ويدعم التمويل لتطوير البروتوكول الحالي بشكل خاص &quot;الهدف لخطة جامعة أعلى&quot; من جامعة تايوان الوطنية، تايوان (منحة ID-104R350144)، وكذلك وزارة العلوم والتكنولوجيا في تايوان (ID المنحة: MOST 104 -2313-B-002-039-MY3). نخص بالشكر مركز للتكنولوجيا الحيوية من جامعة تايوان الوطنية لتوفير غرفة الحيوان والفضاء مختبر لدراسة الحالية.

ملاحظة: هذا الإجراء هو تعديل لبروتوكول ثقافة نموذج الدجاج التي وضعتها باور وآخرون عام 2013 وناكازاوا وآخرون، 2011. 2،9. 1. إعداد صحي الجنينية يوم 5 أجنة من السمان الياباني <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع 1 ذكر و 3 إناث ناضجة جنسيا السمان الياباني معا في نفس القفص. تغذية العرض والمياه libitum الإعلانية. ضبط الضوء في الغرفة الحيوان إلى 14 ساعة من الضوء و 10 ساعة من الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع البويضات المخصبة في أكياس بلاستيكية كل يوم في فترة ما بعد الظهر والاحتفاظ بها في 16 درجة مئوية الثلاجة على تأخير معدل نمو الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد جمع عدد كاف من البيض خلال فترة أسبوعين، واحتضان البويضة الملقحة في الحاضنة 37 درجة مئوية مع التهوية الجيدة لمدة خمسة أيام. </li></ol> 2. إعداد متوسطة بصل وغسل حلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام DMEM / F-12 متوسطة (معدلة لدرجة الحموضة 7.2) باعتبارها وسيلة النمو، ومكملا لهمع 10٪ جديد مصل العجل المولود ([نبكس])، و 1٪ القلم بكتيريا Ampho. الحل (PSA، البنسلين، 10 5 وحدات / L، ستربتومايسين، و 100 ملغم / لتر، الامفوتريسين، 0.25 ملغ / لتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل في تركيز 10X لأغراض التخزين؛ استخدام الحل برنامج تلفزيوني 1X (التي تحتوي على كلوريد الصوديوم، 137.93 ملي، بوكل، 2.667 مم، KH 2 PO 4، 1،471 ملم، نا 2 هبو 4 -7H 2 O، 8.06 مم، ضبط لدرجة الحموضة 7.2) لغسل وترطيب غشاء الكيس المحي في حين فصل الأديم من صفار البيض والزلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام DMEM المتوسطة (معدلة لدرجة الحموضة 7.2) لاعادة تعليق الكريات الأديم. </li></ol> 3. جمع من EECS الابتدائية من YSMs السمان اليابانية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان البيض التي تم جمعها لمدة 5 أيام (الخطوة 1.3). فحص البيض من قبل كاندلر البيض لتأكيد التطور الجنيني الطبيعي. ملاحظة: في يوم الجنينية 5، حدود YSM الأديم المتوسط ​​واضح جدا و3 طبقات الجنينية هي أقل مرتبطة بإحكام معا، لذلك فمن السهل أن أوبتين الأديم. فقط استخدام البيض تظهر تطوير الدورة الدموية الشعرية العادية للمجموعات YSM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف قشر البيض بعناية باستخدام المياه العذبة و 75٪ من الإيثانول. فتح قشر البيض من موقع خلية الهواء عن طريق زوج من مقص، بلطف قشر خارج وجمع YSM كله بواسطة ملقط ومكان في صحن الثقافة 10 سم مملوءة 37 ° C برنامج تلفزيوني 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام زوج من مقص إزالة الجنين، صفار وبياض البيض، وبلطف غسل YSM مع برنامج تلفزيوني 1X ثلاث مرات ووضع YSM في حل برنامج تلفزيوني في طبق ثقافة 10 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط ومقص لإزالة الأديم الظاهر من YSM. 2 استخدام ملقط، واحدة لاعتقادا راسخا طبقة الخلايا الأديم الباطن، والآخر لعقد الأديم المتوسط ​​الشعرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح، مزق وفصل الأديم من حافة الأديم المتوسط ​​في الاتجاه نحو الجنين. جمع الأديم ضوء أصفر في 50 مل أنابيب الطرد المركزي باستخدام قطارة والمكان في 15 مل من متوسط ​​النمو في 37 درجة مئوية واتحمام إيه حتى يتم الانتهاء من جميع المجموعات الأنسجة. </li></ol> 4. الهضم من الأديم شرائح من كولاجيناز الهضم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطازج حل 6.5 وحدة من النوع الرابع كولاجيناز في 10 مل من DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي ال 50 مل أنابيب (3.4) في 130 x ج لمدة 3 دقائق على RT. نضح المتوسطة ووضع كل الأديم في طبق ثقافة 6 سم باستخدام ماصة. إضافة 1 مل من محلول كولاجيناز إلى هذا الطبق الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شريحة الأديم تم جمعها من 2 الأجنة السمان مع زوج من مقص منحني حتى حجم كل شريحة حوالي 2-3 ملم. استخدام قطارة، وجمع كل شرائح في أنبوب 50 مل الطرد المركزي جنبا إلى جنب مع 9 مل من محلول كولاجيناز جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هضم الأنسجة مع كولاجيناز لمدة 30 دقيقة في 37 ° C حمام الماء تهتز في 175 دورة في الدقيقة. وتستخدم هذه الهضم الجزئي مع كولاجيناز لتحسين تكاثر الخلايا يزدرع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 130 x ج لمدة 3 دقائق على RT وإزالة بلطف الكسر طاف باستخدام ماصة. غسل بيليه معلق في 20 مل DMEM وإزالة جزء طاف بعد الطرد المركزي 130 x ج لمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه مع 12 مل من متوسط ​​النمو (DMEM / F12 مع 10٪ [نبكس] و 1٪ PSA) والبذور بلطف وعلى قدم المساواة في لوحة 24-جيدا (كل حل الخلية جيدا مع 500 ميكرولتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان إإكسبلنتس الأنسجة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 في الهواء لمدة 2 أيام للسماح للخلايا لتتكاثر من الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 2 أيام أخرى وتميز لبقاء الخلية عن طريق بروتوكول الفحص بقاء الخلية 15 ملاحظة: الخلايا الحية الحفاظ على البيئة والحد داخل العصارة الخلوية. ريسازورين، العنصر النشط، هو غير سامة، وخلية مجمع نفاذية هذا هو الازرق في اللون وتقريبا غير الفلورسنت. عندما تضاف إلى مزارع الخلايا، ريسازورين هو انخفاض لresorufin في العصارة الخلوية بواسطة الإنزيمات الميتوكوندريا. Resorufin هو أحمر اللون والفلورية للغاية. تحويل خلايا قابلة للحياة باستمرار ريسازورين إلى resorufin، increasing مضان العام واللون من مستنبت الخلايا المحيطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء الأديم الباطن الخلايا الظهارية الحمض النووي الريبي مجموع العزلة، عكس النسخ والكمي في الوقت الحقيقي PCR التعبير مرنا علامة الجين كما هو موضح. 16،17 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام عكس PCR الناسخ للكشف عن SOAT1 مرنا (بمعنى: 5&#39;-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 &#39;؛ العقاقير: 5&#39;-ATCTGCACGTGACATGACCA-3&#39;؛ PCR المنتج = 168 سنة مضت) كعلامة محددة لخلايا الجماعة الاقتصادية الأوروبية. استخدام بيتا أكتين مرنا (بمعنى: 5&#39;- TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 &#39;؛ العقاقير: 5&#39;- GTGATGGACTCTGGTGATGG-3&#39;؛ المنتج PCR = 151 سنة مضت) باسم الجينات التدبير المنزلي والرقابة الداخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام هلام الكهربائي للكشف عن حجم المنتج من RT-QPCR. إعداد 1٪ agarose هلام، ومزيج 10 ميكرولتر QPCR المنتج مع 2 ميكرولتر صبغة تحميل. تحميل 10 ميكرولتر الخليط في كل بئر في هلام الاغاروز 1٪، وتشغيل الجل وذلك 100V لمدة 30 دقيقة. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+white+proteins+and+their+potential+use+in+food+processing+or+as+nutraceutical+and+pharmaceutical+agents--a+review.">Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review.</a> Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).</li><li>Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+chicken+yolk+sac+acquires+nutrient+transport+competence+by+an+orchestrated+differentiation+process+of+its+endodermal+epithelial+cells.">The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells.</a> J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).</li><li>Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+concentration+of+different+lipid+classes+during+late+embryonic+development+in+a+randombred+turkey+population+and+a+subline+selected+for+increased+body+weight+at+sixteen+weeks+of+age.">The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age.</a> Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).