We thank Yumeng (Helen) Xia (Rutgers University) for manuscript editing. The work on BASL polarity formation is supported by grants from the U.S. National Institute of General Medical Sciences to J.D. (R01GM109080) and Rutgers University.

1. Costruzione plasmide <ol><li> Generare i costrutti di clonazione tecnologia come descritto in precedenza 1,6. <ol><li> In primo luogo utilizzare un DNA polimerasi ad alta fedeltà con primer adeguati per amplificare le sequenze codificanti di BASL, YDA e MPK6 e sub-clonare in vettori di ingresso. Trova il protocollo dettagliato in 7. </li><li> Per generare le versioni negative dominanti (rispettivamente 8 e DNmpk6 DNyda 4,) MPK6 e YDA, utilizzare i plasmidi di entrata di MPK6 e YDA come modello e introdurre le mutazioni puntiformi con un metodo mutagenesi sito-9. </li></ol></li><li> Per costruire i costrutti per saggi transienti tabacco, condurre una serie LR (Attl x attr ricombinazione) reazioni (procedura dettagliata 7) per integrare BASL in pH35CG 10, DNyda e DNmpk6 in pXNGW e pXCGW vettori 11, rispettivamente. <ol><li> Confermare i plasmidi risultanti di digestione enzimatica e sequenziamento. Una volta che sUccessful, trasformare i costrutti binari nel Agrobacterium tumefaciens ceppo GV3101 12 e farle crescere su piastre di selezione a 28 ° C per 2 - 3 giorni. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione della soluzione Agrobacterium Infiltration <ol><li> Seminare alcune colonie di Agrobacterium appena trasformati in 10 ml di Luria-Bertani (LB) media con antibiotici appropriati (Gentamicina 25 mg / ml, Rifamicina 25 mcg / ml, Spectinomicina 100 ug / ml per pH35CG, pXNGW e pXCGW costruisce, le stesse concentrazioni di gentamicina e kanamicina Rifamicina con 50 mg / ml per P19 (che esprimono le proteine ​​contro silenziamento transgenico) 13. </li><li> Grow culture Agrobacterium in C shaker 28 ° alla velocità di 200 rpm per circa 16 ore e quindi misurare la OD 600 (stimato crescere dell&#39;1,5 - 1.8) (Figura 2A-B). Centrifugare le culture a 2.500 xg per 10 min. Risospendere e wash i pellet cellulari con 10 mM di MgCl 2 (la soluzione di infiltrazione). </li><li> Spin giù le culture di nuovo e ri-sospendere i pellet con la quantità appropriata della soluzione di infiltrazione per raggiungere la finale OD 600 = 0,5 (Figura 2C-D). Prima di infiltrazione piante, lasciare le miscele di cella a temperatura ambiente per 1-3 ore. Questo passaggio consente di mantenere l&#39;omeostasi cellulare. </li></ol> 3. Impianto di tabacco e Foglia Iniezione <ol><li> Utilizzare le piante di tabacco (Nicotiana benthamiana), cresciuti 4-5 settimane di età in una camera di crescita delle piante standard (23 ° C con cicli di 16 ore-luce / 8 ore buio) 14 per l&#39;iniezione foglia. Nota: In questa fase, le piante di tabacco in genere hanno 6 foglie (2 grandi, 2 medie e 2 piccole). Le due foglie medie sono il più ottimale per l&#39;iniezione del foglio (i due grandi sono troppo vecchi, mentre i due piccoli sono spesso troppo giovane). </li><li> Prima del giorno di infiltrazione, innaffiare il Tobacpiante co per saturare il terreno. </li><li> Il giorno infiltrazione, pre-incubare le piante al buio per 1 - 3 ore. Questa fase consente stomi nell&#39;epidermide per aprire ampiamente, che facilita notevolmente l&#39;Agrobacterium quando penetra nelle cellule epidermiche foglia. </li><li> Usando nastri di colore etichettate con date, bandiera le foglie di essere infiltrati. Selezionare le aree da infiltrati con un pennarello nero spesso (facoltativo; le zone infiltrate sono visibili dopo l&#39;infezione.). </li><li> Prendere volumi uguali di Agrobacterium risospensione e mescolarli in un 100 x 15 mm Petri delicatamente vorticoso (Figura 2E). Nota: Nel nostro caso, abbiamo mescolato 1 ml di p19 con 1 ml di CFP-BASL, 1 ml di DNyda-nYFP e 1 ml di DNmpk-cYFP. </li><li> Nel processo di infiltrazione, riempire una siringa da 3 ml di ago con la miscela infiltrazione (1 - 2 ml) e spingere sul lato inferiore (abaxial) della foglia di tabacco (Figura 2F). Mentre infiltrazione, è utilead usare una mano per spingere e l&#39;altra mano per sostenere delicatamente il lato superiore (adaxial, contro la forza di spinta). Nota: Una volta che la miscela di infiltrazione viene iniettato con successo, le zone infette saranno facilmente riconoscibili nell&#39;epidermide. Tuttavia, l&#39;infiltrazione potrebbe non riuscire a causa di iniezione dura (danni ai tessuti) o spinta insufficiente (nessuna penetrazione liquido). Per ogni test, si consiglia almeno due iniezioni in due foglie indipendenti (da piante diverse). </li><li> Posizionare le piante infette di nuovo nella camera di crescita. In generale, le espressioni di proteine ​​sono rilevabili dopo 48 ore dopo l&#39;infiltrazione. </li></ol> 4. confocale Imaging <ol><li> A 48 ore dopo l&#39;infiltrazione, usare una perforatrice per asportare un disco foglia dalla zona di iniezione (normalmente 3 - 4 dischi / zona possono essere prodotte) (Figura 2G). Utilizzare le pinzette per trasferire delicatamente i dischi di foglie di una diapositiva (il lato abaxial verso l&#39;alto) e montare loro con gocce d&#39;acqua. Evitare di premere troppo harD sul vetrino perché spremuti / cellule danneggiate non mostrerà ben al microscopio confocale (Figura 2H). </li><li> Prima confocale, la scansione dei campioni montati su un microscopio composto epi-fluorescenza per controllare i livelli di espressione. Nota: In base alla nostra esperienza, le cellule che mostrano livelli di espressione intermedi sono meglio rappresentati al microscopio confocale. </li><li> Inizia con la (1.3 NA) obiettivo 40X su un microscopio confocale. Regolare la slitta nella posizione desiderata in modo che le cellule che esprimono livelli medi di proteina fluorescente rimangono al centro. Gli spettri di eccitazione / emissione per PCP e YFP sono 458 nm / 480-500 nm e 514 nm / 520-540 nm, rispettivamente. </li><li> Attivare il pulsante &quot;Live&quot; per visualizzare in anteprima le immagini quindi regolare l&#39;intensità del laser e intelligente guadagno per il rapporto di fluorescenza intensità / rumore più equilibrata. Per migliorare la qualità delle immagini, aumentare pixel scansione e / o medio cornice / linea. Infine, regolare la manopola di messa a fuoco a reach il piano focale mediana e fare clic su &quot;Capture&quot; per acquisire l&#39;immagine. Nota: La PCP e le immagini YFP possono essere catturate in sequenza o simultaneamente controllando o disattivare l&#39;opzione di modalità di scansione &quot;sequenziale&quot;, rispettivamente. </li><li> Quando Z-proiezione è desiderato per la visualizzazione in profondità delle celle, selezionare la modalità di imaging &quot;xyz&quot;, definire la profondità della portata di scansione (10 - 15 micron) e raccogliere le immagini dalla cima al fondo della cellula bersaglio . Compilare le immagini ottenute con il software Leica facendo clic destro sul file di immagine per selezionare &quot;rinomina&quot; e esportare le immagini come file TIFF. </li><li> Immagine 30 - 40 cellule per l&#39;analisi di quantificazione. </li></ol> Processing 5. Immagine e analisi Quantificazione <ol><li> Utilizzare il software Fiji (http://fiji.sc/Fiji) per elaborare le immagini e condurre la quantificazione. <ol><li> Tracciare i grafici di intensità di fluorescenza. <ol><li> Per visualizzare meglio se l&#39;espressione CFP / YFP èuniformemente distribuito, usare Fiji per dimostrare la forza della PCP e YFP segnale lungo la periferia delle cellule. Per raggiungere questo obiettivo, primo lancio Fiji quindi selezionare &quot;File&quot; e &quot;Open&quot; per avviare l&#39;immagine. Fai clic su &quot;linea&quot; nel menu degli strumenti e selezionare &quot;linea segmentata&quot; facendo clic destro. Decidere la regione di interesse e tracciare una linea lungo la periferia cellulare per rintracciare il PCP o il