Name: imaging spatial reorganization of a mapk signaling pathway using the tobacco transient expression system
Uploaded: 2016-03-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
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We thank Yumeng (Helen) Xia (Rutgers University) for manuscript editing. The work on BASL polarity formation is supported by grants from the U.S. National Institute of General Medical Sciences to J.D. (R01GM109080) and Rutgers University.

1.プラスミド構築<ol><li>以前に1,6に記載されているような技術をクローニングすることによって構築物を生成します。 <ol><li>最初BASLのコード配列を増幅するために適切なプライマーを用いた高忠実度DNAポリメラーゼを使用し、YDAとMPK6とエントリーベクターにそれらをサブクローン。 7での詳細なプロトコルを検索します。 </li><li> MPK6とYDAのドミナントネガティブバージョン（DNmpk6 8とDNyda 4、それぞれ）を生成するには、テンプレートとしてMPK6とYDAのエントリープラスミドを使用して、部位特異的突然変異誘発法9により、点変異を導入します。 </li></ol></li><li>タバコ一過性アッセイのための構築物を構築するには、pH35CG 10にBASLを統合するために、標準的なLR（attL部位のx attRの組換え）の反応（7における詳細な手順を）行い、pXNGWとpXCGWにDNydaとDNmpk6はそれぞれ、11ベクトル 。 <ol><li>酵素消化と配列決定によって得られたプラスミドを確認してください。一度です3日- uccessful、GV3101 12株と2 28℃で選択プレート上で生育するアグロバクテリウム・ツメファシエンスにバイナリー構築物を形質転換します。 </li></ol></li></ol> アグロバクテリウム浸潤液の調製<ol><li>構築pH35CG、pXNGWとpXCGW用を100μg/ mlのルリア-ベルターニ（LB）適切な抗生物質を含む培地10mlに、いくつかの新たに形質転換されたアグロバクテリウムのコロニーを接種する（ゲンタマイシンを25μg/ mlで、リファマイシンを25μg/ mlで、スペクチノマイシン、同じ濃度P19のためのカナマイシンを50μg/ mlのゲンタマイシン及びリファマイシン（トランスジェニックサイレンシングに対してタンパク質を発現する）13の。 </li><li>約16時間、200回転の速度で28℃のシェーカーでアグロバクテリウム培養液を成長した後、OD 600（1.5達する見込み- 1.8）を測定する（ 図2A-B）を 。 10分間、2500×gでの文化をスピンダウン。再懸濁し、WAMgCl 2 10mMの（浸透液）で細胞ペレットをshに。 </li><li>最終OD 600 = 0.5（ 図 2C-D）に到達するために、再度の文化をスピンダウンし、浸透液の適切な量の再懸濁ペレット。 3時間 - 植物を浸潤する前に、1、室温での細胞の混合物を残します。この工程は、細胞の恒常性を維持するのに役立ちます。 </li></ol> 3.タバコ工場、リーフ・インジェクション<ol><li>葉注射のために（16時間光/ 8時間暗のサイクルで23°C）標準植物成長チャンバー内で5週齢の14から4成長タバコ植物（ ベンサミアナタバコ）を 、使用してください。 注：この段階では、タバコ植物は、典型的には6葉（2大、2培地、および2小）を有します。 2中型の葉は葉の注入（二つの小さなものは、多くの場合、あまりにも若いうち二つの大きなものは、あまりにも古いです）のために最も最適です。 </li><li>浸潤の日の前に、水tobac共同植物は土壌を飽和させます。 </li><li> 3時間 - 浸潤の日に、1のために暗闇の中で植物をプレインキュベートします。このステップでは、葉の表皮細胞内に浸透するとき大幅にアグロバクテリウムを容易にする、表皮内の気孔が広く開くことができます。 </li><li>日付で標識された色のテープを使用して、潜入する葉にフラグを設定。マーク黒の太いシャーピーで浸潤する分野（オプション;浸透した領域が感染された後に表示されています。）。 </li><li> アグロバクテリウムの再懸濁液の等しい体積を取り、穏やかに旋回（ 図2E）によって100×15ミリメートルペトリ皿にそれらを混ぜます。注：私たちのケースでは、我々はDNmpk-cYFPのCFP-BASLの1ミリリットル、DNyda-nYFPの1ミリリットルと1ミリリットルでのp19の1ミリリットルを混合しました。 </li><li>浸潤の過程では、浸潤混合物で3ミリリットルの無針注射器を埋める（1〜2ミリリットル）およびタバコの葉の下側（背軸）（ 図2F）に押し込みます。浸潤が、それは便利ですプッシュする一方の手を使用すると、他の手は優しく（押圧力に抗して、向軸）上側をサポートします。 注：浸潤混合物が正常に注入されると、感染した領域は表皮に容易に認識になります。