</li><li>Ding, S. T., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+expression+of+acyl-coenzyme+A:+cholesterol+acyltransferase+in+the+yolk+sac+membrane,+liver,+and+intestine+of+developing+embryos+and+posthatch+turkeys.">The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys.</a> Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).</li><li>Ding, S. T., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ontogeny+of+fatty+acid-binding+protein+in+turkey+(Meleagridis+gallopavo)+intestine+and+yolk+sac+membrane+during+embryonic+and+early+posthatch+development.">The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development.</a> Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).</li><li>Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Participation+of+endodermal+epithelial+cells+on+the+synthesis+of+plasma+LDL+and+HDL+in+the+chick+yolk+sac.">Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac.</a> Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).</li><li>Mobbs, I. G., McMillan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+endodermal+epithelium+of+the+chick+yolk+sac+during+early+stages+of+development.">Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development.</a> Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).</li><li>Mobbs, I. G., McMillan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+across+endodermal+cells+of+the+chick+yolk+sac+during+early+stages+of+development.">Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development.</a> Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).</li><li>Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yolk+sac+endoderm+is+the+major+source+of+serum+proteins+and+lipids+and+is+involved+in+the+regulation+of+vascular+integrity+in+early+chick+development.">Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development.</a> Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).</li><li>Noble, R. C., Cocchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+and+the+neonatal+chicken.">Lipid metabolism and the neonatal chicken.</a> Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).</li><li>Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+esterification+of+cholesterol+in+the+yolk+sac+membrane+of+the+chick+embryo.">The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo.</a> Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).</li><li>Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+of+nutrient+transporters+and+digestive+enzymes+in+the+yolk+sac+membrane+and+small+intestine+of+the+developing+embryonic+chick.">Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick.</a> Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).</li><li>Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+Induction+of+VLDLy+Assembly+in+Egg-Laying+Hens.">Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens.</a> J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).</li><li>Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+consumption+of+yolk+granules+during+the+development+of+quail+embryos.">Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos.</a> Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. , (2008).</li><li>Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Amelioration+of+High-Fat+Diet-Induced+Fatty+Liver+by+Docosahexaenoic+Acid+and+Lysine+Supplementations.">Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations.</a> Biomed Res Int. 2014 (1), 310981 (2014).</li><li>Lin, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin+receptor+1+regulates+bone+formation+and+osteoblast+differentiation+by+GSK-3&#946;/&#946;-Catenin+signaling+in+mice.">Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3&#946;/&#946;-Catenin signaling in mice.</a> Bone. 64, 147-154 (2014).</li></ol>

