der Zelllinie und umzuwerfen essentielle Gene beteiligt wirft einige Herausforderungen dieser Technik. Zum Beispiel, kann die Transfektionseffizienz ziemlich niedrig sein. Bei weniger als 20% der Zellen exprimieren die Eg5-mCherry sollte die Transfektion wiederholt werden, wie der Auswahlvorgang dauert länger. Auch kann der Anteil der Zellen, die sowohl fluoreszierende Proteine ​​mit der Zeit ab. Dies kann durch die Spaltung von Zellen in Gegenwart von Blasticidin S HCl und Hygromycin B, um Zellen, die Eg5-mCherry und GFP-α-Tubulin jeweils auszuwählen, überwunden werden. Es ist auch wichtig zu beachten, dass Drosophila S2 Zellen Orthologe viele humane Proteine ​​und; daher ist es wichtig, die Zuschlagsbedingungen für die endogenen Proteine ​​zu optimieren. Zuschlags optimalen Bedingungen können in der Menge von dsRNA und die Behandlungsdauer variieren. Angesichts der Entstehung und rasche Verbesserung CRISPR-Cas9 Technologies 15-17, Erzeugung eines Drosophila-Zelllinie mit der Klp61F Gens durch menschliche Eg5 ersetzt präsentiert eine leistungsfähige Alternative, die die Grenzen der Transfektion und Zuschlags Ansatz zu überwinden wäre. Unsere Arbeit zeigt, dass Fly-zu-Mensch-Gen-Ersatz sollte ein gangbarer Weg ist in diesem Fall, obwohl die notwendigen Reagenzien, um so in Drosophila S2-Zellen tun, werden derzeit entwickelt. Dieses Verfahren ist nicht auf Eg5 beschränkt, sondern kann angewendet, um die Funktion anderer Proteine ​​von Interesse zu untersuchen. Bei der Verwendung von Inhibitoren, die zuvor festgelegt wurden unwirksam in Drosophila S2-Zellen zu sein, kann dieses Protokoll geändert werden, um die unmittelbare Wirkung von Inhibitoren in lebenden Zellen, ohne Bedenken bezüglich vorbei Effekte zu studieren. Die Verwendung dieses Protokolls produziert Zelllinie könnte auch im Hochdurchsatz-Screening verwendet werden analysiert, um potenzielle Medikamente gegen Proteine, die in Fehlerkorrektur beteiligt sind.