しかし、浸潤が原因で、過酷な注入（組織損傷）又は不十分なプッシュ（無液体の浸透）に失敗することがあります。各試験のために、我々は、（異なる植物からの）は、2つの独立した葉の中の少なくとも2回の注射を示唆しています。 </li><li>バック成長チャンバ内に感染した植物を置きます。一般的に、タンパク質発現は、浸潤、次の48時間後に検出可能です。 </li></ol> 4.共焦点イメージング<ol><li> （ - 4ディスク/領域を製造することができる通常3）（ 図2G）48時間後の浸潤では、注入された領域からリーフディスクを切除するために穴パンチャーを使用します。静かにスライド（上向きの背軸側）にリーフディスクを転送し、水滴でそれらをマウントするためにピンセットを使用してください。あまりにもHAR押す避けてくださいカバースリップ上のdが絞ら/損傷を受けた細胞は、共焦点顕微鏡（ 図2H）の下でうまく表示されませんので。 </li><li>共焦点イメージングの前に、発現レベルを確認するために、エピ蛍光化合物顕微鏡に搭載されたサンプルをスキャンします。注意：私たちの経験に基づいて、中間の発現レベルを示す細胞が最高の共焦点顕微鏡下で表現されます。 </li><li>共焦点顕微鏡上の40X（NA 1.3）レンズを開始します。蛍光タンパク質の培地レベルを発現する細胞が中心に残るように任意の位置にスライドを調整します。それぞれ540 nmの、 - 500 nmおよび514 nmの/ 520 - CFPとYFPの励起/発光スペクトルは、458nmで/ 480です。 </li><li>レーザー強度と最もバランスのとれた蛍光強度/ノイズ比のためのスマートゲインを調整後、画像をプレビューする「ライブ」ボタンを有効にします。結像品質を改善するために、走査画素および/またはフレーム/ライン平均値を増加させます。最後に、REAに焦点調節ノブを調整chの中央値は焦点面とは、画像を撮影するために、「取得」をクリックします。 注：CFPとYFPの画像は、それぞれ、「順次」走査モードのオプションをオンまたはオフチェックすることにより、連続的にまたは同時に捕捉することができます。 </li><li> Z投影が「XYZ」の撮影モードを選択し、セルの詳細なビューのために所望される場合、走査範囲の深さを定義する（10 - は15μm）にし、標的細胞の上から下へ画像を収集。 .TIFFファイルとして選択し、「名前の変更」に画像ファイルを右クリックして、ライカのソフトウェアで得られた画像をコンパイルし、輸出画像。 </li><li>画像30 - 定量分析のための40の細胞。 </li></ol> 5.画像処理および定量分析<ol><li>画像を処理し、定量を行うためにフィジーソフトウェア（http://fiji.sc/Fiji）を使用します。 <ol><li>蛍光強度のグラフをプロットします。 <ol><li>より良いCFP / YFPの発現があるかどうかを視覚化するために、均一に分布し、細胞周囲に沿ってCFPとYFPの信号強度を示すためにフィジーを使用しています。これを達成するために、最初のイメージを起動するには「ファイル」と「開く」を選択し、フィジーを起動します。ツールメニューの「行」をクリックし、右クリックして「セグメント化された行」を選択します。関心領域を決定し、CFPまたはYFP信号（ 図3A-C）をトレースする細胞周辺に沿って線を引きます。 注：フィジーは、セグメント化された線に沿って、絶対蛍光強度値を測定します。 </li><li>セグメント化された線に沿ってCFP / YFPのレベルを表す位置と強度値でグラフを生成するには、ドロップダウンメニュー「分析」と「プロット・プロファイル」を選択します。必要であれば、同等の強度のグラフを生成するために、Excelや他のグラフィックソフトに（メニュー「コピー」を選択することで）強度値を複製します。 </li></ol></li><li>極性の程度を定量化。 <ol><li>約20 represenを収集3回の反復実験からtative細胞はタバコ細胞でのCFPとYFPの極性度を評価しました。 （Lとして定義される）低い蛍光強度を超える（Hとして定義される）高い蛍光強度の比に基づいて、極性度を計算します。注：定量方法は、図3で説明されています。 <ol><li> HとLの値を測定するには、「測定」をドロップダウンメニューから「分析」して、[選択]をクリックし、（上記の）細胞周辺での関心領域に沿ってセグメント化された線を引きます。 「結果」ウィンドウがポップアップ表示された場合、値が定量化を行うために「平均」を使用します。 </li><li> CFPとYFPの比較的均一な発現を示す細胞から、 例えば 、CFP-BASL（ 図3A）またはYFPがDNyda-nYFPとDNmpk6-cYFP（ 図3B）の共発現から補完、測定することにより、HとLの値を取得2はランダムに同じ長さで、周辺のセグメントを選択しました。 </li> &lt;李&gt;は、この場合には、蛍光タンパク質の明白な極性蓄積を示す細胞から、CFP-BASL、DNyda-nYFPとDNmpk6-cYFP（ 図3C）、の共発現は、濃縮された蛍光信号と周辺領域からH値を収集しますおよび低/無蛍光の蓄積と地域からLsを。 </li><li> 20細胞を一緒正規分布のための試験からのH / Lの結果の比率をプール。 （正規分布の場合） スチューデントのt検定によりp値または（非正規分布の場合）コルモゴロフ-スミルノフ（KS）テストを計算します。 </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