segnale YFP (figura 3A-C). Nota: Fiji misura il valore assoluto intensità di fluorescenza lungo le linee segmentate. </li><li> Selezionare il menu a discesa &quot;Analizza&quot; e &quot;profilo di stampa&quot; per generare un grafico con valori di posizione e l&#39;intensità che rappresentano i livelli di CFP / YFP lungo la linea segmentata. Se lo si desidera, duplicare i valori di intensità (selezionando il menu &quot;Copia&quot;) in Excel o altri software di grafica per generare grafici di intensità paragonabile. </li></ol></li><li> Quantificare grado di polarità. <ol><li> Raccogliere circa 20 rapprecellule tativi da 3 esperimenti replicati per valutare il grado di polarità della PCP e YFP in cellule di tabacco. Calcolare il grado di polarità sulla base del rapporto tra l&#39;intensità di fluorescenza (definita come H) sull&#39;intensità di fluorescenza bassa (definita come L). Nota: Il metodo di quantificazione è spiegato nella figura 3. <ol><li> Per misurare i valori di H e L, tracciare una linea segmentata lungo la regione interessata alla periferia delle cellule (sopra descritto), fare clic su &quot;Analizza&quot; dal menu a discesa, quindi selezionare &quot;Measure&quot;. Quando una finestra &quot;Risultati&quot; si apre, usare &quot;Mean&quot; valori per eseguire quantificazione. </li><li> Dalle cellule che mostrano espressione relativamente uniforme della PCP e YFP, ad esempio, CFP-BASL (figura 3A) o YFP completati dal co-espressione di DNyda-nYFP e DNmpk6-cYFP (Figura 3B), ottenere i valori di H e L, misurando due segmenti selezionati in modo casuale periferiche con uguale lunghezza. </li> &lt;li&gt; Dalle cellule espositrici evidente accumulo polare di proteine ​​fluorescenti, in questo caso, la co-espressione di CFP-BASL, DNyda-nYFP e DNmpk6-cYFP (Figura 3C), raccoglie i valori di H delle regioni periferiche con i segnali di fluorescenza arricchiti e le LS da regioni con nessun accumulo bassa / fluorescenza. </li><li> Pool i rapporti risultanti di H / L da 20 celle insieme e di prova per la distribuzione normale. Calcolare i valori di p per il test t di Student (per la distribuzione normale) o il test di Kolmogorov-Smirnov (KS) (per la distribuzione non normale). </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BASL+controls+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis.">BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis.</a> Cell. 137, 1320-1330 (2009).</li><li>Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAPKK+kinase+gene+regulates+extra-embryonic+cell+fate+in+Arabidopsis.">A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis.</a> Cell. 116, 109-119 (2004).</li><li>Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OCTOPUS,+a+polarly+localised+membrane-associated+protein,+regulates+phloem+differentiation+entry+in+Arabidopsis+thaliana.">OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 139, 1306-1315 (2012).</li><li>Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+stomatal+meristemoids+reveals+new+component+of+asymmetric+cell+division+and+commonalities+among+stem+cell+populations+in+Arabidopsis.">Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).</li><li>Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRX+mediates+feedback+between+brassinosteroid+levels+and+auxin+signalling+in+root+growth.">BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth.</a> Nature. 443, 458-461 (2006).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Uso generale e possibili modifiche del sistema di espressione transitoria Tabacco per trasduzione del segnale: sovraespressione di proteina fluorescente (FP) -tagged proteine ​​dell&#39;epidermide tabacco è stato utilizzato con successo per l&#39;esame veloce di proteine ​​localizzazione subcellulare in cellule vegetali. Tuttavia, studiando la distribuzione di segnalazione dinamica del complesso proteico in Planta è un argomento difficile a causa di contesti subcellulari complicate, i...