There is no competing financial interests or other conflicts of interest. We did not get any funding from any private company.

لأن النظام الثقافة السابق سوى نجاح محدود، هناك حاجة إلى نظام ثقافة أفضل. اليابانية الأديم السمان YSM يتطلب العلاج مع الإنزيمات المحللة للبروتين مثل كولاجيناز لتخفيف تقاطعات خلية خلية لتحقيق أداء أفضل نمو في إإكسبلنتس فيفو السابقين. وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن أ...

المورد الغذائي الرئيسي للجنين الطيور هو صفار البيض، ويتألف من 33٪ والدهون، والبروتين 17٪، و 1٪ رماد. 1 أثناء التطور الجنيني، غشاء الكيس المحي (YSM) ينمو من داخل تجويف البطن الجنينية ويغطي تدريجيا صفار البيض سطح. ابتداء من اليوم الجنينية 2، يتم زيادة التعبير الجيني المرتبط التمثيل الغذائي للدهون والأوعية الدموية تدريجيا في YSM، وYSM يتطور ببطء التوقعات مثل الزغب. 8،9 هذه التوقعات زيادة امتصاص المواد الغذائية صفار البيض لدعم التطور الجنيني. وYSM هو الأنسجة خارج الجنين الذي يحتوي على ثلاث طبقات جرثومية، الأديم، الأديم المتوسط ​​والأديم الظاهر 14 في الأديم الظاهر الكيس المحي يواجه زلال والروابط مع الغشاء المحي لتغطية بلطف الكيس المحي. وتواجه الخلايا الظهارية الأديم الباطن مباشرة نحو صفار البيض وتكون بمثابة بوابات استخدام المغذيات. 6 ويوسع YSM، الخلايا الظهارية الأديم الباطن (EECS) يمكن تقسيمها من حالات العسر الشديده وظيفة إلى مجموعتين، منطقة المحي والوعائية للمنطقة. 7 وتتكون منطقة المحي من خلايا الأديم الباطن وغير بعيد من الجنين. وتتكون منطقة وعائية من خلايا أرومية متوسطة ويغطي EECS متباينة مع الأوعية الدموية والأنسجة الضامة. بعد يوم الجنينية 5، وتغطي صفار البيض تماما من الأديم الظاهر والأديم الباطن من YSM ومنطقة الأوعية الدموية قد نمت بسرعة. وYSM تمتص، recomposes والنشرات الدهون (كما الصفار المستمدة منخفضة جدا كثافة البروتين الدهني) والبروتينات في نظام الدورة الدموية الجنينية. 9، 2 لذلك، أنشأنا السمان الجنينية النظام الياباني الأساسي الأديم الباطن الظهارية زراعة الخلايا، لدراسة آليات الدهون استخدام في YSM أثناء التطور الجنيني الطيور. الدهون مثل الدهون الثلاثية، ليستين، فوسفورية واستر الكولسترول (CE) هي مصادر الطاقة الأولية للأجنة الطيور. في المراحل المبكرة من التطور، والدهون صفار هي جomposed من 1.3٪ فقط م، وترتفع إلى 10-15٪ في منتصف المدة من التطور الجنيني الطيور 3، ويتم تصنيع 11. استر الكولسترول من الكولسترول بنسبة ستيرول O-ناقلة الأسيل 1 (SOAT1) في YSM جنين الطيور. 4 شكل تخزين الكوليسترول هو CE، ويتم CE في البروتينات الدهنية، ويتم نقل البروتينات الدهنية بواسطة الدورة الدموية إلى الأنسجة. 13 وقبل أسبوع يفقس هناك نمو السريع للأجنة الطيور. تقريبا يتم امتصاص 68٪ من محتويات الدهون المتبقية في صفار خلال هذه المرحلة. 10 الآلية التي صفار وتستخدم الدهون يمكن توضيحها من خلال نموذج البحث EEC. وتم إنشاء بروتوكول ثقافة EEC الدجاج لتحقيق هذا الهدف البحوث. 2، 9 ومع ذلك، ويرجع ذلك إلى انخفاض معدل النجاح من إإكسبلنتس الأنسجة، هناك حاجة إلى تحسين إجراءات زراعة الخلايا الجماعة الاقتصادية الأوروبية لدراسة وظيفة بعض الأنزيمات والبروتينات في التوسط في استخدام المواد الغذائية من قبل أجنة الطيور خلال التنمية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="845">
	<tbody>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:331px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:199px;">Gibco by Life technologies</td>
			<td style="width:148px;">12800-017 10 X 1 L</td>
			<td style="width:167px;">For wash the EECs pellets</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:331px;">D-MEM/F-12</td>
			<td style="width:199px;">Gibco by Life technologies</td>
			<td style="width:148px;">12400-024 10 X 1 L</td>
			<td>As the basal medium in culturing EECs</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:331px;">NBCS</td>
			<td style="width:199px;">Gibco by Life technologies</td>
			<td style="width:148px;">16010-159</td>
			<td>As the supplyment serum in culturing EECs</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:331px;">Pen-Strep Ampho. Solution</td>
			<td style="width:199px;">BI (Biological Industries)</td>
			<td style="width:148px;">03-033-1B 100ml</td>
			<td>For attenuating the possible infection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:331px;">Collagenase Type IV</td>
			<td style="width:199px;">Gibco by Life technologies</td>
			<td style="width:148px;">17104-019 1g</td>
			<td>&#160;Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:331px;">24 well plate</td>
			<td style="width:199px;">FALCON&#174;</td>
			<td style="width:148px;">REF-353047</td>
			<td>For EECs to attach and extension</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:331px;">50 ML PP centrifuge tubes</td>
			<td style="width:199px;">Corning&#174; CentriStarTM</td>
			<td style="width:148px;">430829</td>
			<td>For transportion of membranes and enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">50ML Conical bottomed Tube with Cap</td>
			<td style="width:199px;">PRO TECH</td>
			<td>CT-50-PL-TW</td>
			<td>For transportion of membranes and enzyme digestion</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">Reciprocal shaking bath</td>
			<td>DEAGLE</td>
			<td style="width:148px;">SB302</td>
			<td>For better enzymatic digestion on membranes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary endodermal epithelial cell culture from the yolk sac membrane of japanese quail embryos