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	<li>Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BASL+controls+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis.">BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis.</a> Cell. 137, 1320-1330 (2009).</li><li>Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAPKK+kinase+gene+regulates+extra-embryonic+cell+fate+in+Arabidopsis.">A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis.</a> Cell. 116, 109-119 (2004).</li><li>Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. 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U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+stomatal+meristemoids+reveals+new+component+of+asymmetric+cell+division+and+commonalities+among+stem+cell+populations+in+Arabidopsis.">Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).</li><li>Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRX+mediates+feedback+between+brassinosteroid+levels+and+auxin+signalling+in+root+growth.">BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth.</a> Nature. 443, 458-461 (2006).</li></ol>

利害の衝突が宣言されていません。

一般的な使用およびシグナル伝達のためのタバコ一過性発現系の可能な修正：蛍光タンパク質の過剰発現（FP）が正常に植物細胞内でタンパク質の細胞内局在の高速検査に使用されてきたタバコの表皮中のタンパク質をタグ付き。しかし、 植物体中のタンパク質複合体の動的シグナリング分布を研究することは、複雑な細胞内のコンテキスト、一過性のタンパク質-タンパ...

タンパク質は、予測不可能な細胞環境で発生するほぼすべての生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たして複雑な階層型ネットワークとフォーム複合体内で相互作用します。しかし、成長の応答に対する植物の開発から、だけですぐにも効率的に細胞内レベルでこれらのダイナミックシグナル伝達事象を認識し、モニターすることができない便利なツールの欠如がありました。 タバコ葉表皮における一過性タンパク質発現システムは、生細胞内で蛍光タンパク質を可視化するための利点を訴えています。このシステムは、翻訳後タンパク質修飾とタンパク質の局在の迅速な検査を可能にする半in vivoでの条件を提供します。補完YFP信号を検査することによって、二分子蛍光相補性（BIFC）アッセイは、植物細胞内でのタンパク質 - タンパク質相互作用の可能性を通知します。他の方法に比べて、 例えば、酵母2ハイブリッド（Y2H）と共同-immunoprecipitation（共同IP）、BIFCは、タンパク質 - タンパク質相互作用は、細胞内レベルで発生する可能性があるコンパートメントを可視化する強力な手段を提供します。 非対称細胞分裂（ACD）は、組織/器官の形成のための新たな細胞型の生成中に細胞集団を幹維持するので、真核多細胞を促進するために不可欠な機構である。 シロイヌナズナ気孔発生は、植物にACDを研究するためのモデルシステムとして用いられてきました。前駆細胞、メリステモイド母細胞は、二つの異なる娘細胞を生成するために非対称的に分割し、メリステモイドは（ガード細胞のペアに終了する前に、細胞様の分裂幹受ける）と気孔系統の地上セル（SLGC）は（分裂と分化することができます舗装細胞）、それぞれ（ 図1）。気孔ACDでは、気孔系統における非対称の新規タンパク質のブレイキング（BASL）は分割非対称性を駆動するためにpremitotically偏光されて、どの株式会社リュド物理的な非対称性および細胞運命非対称性1。 MAPKKK YODAとのMAPK、MPK3と6から成るMAPKカスケードは、気孔分割パターニングと運命の採用2,3、4,5のための中心です。 最近、Zhang ら 。 ACD 6気孔シロイヌナズナのYDA-MAPKシグナル伝達経路への極性タンパク質BASLをリンクされています。標準的なYODA-MAPK経路は、MPK3 / 6を通じて、BASLをリン酸化し、その偏光を活性化させます。