Equal Segregation des Genoms während der Zellteilung erfordert korrekte Wechselwirkungen zwischen den DNA repliziert und Spindel Mikrotubuli. Mikrotubuli physisch Chromosomen zu interagieren durch ein Ensemble von Proteinen, die an Zentromeren als Kinetochor 1 bekannt versammelt. Korrekte Verteilung der Chromosomen erfordert Schwester Kinetochore sind biorientierte, wobei jede Schwester mit Mikrotubuli von gegenüberliegenden Spindelpole Ursprung verbunden. Kinetochor Mikrotubuli (kt-MT) Anlagen, die in der biorientierten Konformation nicht schnell und effizient destabilisiert, die Gelegenheit zu Biorientierung in einem Prozess als Fehlerkorrektur bekannt zu etablieren ist. Eine Fehlerkorrektur-Assay, die zuvor in Säugetierzellen hergestellt wurde 5 erfordert die Montage monopolare Spindeln mit umkehrbarer niedermolekularen Inhibitoren gegen Eg5 (Kinesin-5). Die medikamentöse Behandlung erzeugt eine Vielzahl von fehlerhaften syntelic Anhänge, in denen Both Schwester Kinetochoren zu befestigen, um die gleiche Spindel-Pol. Eine nachfolgende Auswaschung des Wirkstoffs ermöglicht die Visualisierung der dem Fehlerkorrekturverfahren. Die Fehlerkorrektur-Assay kann in Anwesenheit von Kleinmolekül-Inhibitoren oder Niederschlägen durchgeführt, um den Beitrag von Kandidatenproteinen auf die Korrektur fehlerhafter kt-MT-Anhänge zu untersuchen. Die Fähigkeit zur Fehlerkorrektur in lebenden Zellen sichtbar zu machen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die molekularen Mechanismen in diesem komplexen Prozess beteiligten weiter zu verstehen. Die große Anzahl von in den meisten Zelllinien vorhanden Chromosomen stellt jedoch eine Herausforderung bei der Beobachtung einzelner kt-MT-Anhänge. Drosophila S2 Zellen wäre ideal für die Anwendung des Fehlerkorrektur Assay, da sie so wenig wie 4 Chromosomen 6, aber kleine Molekülinhibitoren enthalten von Kinesin-5, wie etwa S-Trityl-L-cystein (STLC) und Monastrol 7-9 nicht beeinträchtigen Spindelanordnung oder Kinesin-5 Motorik in Drosophila-Zellen. Deshalb Gattungented ein Drosophila S2-Zelllinie menschlichen Kinesin-5 unter einem induzierbaren Promotor, die empfindlich auf Kinesin-5-Hemmer ist, zum Ausdruck bringen. Dieses Protokoll beschreibt, wie die endogenen Drosophila Kinesin-5-Homologen, Klp61F Knockdown, und verwenden Sie diese Zelllinie in der zellbasierten Assay-Fehlerkorrektur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="826">
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:221px;">Effectine Transfection Reagent</td>
			<td style="width:184px;">Qiagen</td>
			<td style="width:167px;">301425</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:221px;">Klp61F cDNA</td>
			<td style="width:184px;">Drosophila Genomic Resource Center</td>
			<td style="width:167px;">13690</td>
			<td style="width:255px;">Gene Name LD15641</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Schneider&#8217;s Media</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:167px;">21720-024</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:221px;">Fetal Bovine Serum, certified</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:167px;">10082-147</td>
			<td style="width:255px;">Heat Inactivated, US origin</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:221px;">Copper (II) Sulfate (CuSO4)</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">C8027-500G</td>
			<td style="width:255px;">500mM stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">S-trityl-l-cysteine</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">164739-5G</td>
			<td style="width:255px;">1mM stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Blasticidin HCl</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:167px;">R21001</td>
			<td style="width:255px;">5mg/ml stock in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:167px;">10687010</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:221px;">T7 Large scale RNA Production System</td>
			<td style="width:184px;">Promega</td>
			<td style="width:167px;">P1320</td>
			<td style="width:255px;">The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15&#181;g/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:221px;">Klp61F RNAi F primer</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:255px;">TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:221px;">Klp61F RNAi R primer</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:255px;">TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">PCR clean-up kit</td>
			<td style="width:184px;">Mo Bio Laboratories, Inc</td>
			<td style="width:167px;">1250</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:221px;">Concanavalin A</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">C5275</td>
			<td style="width:255px;">0.5mg/ml solution made by dissolving in 1xPBS.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:221px;">Boiled Donkey Serum</td>
			<td style="width:184px;">Jackson ImmunoResearch Labs</td>
			<td style="width:167px;">017-000-121</td>
			<td style="width:255px;">5% stock solution in 1X PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:221px;">Mounting Media</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:255px;">20mM Tris pH 8.0,&#160; 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">1x BRB-80</td>
			<td dir="LTR" style="width:184px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:255px;">80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">White Light Source</td>
			<td>Lumencor Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">ET EGFP Filter Cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td align="right">49002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">DSRed Filter Cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td align="right">49005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">anti-NDC80 antibody&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made by the Maresca Lab</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">DM1&#945; (anti-&#945;-tubulin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">anti-CID antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab10887</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating a &#34;humanized&#34; drosophila s2 cell line sensitive to pharmacological inhibition of kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.

