We thank Yumeng (Helen) Xia (Rutgers University) for manuscript editing. The work on BASL polarity formation is supported by grants from the U.S. National Institute of General Medical Sciences to J.D. (R01GM109080) and Rutgers University.

1. Construcción del plásmido <ol><li> Generar los constructos de la tecnología de clonación como se ha descrito previamente 1,6. <ol><li> En primer lugar utilizar una ADN polimerasa de alta fidelidad con cebadores adecuados para amplificar las secuencias codificadoras de BASL, YDA y MPK6 y los sub-clonan en vectores de entrada. Encuentra el protocolo detallado en 7. </li><li> Para generar las versiones dominantes negativos de MPK6 y YDA (DNmpk6 8 y DNyda 4, respectivamente), utilizar los plásmidos de entrada de MPK6 y YDA como molde e introducir las mutaciones puntuales mediante un método de mutagénesis dirigida al sitio 9. </li></ol></li><li> Para construir las construcciones para ensayos transitorios de tabaco, llevar a cabo reacciones de RL estándar (attL x attR recombinación) (procedimiento detallado en el 7) para integrar en BASL pH35CG 10, DNyda y DNmpk6 en pXNGW y pXCGW vectores 11, respectivamente. <ol><li> Confirmar los plásmidos resultantes de la digestión enzimática y secuenciación. Una vez successful, transformar los constructos binarios en la cepa de Agrobacterium tumefaciens GV3101 12 y cultivarlas en placas de selección a 28 ° C durante 2 - 3 días. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de la solución de infiltración de Agrobacterium <ol><li> Inocular unas pocas colonias de Agrobacterium recién transformados en 10 ml de medio Luria-Bertani (LB) con los antibióticos apropiados (gentamicina 25 g / ml, rifamicina 25 g / ml, espectinomicina 100 mg / ml para pH35CG, pXNGW y pXCGW construye; las mismas concentraciones de gentamicina y rifamicina con kanamicina 50 mg / ml de P19 (que expresan las proteínas contra el silenciamiento transgénico) 13. </li><li> Crecer cultivos de Agrobacterium en un agitador C 28 ° a la velocidad de 200 rpm durante aproximadamente 16 horas y después medir la OD 600 (estimado para llegar a 1.5 a 1.8) (Figura 2A-B). Centrifugar los cultivos a 2.500 xg durante 10 min. Vuelva a suspender y wash los sedimentos celulares con 10 mM de MgCl 2 (la solución de infiltración). </li><li> Centrifugar los cultivos de nuevo y vuelva a suspender los pellets con la cantidad apropiada de la solución de infiltración para llegar a la final OD 600 = 0,5 (Figura 2C-D). Antes de la infiltración de las plantas, dejar las mezclas de células a temperatura ambiente por 1 - 3 horas. Este paso ayuda a mantener la homeostasis celular. </li></ol> 3. planta de tabaco y la hoja de Inyección <ol><li> Use plantas de tabaco (Nicotiana benthamiana) que se cultivan 4 - 5 semanas de edad, en una cámara de crecimiento de plantas estándar (23 ° C con ciclos de 16 h luz / 8 h oscuridad) 14 para la inyección de la hoja. Nota: En esta etapa, las plantas de tabaco suelen tener 6 hojas (2 grandes, 2 medianas y 2 pequeñas). Las dos hojas de tamaño medio son los más óptimo para la inyección de la hoja (los dos más grandes son demasiado viejos, mientras que los dos más pequeños son a menudo demasiado joven). </li><li> Antes del día de infiltración, regar el Tobacplantas compañeros para saturar el suelo. </li><li> En el día de infiltración, pre-incubar las plantas en la oscuridad durante 1-3 hr. Este paso permite estomas en la epidermis para abrir ampliamente, lo que facilita en gran medida el Agrobacterium