足場としてリン酸化BASL機能やタンパク質複合体を形成し、細胞表層6でシグナリングを集中するYODA（YDA）とMPK3 / 6を募集しています。 MAPKコンポーネントとBASLとYDA-MAPK経路の間に正のフィードバックループの偏光は、植物細胞中のタンパク質の偏光のための新規メカニズムを表します。局所的に濃縮されたMAPKシグナル伝達は密接に気孔ACD 6（ 図1）における細胞運命の分化にリンクされると仮定されています。 kの一つこのモデルをサポートEY実験データがBASL 6の発現により誘導されたMAPKの空間的な再分配を実証したタバコアッセイから来ました。 MAPK分子は、しばしば、細胞の内部にどこでも発見されたため、MAPKシグナル伝達が起こる場合、一般的には、監視することは容易ではありません。本研究では、シグナリングリレーが発生する場所を示唆するために、上流キナーゼおよび下流のものとの間の相互作用を可視化するために、分割YFPシステムを利用しました。我々はさらに、どのように補完YFPが空間的に共同によって変調することができるかどうかを可視化する（タンパク質 - タンパク質相互作用を示唆する）、分割YFPペアと第3のタンパク質を（CFPタグ付き）を共発現することによりBIFCシステムの使用を拡張しましたCFPタンパク質を発現しました。そうすることによって、我々はタバコ表皮の細胞表層で偏パターニングに均一な分布からYDAとMPK6、間の相互作用の空間的な再編成を誘導されたCFP-BASLの共発現を示しましたら細胞。このシステムは、したがって、細胞は、内部または外部刺激（ 例えば、他のタンパク質の同時発現、化学的応用、病原体攻撃または環境の変化などによりチャレンジされたときの条件の下で、植物細胞中で動的シグナル伝達事象を監視するために開発される可能性があります。 ）。

<table><tbody><tr><td>Phusion DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>pENTR/D/TOPO</td><td>Life Technologies</td><td>K2400-20</td><td></td></tr><tr><td>QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit</td><td>Agilent Technology</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>LB broth</td><td>AMRESCO</td><td>J106-2KG</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>AMRESCO</td><td>J673-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3632-1G</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501-1G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4000-25G</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4014-5G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 mm Slide</td><td>VWR</td><td>16004-382</td><td></td></tr><tr><td>24 x 50 mm Cover glass</td><td>VWR</td><td>48393-241</td><td></td></tr><tr><td>Laser scanning confocal microscope</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>TCS SP5 II</td><td>LAS AF Lite software</td></tr><tr><td>40X objective lens</td><td>Leica</td><td>HCX&amp;nbsp;Plan APO&amp;nbsp;</td><td>HCX&amp;nbsp;Plan APO, NA 1.30</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>SORVALL 6+</td><td></td></tr><tr><td>Hole puncher</td><td>Staples</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml falcon tubes</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-108</td><td></td></tr><tr><td>No. 5 Forceps</td><td>Canemco &amp;amp; Marivac</td><td>205EQA-Spec</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging spatial reorganization of a mapk signaling pathway using the tobacco transient expression system