Klp61F erforderlich ist, um bipolare Spindeln zu bilden. Der menschliche Kinesin-5, Eg5, kann die Funktion des Klp61F in Drosophila S2-Zellen (1A und D) zu retten. Nach Zugabe des Kinesin-5-Inhibitor (STLC), Mikrotubuli-assoziierten Niveaus des Kraftabfall (1B und E) und die Spindel zusammenbricht, was in einer Monopol (1C und F) in Zellen, denen endogene Klp61F bei erfolgreicher RNAi (Supplemental Film 1). Es ist bemerkenswert, dass die bipolare Spindeln bei Zugabe von STLC in den humanisierten S2-Zellen zusammenbrechen, weil Kinesin-5-Aktivität ist nicht verpflichtet, Spindel Bipolarität in menschlichen Zellen zu erhalten. Diese interessante Diskrepanz kann eine Folge der Unterschiede in inter Mikrotubuli Überschneidungen und / oder Stabilität in den beiden Modellsystemen 14 zu sein. Kinesin-5-Hemmung (2A und E) können reve werden<html> durch Auswaschen des Arzneimittels und die Wiederherstellung einer bipolaren Spindel RSED kann im Laufe der Zeit folgen. Bei Entfernung des Inhibitors (2B und F) wieder assoziierten Eg5-mCherry mit den Mikrotubuli als bipolarer Spindel montiert (2C und G), und die Zellen können in einer bipolaren Anaphase (2D und H, Supplemental Film 2 Fortschritt ). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die Zugabe von 1 uM STLC führt zu monopolaren Spindeln in Drosophila S2 Zellen. Repräsentative Bilder von Zeitraffer Bildgebung eines Drosophila S2 exprimierenden Zelle Eg5-mCherry (AC) und GFP-α-Tubulin (DF) während der Zugabe von 1 &amp; mgr; M STLC. Die Eg5-Inhibitor wurde nach 3 min zugegeben. Maßstabsbalken = 5 um. Timestamp = min: sec.<html> w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig2.jpg" /> Abbildung 2. Eine bipolare Spindel Reformen beim Entfernen STLC. Repräsentative Bilder von Zeitraffer-Bildgebung eines Drosophila 2 Zelle, die Eg5-mCherry (AD) und GFP-α-Tubulin (EH) während eines STLC Auswaschen Experiment. STLC wurde bei 5 min gewaschen. Eine bipolare Spindel Reformen innerhalb 1 Stunde zur Entfernung des STLC. Maßstabsbalken = 5 um. Zeitstempel: min: sec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov1.jpg" /> ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; STADT Film 1. (Rechtsklick zum Download). Widefield-Fluoreszenz-Bildgebung eines repräsentativen Beispiels eines Drosophila S2 Zelle, die Eg5-mCherry ( links) und GFP-α-Tubulin (rechts). 1 uM STLC wurde auf 2 min zugegeben und die Spindel bildet einen Monopol innerhalb 10 min nach Zugabe des Inhibitors. Bilder wurden alle 1 min gewonnen und spielte bei einer Rate von 10 Rahmen pro Sekunde. Maßstabsbalken = 5 um. <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/washout.mov" target="_blank">STADT Film 2 (Rechtsklick zum Download).</a> Widefield-Fluoreszenz-Bildgebung eines repräsentativen Beispiels eines Drosophila S2 Zelle, die Eg5-mCherry (links) und GFP-α-Tubulin (rechts). Medien, die 1 &amp; mgr; M STLC wurde entfernt undin 5 min gespült. Eine bipolare Spindel Reformen innerhalb 1 Stunde zur Entfernung des Inhibitors. Bilder wurden alle 1 min erworben und spielte mit einer Rate von 10 Bildern pro Sekunde. Maßstabsbalken = 5 um.

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Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Erzeugen eines &quot;humanisierte&quot;<em&gt; Drosophila</em&gt; S2-Zelllinie Sensitive pharmakologische Hemmung der Kinesin-5

This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

7.2K Aufrufe.  University of Massachusetts, Amherst. This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined. 

Serie: Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Ein Gradient-Erzeugung Mikrofluidikvorrichtung für Zellbiologie

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Forschung

Biologie

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Neurocircuit Assays für Anfällen bei Epilepsie Mutanten Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based medicine and/or its carrier may elicit cellular toxicity. For assessment of such cytotoxicity, a common methodology is largely dependent upon utilization of the 3-(4, 5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay which has been widely used as a colorimetric approach based on the activity of mitochondrial dehydrogenase enzymes in cells. In this current investigation, MCF-7 cells were inoculated in 96-well plate and at 50% confluency they were treated with different nanopolyplexes and subjected to MTT assay after 24 hours. Water soluble yellow MTT is metabolized by the metabolically active cells to the water insoluble purple formazan, which is further dissolved in dimethylsulfoxide and Sornson s buffer pH 10.5. The resultant product can be quantified by spectrophotometry using a plate reader at 570 nm.

The MTT assay is an easy and reproducible colorimetric assay for evaluation of cell viability based on reduction of yellow MTT and production of water insoluble purple formazan. Here, the viability of MCF-7 cells upon treatment of nanogenomedicine has been evaluated.

Zelluläre Toxizität von Nanogenomedicine in MCF-7 Zelllinie: MTT-Assay

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Vorbereitung der Drosophila S2-Zellen für Lichtmikroskopie

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

Pharmakologische und Functional genetischen Tests zu manipulieren Regeneration der Planarien Dugesia japonica</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This methods paper describes how to isolate mid-to-late stage follicles (Stage 10B-14) and utilize them to provide new insights into the molecular and morphologic events occurring during tight windows of developmental time. Isolated follicles can be used for a variety of experimental techniques, including in vitro development assays, live imaging, mRNA expression analysis and western blot analysis of proteins. Follicles at Stage 10B (S10B) or later will complete development in culture; this allows one to combine genetic or pharmacologic perturbations with in vitro development to define the effects of such manipulations on the processes occurring during specific periods of development. Additionally, because these follicles develop in culture, they are ideally suited for live imaging studies, which often reveal new mechanisms that mediate morphological events. Isolated follicles can also be used for molecular analyses. For example, changes in gene expression that result from genetic perturbations can be defined for specific developmental windows. Additionally, protein level, stability, and/or posttranslational modification state during a particular stage of follicle development can be examined through western blot analyses. Thus, stage-specific isolation of Drosophila follicles provides a rich source of information into widely conserved processes of development and morphogenesis.