al penetrar en las células epidérmicas de la hoja. </li><li> El uso de cintas de color en la sección de fechas, la bandera de las hojas para ser infiltrada. Marcar las áreas que se infiltraron con un rotulador negro grueso (opcional; las zonas infiltradas son visibles después de ser infectados.). </li><li> Tome volúmenes iguales de la Agrobacterium resuspensión y mezclarlas en un 100 x 15 mm placa de Petri agitando suavemente (Figura 2E). Nota: En nuestro caso, hemos mezclado 1 ml de p19 con 1 ml de PPC-BASL, 1 ml de DNyda-NYFP y 1 ml de DNmpk-cYFP. </li><li> En el proceso de infiltración, llenar una jeringa sin aguja 3 ml con la mezcla de infiltración (1 - 2 ml) y empuje en la parte inferior (abaxial) de la hoja de tabaco (Figura 2F). Mientras que la infiltración, es útilutilizar una mano para empujar y la otra mano para apoyar suavemente el lado superior (adaxial, contra la fuerza de empuje). Nota: Una vez que la mezcla de infiltración se inyecta con éxito, las áreas infectadas serán fácilmente reconocibles en la epidermis. Sin embargo, la infiltración puede fallar debido a la inyección dura (daño tisular) o presionado bastante (sin penetración de líquidos). Para cada prueba, se sugiere al menos dos inyecciones en dos hojas independientes (de diferentes plantas). </li><li> Colocar las plantas infectadas de nuevo en la cámara de crecimiento. En general, las expresiones de proteínas son detectables después de seguir la infiltración de 48 hr. </li></ol> 4. Imagen confocal <ol><li> A las 48 horas la infiltración de correos, utilizar una perforadora para extirpar un disco de hoja de la zona de inyección (normalmente 3 - 4 discos / área pueden ser producidos) (Figura 2G). Use pinzas para transferir suavemente los discos de hoja a una diapositiva (el lado abaxial hacia arriba) y montarlos con gotas de agua. Evite presionar demasiado Hard en la hoja de la cubierta porque las células dañadas exprimidos / no mostrará bien bajo el microscopio confocal (Figura 2H). </li><li> Antes de imagen confocal, escanear las muestras montadas en un microscopio compuesto de epi-fluorescencia para comprobar los niveles de expresión. Nota: Sobre la base de nuestra experiencia, las células que muestran los niveles de expresión intermedios se representan mejor en el microscopio confocal. </li><li> Comenzar con el (1,3 NA) del objetivo 40X en un microscopio confocal. Ajuste el deslizante a la posición deseada de manera que las células que expresan niveles medios de proteína fluorescente permanecen en el centro. Los espectros de excitación / emisión de PPC y YFP son 458 nm / 480 - 500 nm y 514 nm / 520 - 540 nm, respectivamente. </li><li> Activar el botón &quot;vivo&quot; para previsualizar las imágenes a continuación, ajustar la intensidad del láser y la ganancia inteligente para la relación de la intensidad de fluorescencia / ruido más equilibrado. Para mejorar la calidad de imagen, aumentar píxeles de exploración y / o media de trama / línea. Finalmente, ajuste el botón de enfoque para reach el plano focal mediana y haga clic en &quot;Capture&quot; para tomar la imagen. Nota: El PPC y YFP imágenes se pueden capturar de forma secuencial o simultánea mediante la comprobación o desactivar la opción de modo de escaneo &quot;secuencial&quot;, respectivamente. </li><li> Cuando se desea Z-proyección para la visión en profundidad de las celdas, seleccione el modo de imagen &quot;xyz&quot;, definir la profundidad del campo de barrido (10 - 15 micras) y recoger las imágenes