生きた細胞内での動的なシグナル伝達イベントの可視化が課題でした。我々は、植物細胞内でのシグナル伝達の空間的な分布を監視するタンパク質 - タンパク質相互作用を試験から、タバコ表皮細胞における生体分子蛍光相補性（BIFC）アッセイを確立した一過性発現系を拡大しました。このプロトコルでは、我々は相互作用し、 シロイヌナズナ MAPKKK YODAとMAPK6との間のシグナリングは、原形質膜で起こることを示すためにBIFCアッセイを使用しました。足場タンパク質のBASLを共発現させた場合、YODA-MAPKの相互作用は、再分配と空間的にCFP-BASLとの共偏します。この修​​正されたタバコの発現システムは、ローカリゼーションおよび動的な変更（4日未満）と蛍光タンパク質の色（少なくとも3）の倍数に対応することができるシグナル伝達の迅速な検査を可能にします。我々はまた、タンパク質の分布（非対称の空間的局在性、または「分極」を定量化する詳細な方法を提示し;）タバコ細胞インチこの高度なタバコ発現系は、生植物細胞の動的シグナリング事象の迅速な試験のために広く使用される可能性を有しています。

過活動MAPKシグナル伝達によって誘導される細胞死を防止するために、YDA（DNyda）及びMPK6（DNmpk6）のキナーゼ不活性バージョンは、タバコ細胞における共発現アッセイに使用しました。 BIFCによって明らかになったDNydaとDNmpk6の間の相互作用も、CFP-BASL自体はいずれも、不均一な分布パターン（ 図3A-B）を生成しました。 CFP-BASLがDNyda-DNmpk6の相互作用ペアに?...

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Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

タバコ一過性発現系を使用したMAPKシグナル伝達経路の空間再編のイメージング

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

imaging-spatial-reorganization-mapk-signaling-pathway-using-tobacco

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K ビュー.  Rutgers, The State University of New Jersey. At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells. 

ビデオ: Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

遺伝学

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

ギブソンアセンブリと遺伝子銃を用いてタバコの一過性の遺伝子発現

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

環境学

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found overexpressed in many diseases, including cancer. TGF-&#946; is strongly implicated in metastasis during late stage cancer progression, activating a subset of migratory and invasive tumor cells. Current methods for signaling pathway analysis focus on endpoint models, which often attempt to measure signaling post-hoc of the biological event and do not reflect the progressive nature of the disease. Here, we demonstrate a novel adenovirus reporter system specific for the TGF-&#946;/Smad3 signaling pathway that can detect transcriptional activation in live cells. Utilizing an Ad-CAGA12-Td-Tom reporter, we can achieve a 100% infection rate of MDA-MB-231 cells within 24 h in vitro. The use of a fluorescent reporter allows for imaging of live single cells in real-time with direct identification of transcriptionally active cells. Stimulation of infected cells with TGF-&#946; displays only a subset of cells that are transcriptionally active and involved in specific biological functions. This approach allows for high specificity and sensitivity at a single cell level to enhance understanding of biological functions related to TGF-&#946; signaling in vitro. Smad3 transcriptional activity can also be reported in vivo in real-time through the application of an Ad-CAGA12-Luc reporter. Ad-CAGA12-Luc can be measured in the same manner as traditional stably transfected luciferase cell lines. Smad3 transcriptional activity of cells implanted in vivo can be analyzed through conventional IVIS imaging and monitored live during tumor progression, providing unique insight into the dynamics of the TGF-&#946; signaling pathway. Our protocol describes an advantageous reporter delivery system allowing for quick high-throughput imaging of live cell signaling pathways both in vitro and in vivo. This method can be expanded to a range of image based assays and presents as a sensitive and reproducible approach for both basic biology and therapeutic development.

Here, we present a protocol for live cell imaging of TGF-&#946;/Smad3 signaling activity using an adenovirus reporter system. This system tracks transcriptional activity in real-time and can be applied to both single cells in vitro and in live animalmodels.