أنشأنا الظهارية نموذج خلية ثقافة الأديم الباطن (EEC) لدراسة وظيفة بعض الأنزيمات والبروتينات في التوسط في استخدام المواد الغذائية التي أجنة الطيور خلال التنمية. وحضنت المخصبة بيض السمان اليابانية عند 37 درجة مئوية لمدة 5 أيام ثم صفار جمعت أغشية الكيس (YSM) لإنشاء نظام ثقافة الجماعة الاقتصادية الأوروبية. نحن عزل طبقة الأديم الجنينية من YSM، وشرائح الغشاء إلى 2-3 قطع ملم ويهضم جزئيا مع كولاجيناز قبل البذر في لوحات ثقافة 24-جيدا. وEECS تتكاثر من النسيج ونحن على استعداد للدراسات ثقافة الخلية. وجدنا أن EECS كان الخصائص المميزة للYSM في الجسم الحي، على سبيل المثال، وتراكم قطرات الدهون، تعبيرا عن ستيرول O-ناقلة الأسيل والليباز البروتين الدهني. علاج الهضم جزئية زيادة كبيرة في معدل نجاح ثقافة السوق الأوروبية المشتركة. الاستفادة من EECS، أثبتنا أن التعبير عن SOAT1 ينظمها المخيم دبروتين كيناز ependent مسارا ذات الصلة. هذا النظام الثقافة السمان EEC الياباني الأساسي هو أداة مفيدة لدراسة نقل الدهون الجنينية وتوضيح دور الجينات المسؤولة في التوسط في استخدام المواد الغذائية في YSM أثناء التطور الجنيني الطيور.

من أجل تحقيق هدف إقامة نموذج خلية متسقة ومفيدة، ونحن بحاجة إلى توسيع واستقرار معدل انتشار وأداء EECS الطيور. قارنا حضانة مباشرة من الأديم الباطن مع عدم وجود انزيم الهضم مع الأديم هضمها جزئيا مع الإنزيمات المحللة للبروتين، مثل كولاجيناز أو كولاجيناز ?...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos at JoVE.com

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.

زراعة الخلايا الأولية الأديم الباطن طلائي من الكيس المحي غشاء اليابانية السمان الأجنة

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

primary-endodermal-epithelial-cell-culture-from-yolk-sac-membrane

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.8K Views.  National Taiwan University. To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.

Video: Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

كفاءة نقل الجينات في شبكية العين الفرخ عن الخلية الأولية دراسات الثقافة: ل<em&gt; السابقين البيضة</em&gt; Electroporation للمنهج

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

عزل وتوصيف الخلايا واحدة من اسماك الزرد الأجنة

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

إنتاج واسع النطاق العضلية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية باستخدام تكرار للغاية الصغيرة وبناء جزيء بروتوكول التمايز

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish embryos has been implemented. This technique takes advantage of the selectivity and sensitivity conferred by affinity labeling of a given receptor by its ligand with the specificity of the immunoprecipitation. We have used AFLIP to detect the type III TGF-&#946; receptor (TGFBR3), also know as betaglycan, during early zebrafish development. AFLIP was instrumental in validating the efficacy of a TGFBR3 morphant zebrafish phenotype. In the first step, embryo protein extracts are prepared and used to generate 125I-TGF-&#946;2-TGFBR3 complexes that are purified by immunoprecipitation. Later, these complexes are covalently cross-linked and revealed using SDS-PAGE separation and autoradiography detection. This technique requires the availability of a labeled ligand for, and a specific antibody against, the receptor to be detected, and shall be easily adapted to identify any growth factor or cytokine receptor that meets these requirements.