Le proteine ​​interagiscono all&#39;interno di un intricato gerarchici complessi di rete e di forma che giocano un ruolo fondamentale in quasi tutti i processi biologici che avvengono in un ambiente cellulare imprevedibile. Tuttavia, dallo sviluppo pianta risposte di crescita, c&#39;è stata una mancanza di strumenti utili che possono non solo rapidamente, ma anche identificare e sorvegliare efficacemente questi eventi di segnalazione dinamici a livello subcellulare. Il sistema di espressione della proteina transitoria tabacco epidermide foglia è attraente vantaggi per la visualizzazione di proteine ​​fluorescenti nelle cellule viventi. Questo sistema fornisce semi in vivo condizioni che permettono la modifica della proteina post-traslazionale e rapido esame di localizzazione delle proteine. Esaminando il segnale YFP completato, il test biomolecolare complementazione fluorescenza (BiFC) informa la possibilità di interazione proteina-proteina nelle cellule vegetali. Rispetto ad altri metodi, ad esempio, il lievito-due ibridi (Y2H) e co-immunoprecipitation (Co-IP), BiFC fornisce anche un potente mezzo di visualizzazione comparti in cui possono verificarsi interazioni proteina-proteina a livello subcellulare. Poiché la divisione cellulare asimmetrica (ACD) mantiene staminali popolazione cellulare durante la generazione di nuovi tipi di cellule per la formazione del tessuto / organo, è un meccanismo indispensabile per promuovere multicellularità eucarioti. Arabidopsis sviluppo degli stomi è stato utilizzato come sistema modello per lo studio ACD nelle piante. La cellula precursore, cellula madre meristemoid, divide in modo asimmetrico per produrre due differenti cellule figlie, una meristemoid (subisce staminali divisioni cellulari come prima di terminare in un paio di cellule di guardia) e una cella stomatica lignaggio terra (SLGC) (può dividersi e differenziarsi in una cella marciapiede), rispettivamente (Figura 1). In stomatal ACD, la rottura nuova proteina di asimmetria nel lignaggio stomatica (BASL) è polarizzato premitotically guidare asimmetrie divisione, che incLude asimmetria fisica e il destino delle cellule asimmetria 1. Una cascata MAPK composto dal MAPKKK Yoda e le MAPKs, MPK3 e 6 è centrale per la divisione degli stomi patterning e l&#39;adozione destino 2,3, 4,5. Recentemente, Zhang et al. collegato la proteina BASL polarità della via di segnalazione YDA-MAPK in Arabidopsis stomi ACD 6. Il percorso canonico YODA-MAPK, attraverso MPK3 / 6, fosforila BASL e attiva la sua polarizzazione. Funzioni BASL fosforilata da impalcatura e recluta YODA (YDA) e MPK3 / 6 per formare un complesso proteico e concentrano la segnalazione alla corteccia cellulare 6. Polarizzazione dei componenti MAPK e l&#39;anello di retroazione positiva tra BASL e il percorso YDA-MAPK rappresenta un nuovo meccanismo per la polarizzazione delle proteine ​​nelle cellule vegetali. Segnalazione MAPK Localmente arricchita si ipotizza essere strettamente legata alla differenziazione destino della cellula in stomatica ACD 6 (Figura 1). Uno dei key dati sperimentali che ha sostenuto questo modello è venuto dai saggi di tabacco che hanno dimostrato la ridistribuzione spaziale di MAPK indotte mediante l&#39;espressione di BASL 6. In generale, non è facile controllare dove si verifica segnalazione MAPK perché molecole MAPK erano spesso trovano ovunque all&#39;interno di una cellula. In questo studio, abbiamo utilizzato il sistema split-YFP per visualizzare l&#39;interazione tra la chinasi monte e quelli a valle di suggerire dove avviene il relè di segnalazione. Abbiamo esteso ulteriormente l&#39;utilizzo del sistema BiFC dal co-esprimendo una terza proteina (PCP-tagged), con la scissione YFP due (suggestiva di interazione proteina-proteina) di visualizzare se e come il YFP integrata potrebbe essere spazialmente modulata dal co espresso proteina CFP. In questo modo, abbiamo dimostrato che la co-espressione di CFP-BASL indotta riorganizzazione spaziale delle interazioni tra YDA e MPK6, da una distribuzione uniforme di patterning polarizzato in corteccia cella del epidermide tabaccocellule al. Questo sistema ha quindi il potenziale per essere sviluppato per il monitoraggio di eventi di segnalazione dinamici in cellule vegetali, in condizioni in cui le cellule sono sfidati dagli stimoli interni o esterni (ad esempio, co-espressione di altre proteine, applicazione di prodotti chimici, di attacco patogeno o cambiamenti ambientali, ecc. ).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D/TOPO</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K2400-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit</td>