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Stage-specific isolation of mid-to-late Drosophila follicles is useful for a variety of purposes. Such follicles develop in culture, which allows for genetic and/or pharmacologic manipulations to be coupled with in vitro development assays and live imaging. Additionally, follicles can be used for molecular studies, such as isolating mRNA and protein.

Das Utility von Stage-spezifischen Mid-zu-spät<em&gt; Drosophila</em&gt; Follikel Isolation

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing myocardial infarction (MI) is largely driven by detecting cardiac-specific proteins in patients' serum or plasma as an indicator of myocardial injury. Having recently shown that cardiac myosin binding protein-C (cMyBP-C) is detectable in the serum after MI, we have proposed it as a potential biomarker for MI. Biomarkers are typically detected by traditional sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. However, this technique requires a large sample volume, has a small dynamic range, and can measure only one protein at a time.	
Here we show a multiplex immunoassay in which three cardiac proteins can be measured simultaneously with high sensitivity. Measuring cMyBP-C in uniplex or together with creatine kinase MB and cardiac troponin I showed comparable sensitivity. This technique uses the Meso Scale Discovery (MSD) method of multiplexing in a 96-well plate combined with electrochemiluminescence for detection. While only small sample volumes are required, high sensitivity and a large dynamic range are achieved. Using this technique, we measured cMyBP-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I levels in serum samples from 16 subjects with MI and compared the results with 16 control subjects. We were able to detect all three markers in these samples and found all three biomarkers to be increased after MI. This technique is, therefore, suitable for the sensitive detection of cardiac biomarkers in serum samples.

Measuring biomarkers in complex biological samples is increasingly guiding clinical decision-making. We describe a highly sensitive method to simultaneously measure cardiac myosin binding protein-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I in serum samples from subjects with myocardial infarction and healthy control subjects.

Eine empfindliche und spezifische Quantifizierung Methode zur Bestimmung der Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C durch Elektrochemilumineszenz Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized microtubules. Organelles move along these processes by microtubule motors. Easy maintenance, high sensitivity to RNAi-mediated protein knock-down and efficient procedure for creating stable cell lines make Drosophila S2 cells an ideal model system to study cargo transport by live imaging. The results obtained with S2 cells can be further applied to a more physiologically relevant system: axonal transport in primary neurons cultured from dissociated Drosophila embryos. Cultured neurons grow long neurites filled with bundled microtubules, very similar to S2 processes. Like in S2 cells, organelles in cultured neurons can be visualized by either organelle-specific fluorescent dyes or by using fluorescent organelle markers encoded by DNA injected into early embryos or expressed in transgenic flies. Therefore, organelle transport can be easily recorded in neurons cultured on glass coverslips using living imaging. Here we describe procedures for culturing and visualizing cargo transport in Drosophila S2 cells and primary neurons. We believe that these protocols make both systems accessible for labs studying cargo transport.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells and cultured neurons are great systems for imaging of motor-driven organelle transport in vivo. Here we describe detailed protocols for culturing both cell types, their imaging and analysis of transport.

Organell-Transport in kultivierten<em&gt; Drosophila</em&gt; Zellen: S2-Zelllinie und primären Neuronen.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

Eine Strategie für einfühlsam, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes differentiation from a stem cell population, mitotic amplification, and meiosis. In addition, post-meiotic germ cells undergo a dramatic morphological reshaping process as well as a global epigenetic reconfiguration of the germ line chromatin&#8212;the histone-to-protamine switch.
Studying the role of a protein in post-meiotic spermatogenesis using mutagenesis or other genetic tools is often impeded by essential embryonic, pre-meiotic, or meiotic functions of the protein under investigation. The post-meiotic phenotype of a mutant of such a protein could be obscured through an earlier developmental block, or the interpretation of the phenotype could be complicated. The model organism Drosophila melanogaster offers a bypass to this problem: intact testes and even cysts of germ cells dissected from early pupae are able to develop ex vivo in culture medium. Making use of such cultures allows microscopic imaging of living germ cells in testes and of germ-line cysts. Importantly, the cultivated testes and germ cells also become accessible to pharmacological inhibitors, thereby permitting manipulation of enzymatic functions during spermatogenesis, including post-meiotic stages.
The protocol presented describes how to dissect and cultivate pupal testes and germ-line cysts. Information on the development of pupal testes and culture conditions are provided alongside microscope imaging data of live testes and germ-line cysts in culture. We also describe a pharmacological assay to study post-meiotic spermatogenesis, exemplified by an assay targeting the histone-to-protamine switch using the histone acetyltransferase inhibitor anacardic acid. In principle, this cultivation method could be adapted to address many other research questions in pre- and post-meiotic spermatogenesis.

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Ex-vivo-Kultur von Drosophila Pupal Hoden und Single männlichen Keim Online-Zysten: Dissection, Imaging und pharmakologische Behandlung

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...