A novel technique for the detection of low abundance endogenous receptors present in zebrafish embryos is described. We have named it AFLIP because it consists of affinity labeling of the receptor by its ligand linked to immunoprecipitation.

تقارب كشف وسمها الذاتية المستقبلات من الزرد الأجنة

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

بيوسنسينغ موتور الخلايا العصبية الغشاء المحتملة في الأجنة الزرد الحية

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types that are distinct not only in molecular and morphological features but also in physiological properties. These differences reflect their diverse functions, which together establish the necessary microenvironment for the post-testicular sperm development in the epididymal lumen. The understanding of the biophysical properties of the epididymal epithelial cells is critical for revealing their functions in sperm and reproductive health, under both physiological and pathophysiological conditions. While their functional properties have yet to be fully elucidated, the epididymal epithelial cells can be studied using the patch-clamp technique, a tool for measuring the cellular events and the membrane properties of single cells. Here, we describe the methods of cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides.

We present a protocol that combines cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of the primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides. This protocol allows for investigation of the functional properties of primary epididymal epithelial cells to further elucidate the physiological role of the epididymis.

خلية كاملة التصحيح المشبك تسجيلات من الخلايا الظهارية الأولية المعزولة من البربخ

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines retain the ability to either self-renew or differentiate under specific conditions. Due to these properties, mESC are a useful tool in regenerative medicine, disease modeling, and tissue engineering studies. This article describes a simple protocol to obtain mESC lines with high derivation efficiencies (60-80%) by culturing blastocysts from permissive mouse strains on feeder cells in defined medium supplemented with leukemia inhibitory factor. The protocol can also be applied to efficiently derive mESC lines from non-permissive mouse strains, by the simple addition of a cocktail of two small-molecule inhibitors to the derivation medium (2i medium). Detailed procedures on the preparation and culture of feeder cells, collection and culture of mouse embryos, and derivation and culture of mESC lines are provided. This protocol does not require specialized equipment and can be carried out in any laboratory with basic mammalian cell culture expertise.

This article describes a protocol to efficiently derive and culture pluripotent stem cell lines from mouse embryos at the blastocyst stage.

اشتقاق خطوط الخلايا الجذعية من الأجنة الجيني الماوس

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

فؤاد وميكرورهيولوجي في الخلية صفار الجنين الزرد

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine development of the embryo. Although genetic data from knockout (KO) mice are convincing, it is not realistic to generate KO mice for all genes as needed. In addition, performing in vivo rescue experiments to consolidate the data obtained from KO mice is not convenient. To overcome these limitations, the Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) explant culture was developed as an appropriate system to study hematopoietic stem cell (HSC) development. Especially for rescue experiments, it can be used to recover the impaired hematopoiesis in KO mice. By adding the appropriate chemicals into the medium, the impaired signaling can be reactivated or up-regulated pathways can be inhibited. With the use of this method, many experiments can be performed to identify the critical regulators of HSC development, including HSC related gene expression at mRNA and protein levels, colony formation ability, and reconstitution capacity. This series of experiments would be helpful in defining the underlying mechanisms essential for HSC development in mammals.

This protocol describes using cultured Aorta-Gonad-Mesonephros for expression analyses, colony-forming units in the culture and spleen, and long-term reconstitution to determine the effect of regulatory factors and signaling pathways on hematopoietic stem cell development. This has been demonstrated as an effective system for studying hematopoietic stem cell biology and function.

تطبيق نظام الثقافة Explant الشريان الاورطي-الغدد التناسلية-ميسونيفروس في هيماتوبويسيس الإنمائية

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

بالعزلة وثقافة الخلايا Epicardial الأولية المستمدة من عينات من قلب الكبار والأجنة البشرية

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...