TGF-β/Smad3 シグナリング経路の in VitroおよびIn Vivoアデノ ウイルス レポーター システムを使用しての細胞イメージングをライブします。

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

がん研究

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to possess medicinally relevant biological activity. However, thus far this potential has not translated into a plethora of triterpene-derived drugs in the clinic. This is arguably (at least partially) a consequence of limited practical synthetic access to this class of compound, a problem that can stifle the exploration of structure-activity relationships and development of lead candidates by traditional medicinal chemistry workflows. Despite their immense diversity, triterpenes are all derived from a single linear precursor, 2,3-oxidosqualene. Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in N. benthamiana can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products that are not naturally produced by this host. Agro-infiltration is an efficient and simple means of achieving transient expression in N. benthamiana. The process involves infiltration of plant leaves with a suspension of Agrobacterium tumefaciens carrying the expression construct(s) of interest. Co-infiltration of an additional A. tumefaciens strain carrying an expression construct encoding an enzyme that boosts precursor supply significantly increases yields. After a period of five days, the infiltrated leaf material can be harvested and processed to extract and isolate the resulting triterpene product(s). This is a process that is linearly and reliably scalable, simply by increasing the number of plants used in the experiment. Herein is described a protocol for rapid preparative-scale production of triterpenes utilizing this plant-based platform. The protocol utilizes an easily replicable vacuum infiltration apparatus, which allows the simultaneous infiltration of up to four plants, enabling batch-wise infiltration of hundreds of plants in a short period of time.

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in Nicotiana benthamiana leaves can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products. Herein is described a detailed protocol for rapid (5 days) preparative-scale production of triterpenes and analogs utilizing this powerful plant-based platform.

一過性発現タバコにおける葉トリテルペン用分取スケールで

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

生化学

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early embryonic development, kinase activity is highly dynamic and widespread across the embryo. Pharmacological and genetic approaches are commonly used to probe kinase activities. Unfortunately, it is challenging to achieve superior spatial and temporal resolution using these strategies. Furthermore, it is not feasible to control the kinase activity in a reversible fashion in live cells and multicellular organisms. Such a limitation remains a bottleneck for achieving a quantitative understanding of kinase activity during development and differentiation. This work presents an optogenetic strategy that takes advantage of a bicistronic system containing photoactivatable proteins Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) and the N-terminal domain of cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix (CIBN). Reversible activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway is achieved through light-mediated protein translocation in live cells. This approach can be applied to mammalian cell cultures and live vertebrate embryos. This bicistronic system can be generalized to control the activity of other kinases with similar activation mechanisms and can be applied to other model systems.

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

This protocol describes an optogenetic strategy to modulate mitogen-activated protein kinase (MAPK) activity during cell differentiation and Xenopus embryonic development. This method allows for the reversible activation of the MAPK signaling pathway in mammalian cell culture and in multicellular live organisms, like Xenopus embryos, with high spatial and temporal resolution.

細胞分化中のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路の光媒介可逆的調節<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚発生

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

発生生物学

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent proteins and generation of fluorescent fusion proteins have been wildly used as an effective tool to directly visualize the protein localization and dynamics in cells. It is especially useful to compare them with well-known organelle markers after co-expression with the protein of interest. Nevertheless, classical approaches for protein co-expression in plants usually involve multiple independent expression plasmids, and therefore have drawbacks that include low co-expression efficiency, expression-level variation, and high time expenditure in genetic crossing and screening. In this study, we describe a robust and novel method for co-expression of multiple chimeric fluorescent proteins in plants. It overcomes the limitations of the conventional methods by using a single expression vector that is composed of multiple semi-independent expressing cassettes. Each protein expression cassette contains its own functional protein expression elements, and therefore it can be flexibly adjusted to meet diverse expression demand. Also, it is easy and convenient to perform the assembly and manipulation of DNA fragments in the expression plasmid by using an optimized one-step reaction without additional digestion and ligation steps. Furthermore, it is fully compatible with current fluorescent protein derived bio-imaging technologies and applications, such as FRET and BiFC. As a validation of the method, we employed this new system to co-express fluorescently fused vacuolar sorting receptor and secretory carrier membrane proteins. The results show that their perspective subcellular localizations are the same as in previous studies by both transient expression and genetic transformation in plants.