			<td>Agilent Technology</td>
			<td>200521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J106-2KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J673-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3632-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K4000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4014-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25x75mm Slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24x50 mm Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td>&#160;LAS AF Lite software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 x objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HCX&#160;Plan APO&#160;</td>
			<td>HCX&#160;Plan APO&#160;, NA 1.30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SORVALL 6+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml falcon tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 5 Forceps</td>
			<td>Canemco &#38; Marivac</td>
			<td>205EQA-Spec</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging spatial reorganization of a mapk signaling pathway using the tobacco transient expression system

Visualizzazione di eventi di segnalazione dinamici in cellule vive è stata una sfida. Abbiamo ampliato un sistema di espressione transiente stabilito, il biomolecolare complementazione fluorescenza (BiFC) test in cellule epidermiche tabacco, dall&#39;interazione test proteina-proteina per monitorare la distribuzione spaziale della trasduzione del segnale nelle cellule vegetali. In questo protocollo, abbiamo utilizzato il test BiFC per dimostrare che l&#39;interazione e la segnalazione tra la Arabidopsis MAPKKK Yoda e MAPK6 si verificano a livello della membrana plasmatica. Quando il BASL proteina scaffold è stato co-espresso, l&#39;interazione YODA-MAPK ridistribuita e spazialmente co-polarizzato con CFP-BASL. Questo sistema di espressione del tabacco modificato consente per l&#39;esame rapido di segnalazione di localizzazione e dinamici cambiamenti (meno di 4 giorni) e in grado di ospitare più di colori proteina fluorescente (almeno tre). Abbiamo anche presentato metodi dettagliati per quantificare la distribuzione delle proteine ​​(localizzazione spaziale asimmetrica, o &quot;polarizzazione&quot;;) In cellule di tabacco. Questo avanzato sistema di espressione del tabacco ha un potenziale per essere utilizzato ampiamente per il test rapido di eventi di segnalazione dinamici in cellule vegetali dal vivo.

Per prevenire la morte cellulare indotta dalla segnalazione MAPK iperattivo, le chinasi versioni inattive di YDA (DNyda) e MPK6 (DNmpk6) sono stati utilizzati nel saggio di co-espressione in cellule di tabacco. Né l&#39;interazione tra DNyda e DNmpk6 rivelato da BiFC né CFP-BASL stesso generato modello di distribuzione non uniforme (Figura 3A-B). Tuttavia, quando CFP-BASL stato introdotto nella coppia interazione DNyda-DNmpk6, sia CFP e YFP segnali sono stati ridistrib...

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Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Imaging Riorganizzazione spaziale di una via di segnalazione MAPK Utilizzando il sistema transitorio Expression Tabacco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

The overall goal of this procedure is to visualize dynamic spatial distribution of protein

imaging-spatial-reorganization-mapk-signaling-pathway-using-tobacco

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Views.  Rutgers, The State University of New Jersey. The overall goal of this procedure is to visualize dynamic spatial distribution of protein