de la parte superior a la parte inferior de la célula diana . Compilar las imágenes obtenidas con el software Leica haciendo clic derecho sobre el archivo de imagen para seleccionar &quot;cambiar el nombre&quot; y exportar imágenes como archivos .tiff. </li><li> Image 30 - 40 células para el análisis de la cuantificación. </li></ol> 5. Procesamiento y Análisis de Imágenes Cuantificación <ol><li> Utilice el software de Fiji (http://fiji.sc/Fiji) para procesar imágenes y llevar a cabo la cuantificación. <ol><li> Trazar los gráficos de intensidad de fluorescencia. <ol><li> Para visualizar mejor si la expresión PPC / YFP esuniformemente distribuida, Fiji utilizar para demostrar la potencia de la señal de PPC y YFP lo largo de la periferia de la célula. Para lograr esto, primero lanzar Fiji a continuación, seleccione &quot;Archivo&quot; y &quot;Abrir&quot; para iniciar la imagen. Haga clic en &quot;línea&quot; en el menú de herramientas y seleccione &quot;línea segmentada&quot; haciendo clic derecho. Decidir la región de interés y trazar una línea a lo largo de la periferia de la célula para rastrear la PPC o la señal de YFP (Figura 3A-C). Nota: Fiji mide el valor de la intensidad de fluorescencia absoluta a lo largo de las líneas segmentadas. </li><li> Seleccione el menú desplegable &quot;Analizar&quot; y &quot;Lote perfil&quot; para generar un gráfico con los valores de posición e intensidad que representan los niveles de PPC / YFP a lo largo de la línea segmentada. Si se desea, duplicar los valores de intensidad (seleccionando el menú &quot;Copiar&quot;) en Excel u otro software gráfico para generar gráficos de intensidad comparable. </li></ol></li><li> Cuantificar el grado de polaridad. <ol><li> Recoger aproximadamente 20 represencélulas tativos de 3 experimentos replicados para evaluar el grado de polaridad del PPC y YFP en células de tabaco. Calcule el grado de polaridad en base a la relación de la intensidad de fluorescencia alta (definida como H) sobre la intensidad de fluorescencia baja (definido como L). Nota: El método de cuantificación se explica en la Figura 3. <ol><li> Para medir los valores de H y L, trazar una línea segmentada a lo largo de la región interesados ​​en la periferia de la célula (descrito anteriormente), haga clic en &quot;Analizar&quot; en el menú desplegable, y luego seleccione &quot;Medición&quot;. Cuando un &quot;Resultados&quot; ventana aparece, utilice &quot;Mean&quot; valores para llevar a cabo la cuantificación. </li><li> A partir de las células que muestran expresión relativamente uniforme de PPC y YFP, por ejemplo, CFP-BASL (Figura 3A) o la YFP complementan de la co-expresión de DNyda-NYFP y DNmpk6-cYFP (Figura 3B), obtener los valores de H y L midiendo seleccionados de manera aleatoria segmentos periféricos con la misma longitud. </li> &lt;li&gt; A partir de las células que muestran la acumulación polar evidente de proteínas fluorescentes, en este caso, la co-expresión de CFP-BASL, DNyda-NYFP y DNmpk6-cYFP (Figura 3C), recoger los valores de H de las regiones periféricas con señales de fluorescencia enriquecidos y los Ls de las regiones con baja acumulación / fluorescencia. </li><li> Se combinan las proporciones resultantes de H / L de 20 células juntos y las pruebas para la distribución normal. Calcular los valores de p de la prueba t de Student (para distribución normal) o la prueba de Kolmogorov-Smirnov (KS) (para su distribución no normal). </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