We have developed a novel method for co-expressing multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants to overcome the difficulties of conventional methods. It takes advantage of using a single expression plasmid that contains multiple functionally independent protein expressing cassettes to achieve protein co-expression.

植物の効率的な方法で複数のキメラ蛍光融合タンパク質の共発現

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

化学

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

シングル酵母細胞中のMAPK誘導発現の時間的な定量

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

生物学

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by crossing the &#39;Tet-On&#39; system oTet-Cre mouse with a novel reverse tetracycline transactivator (rtTA) transgene linked to the Tert promoter, which we have demonstrated marks a novel population of adult brain stem cells. Here, administration of the tetracycline derivative doxycycline to mTert-rtTA::oTet-Cre mice will indelibly mark a population of cells that express a 4.4 kb fragment of the promoter region of the gene Tert. When combined the Rosa-mTmG reporter, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG mice will express membrane tdTomato (mTomato) until doxycycline treatment induces the replacement of mTomato expression with membrane EGFP (mGFP) in cells that also express Tert. Therefore, when these triple-transgenic lineage tracing mice receive doxycycline (the &#34;pulse&#34; period during which TERT expressing cells are marked), these cells will become indelibly marked mGFP+ cells, which can be tracked for any desirable amount of time after doxycycline removal (the &#34;chase&#34; period), even if Tert expression is subsequently lost. Brains are then perfusion-fixed and processed for immunofluorescence and other downstream applications in order to interpret changes to stem cell activation, proliferation, lineage commitment, migration to various brain niches, and differentiation to mature cell types. Using this system, any rtTA mouse can be mated to oTet-Cre and a Rosa reporter to conduct doxycycline-inducible &#34;pulse-chase&#34; lineage&#160;tracing experiments using markers of stem cells.

The ability to permanently mark stem cells and their progeny with a fluorophore using an inducible transgenic lineage tracing mouse line allows for spatial and temporal analysis of activation, proliferation, migration, and/or differentiation in vivo. Lineage tracing can reveal novel information about lineage commitment, response to intervention(s), and multipotency.

成体マウス脳における誘導性蛍光標識幹細胞の系統追跡

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

神経科学

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

シロイヌナズナの取付汎用性の高い方法は、生体のタイムラプス イメージングの葉します。

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

タバコ一過性発現系を使用したMAPKシグナル伝達経路の空間再編のイメージング

要約

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ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

ギブソンアセンブリと遺伝子銃を用いてタバコの一過性の遺伝子発現

TGF-β/Smad3 シグナリング経路の in VitroおよびIn Vivoアデノウイルスレポーターシステムを使用しての細胞イメージングをライブします。

一過性発現タバコにおける葉トリテルペン用分取スケールで

細胞分化中のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路の光媒介可逆的調節

植物の効率的な方法で複数のキメラ蛍光融合タンパク質の共発現

シングル酵母細胞中のMAPK誘導発現の時間的な定量

タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

成体マウス脳における誘導性蛍光標識幹細胞の系統追跡

シロイヌナズナの取付汎用性の高い方法は、生体のタイムラプスイメージングの葉します。

タバコ一過性発現系を使用したMAPKシグナル伝達経路の空間再編のイメージング

要約

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ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

ギブソンアセンブリと遺伝子銃を用いてタバコの一過性の遺伝子発現

TGF-β/Smad3 シグナリング経路の in VitroおよびIn Vivoアデノ ウイルス レポーター システムを使用しての細胞イメージングをライブします。

一過性発現タバコにおける葉トリテルペン用分取スケールで

細胞分化中のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路の光媒介可逆的調節

植物の効率的な方法で複数のキメラ蛍光融合タンパク質の共発現

シングル酵母細胞中のMAPK誘導発現の時間的な定量

タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

成体マウス脳における誘導性蛍光標識幹細胞の系統追跡

シロイヌナズナの取付汎用性の高い方法は、生体のタイムラプス イメージングの葉します。

TGF-β/Smad3 シグナリング経路の in VitroおよびIn Vivoアデノウイルスレポーターシステムを使用しての細胞イメージングをライブします。

シロイヌナズナの取付汎用性の高い方法は、生体のタイムラプスイメージングの葉します。