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	<li>Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BASL+controls+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis.">BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis.</a> Cell. 137, 1320-1330 (2009).</li><li>Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAPKK+kinase+gene+regulates+extra-embryonic+cell+fate+in+Arabidopsis.">A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis.</a> Cell. 116, 109-119 (2004).</li><li>Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OCTOPUS,+a+polarly+localised+membrane-associated+protein,+regulates+phloem+differentiation+entry+in+Arabidopsis+thaliana.">OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 139, 1306-1315 (2012).</li><li>Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+stomatal+meristemoids+reveals+new+component+of+asymmetric+cell+division+and+commonalities+among+stem+cell+populations+in+Arabidopsis.">Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).</li><li>Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRX+mediates+feedback+between+brassinosteroid+levels+and+auxin+signalling+in+root+growth.">BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth.</a> Nature. 443, 458-461 (2006).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Uso General y posibles modificaciones del sistema de expresión transitoria del tabaco para la transducción de señales: La sobreexpresión de la proteína fluorescente (FP)-etiquetados proteínas en la epidermis de tabaco ha sido utilizado con éxito para el examen rápido de la localización subcelular de proteínas en las células vegetales. Sin embargo, el estudio de distribución de señalización dinámica del complejo de la proteína in planta es un tema difícil debido a los contextos ...

Las proteínas interactúan dentro de una red y forman intrincados complejos jerárquicos que juegan un papel fundamental en casi todos los procesos biológicos que ocurren en un entorno celular impredecible. Sin embargo, desde el desarrollo de las plantas a las respuestas de crecimiento, ha habido una falta de herramientas convenientes que no puede solo rápido, sino identificar de manera eficiente y monitorear estos eventos de señalización dinámica a nivel subcelular. El sistema de expresión de proteína transitoria en epidermis de hojas de tabaco ha apelando ventajas para la visualización de las proteínas fluorescentes en células vivas. Este sistema proporciona semi condiciones in vivo que permiten la modificación de proteínas después de la traducción y el examen rápido de localización de la proteína. Mediante el examen de la señal de YFP complementado, la complementación fluorescente (BiFC) de ensayo bimolecular informa a la posibilidad de interacción proteína-proteína en las células vegetales. En comparación con otros métodos, por ejemplo, levadura de dos híbridos (Y2H) y co-immunoprecipitation (Co-IP), BiFC también proporciona un medio poderoso para la visualización de los compartimentos donde se pueden producir interacciones proteína-proteína a nivel subcelular. Debido a la división celular asimétrica (ACD) mantiene vástago población de células, mientras que la generación de nuevos tipos de células para la formación de tejido / órgano, es un mecanismo indispensable para promover pluricelularidad eucariota. Desarrollo Arabidopsis estomática se ha usado como un sistema modelo para el estudio de ACD en las plantas. La célula precursora, célula madre meristemoide, divide asimétricamente para producir dos células hijas diferentes, un meristemoide (sufre vástago divisiones de células como antes de terminar en un par de células de guarda) y una célula de linaje suelo estomática (SLGC) (puede dividirse y diferenciarse en una célula de pavimento), respectivamente (Figura 1). En los estomas ACD, la novela Breaking proteína de la asimetría en el linaje de los estomas (BASL) está polarizado para conducir premitotically asimetrías de división, que incasimetría física lude y asimetría 1 destino celular. Una cascada MAPK compuesto por el MAPKKK Yoda y las MAPKs, MPK3 y 6 es central para modelar la división de los estomas y la adopción destino 2,3, 4,5. Recientemente, Zhang et al. BASL vinculado la proteína de la polaridad de la vía de señalización YDA-MAPK en Arabidopsis estomas ACD 6. La vía canónica Yoda-MAPK, a través de MPK3 / 6, fosforila y activa BASL su polarización. Funciones BASL fosforilados como un andamio y recluta YODA (YDA) y MPK3 / 6 para formar un complejo de proteínas y concentran la señalización en la corteza celular 6. La polarización de los componentes de MAPK y el bucle de realimentación positiva entre BASL y la vía YDA-MAPK representa un nuevo mecanismo para la polarización de proteínas en células de plantas. Señalización de MAPK localmente enriquecido es la hipótesis de estar estrechamente vinculado a la diferenciación del destino celular en los estomas ACD 6 (Figura 1). Uno de los key datos experimentales que apoya este modelo vino de los ensayos de tabaco que demostraron la redistribución espacial de MAPKs inducidos por la expresión de BASL 6. En general, no es fácil de controlar cuando se produce la señalización de MAPK porque las moléculas de MAPK se encuentran a menudo en todas partes en el interior de una célula. En este estudio, se utilizó el sistema split-YFP de visualizar la interacción entre la quinasa aguas arriba y aguas abajo los sugerir donde se produce el relé de señalización. Hemos ampliado aún más el uso del sistema de BiFC por la co-expresión de una tercera proteína (CFP-tagged) con la división YFP par (sugestiva de la interacción proteína-proteína) para visualizar si y cómo el YFP complementado podría espacialmente modulada por la co- proteína expresada PPC. Al hacerlo, hemos demostrado que la co-expresión de PPC-BASL inducida reorganización espacial de las interacciones entre YDA y MPK6, a partir de una distribución uniforme de los patrones de polarización en la corteza celular de la epidermis del tabacocélulas al. Por consiguiente, este sistema tiene el potencial de ser desarrollado para el seguimiento de eventos de señalización dinámicos en células de la planta en condiciones cuando las células son desafiados por los estímulos internos o externos (por ejemplo, la co-expresión de otras proteínas, la aplicación química, ataque de patógenos o los cambios ambientales, etc. ).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D/TOPO</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K2400-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit</td>
			<td>Agilent Technology</td>
			<td>200521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J106-2KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J673-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3632-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K4000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4014-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25x75mm Slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24x50 mm Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td>&#160;LAS AF Lite software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 x objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HCX&#160;Plan APO&#160;</td>
			<td>HCX&#160;Plan APO&#160;, NA 1.30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SORVALL 6+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml falcon tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 5 Forceps</td>
			<td>Canemco &#38; Marivac</td>
			<td>205EQA-Spec</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging spatial reorganization of a mapk signaling pathway using the tobacco transient expression system

La visualización de los eventos de señalización dinámicos en células vivas ha sido un reto. Hemos ampliado un sistema de expresión transitoria establecida, el ensayo de complementación biomolecular fluorescente (BiFC) en las células epidérmicas de tabaco, de la interacción proteína-proteína de prueba para seguimiento de la distribución espacial de la transducción de señales en células vegetales. En este protocolo, se utilizó el ensayo de BiFC para demostrar que la interacción y la señalización entre la Arabidopsis MAPKKK Yoda y MAPK6 se producen en la membrana plasmática. Cuando se co-expresó el BASL andamio de proteínas, la interacción Yoda-MAPK redistribuido y espacialmente copolarizada con PPC-BASL. Este sistema de expresión del tabaco modificado permite la exploración rápida de la señalización de localización y dinámicos cambios (menos de 4 días) y puede acomodar múltiples colores de la proteína fluorescente (al menos tres). También presentamos los métodos detallados para cuantificar la distribución de proteínas (localización espacial asimétrica, o &quot;polarización&quot;;) En células de tabaco. Este sistema de expresión del tabaco avanzado tiene un potencial de ser utilizado ampliamente para la prueba rápida de eventos de señalización dinámica en las células de plantas vivas.

Para evitar la muerte celular inducida por la señalización de MAPK hiperactivo, se utilizaron las versiones inactivas de quinasa de YDA (DNyda) y MPK6 (DNmpk6) en el ensayo de co-expresión en células de tabaco. Ni la interacción entre DNyda y DNmpk6 revelado por sí ni BiFC patrón de distribución desigual generado (Figura 3A-B) CFP-BASL. Sin embargo, cuando CFP-BASL se introdujo en el par de interacción DNyda-DNmpk6, tanto las señales de YFP PPC y se redistribuy...

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Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

La formación de imágenes reorganización espacial de una vía de señalización MAPK Usando el sistema de expresión transitoria del Tabaco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

The overall goal of this procedure is to visualize dynamic spatial distribution of protein

imaging-spatial-reorganization-mapk-signaling-pathway-using-tobacco

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K vistas.  Rutgers, The State University of New Jersey. The overall goal of this procedure is to visualize dynamic spatial distribution of protein

Video: Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXcell para transfectar células primarias con alta eficiencia

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Investigación

Biología

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Las secciones incluidas en parafina y congeladas de Drosophila Los músculos de Adultos

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

La visualización de Caenorhabditis Elegans Estructuras de la cutícula uso del colorante lipofílico Vital, DII

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

Un alto contenido de imágenes de flujo de trabajo para estudiar Grb2 complejos de señalización por clonación de expresión

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration eficiente de las plantas para la expresión transitoria de alto nivel de proteínas recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

La cuantificación temporal de la expresión de MAPK inducida en células individuales de levadura

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

Expresión transitoria de proteínas por hidrodinámico entrega de genes en ratones

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

La medición de la tasa metabólica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Mediante respirometría

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.