We thank Yumeng (Helen) Xia (Rutgers University) for manuscript editing. The work on BASL polarity formation is supported by grants from the U.S. National Institute of General Medical Sciences to J.D. (R01GM109080) and Rutgers University.

1. בניית פלסמיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור את המבנים באמצעות טכנולוגיית שיבוט כפי שתואר לעיל 1,6. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית להשתמש DNA פולימרז באיכות גבוהה עם פריימרים מתאימים כדי להגביר את רצפי הקידוד של בזל, Yda ו MPK6 ותת-לשכפל אותם וקטורי כניסה. מצא את הפרוטוקול המפורט ב -7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור את גרסאות שלילי דומיננטי של MPK6 ו Yda (DNmpk6 8 ו DNyda 4, בהתאמה), השתמש פלסמידים כניסת MPK6 ו Yda כתבנית ולהציג את מוטציות נקודתיות לפי שיטה מכוונת mutagenesis באתר 9. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבנות את המבנים עבור מבחני חולף טבק, לנהל תקן LR (רקומבינציה attL x ATTR) תגובות (נוהל מפורט ב 7) לשלב בזל לתוך pH35CG 10, DNyda ו DNmpk6 לתוך pXNGW ו pXCGW וקטורים 11, בהתאמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשר את פלסמידים כתוצאה ידי עיכול וסדר אנזים. ברגע זהuccessful, להפוך את המבנים בינארי לתוך Agrobacterium tumefaciens זן GV3101 12 ולגדל אותם על צלחות הבחירה ב 28 מעלות צלזיוס למשך 2 - 3 ימים. </li></ol></li></ol> 2. הכנת פתרון Agrobacterium הסתננות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבות Agrobacterium כמה שינו טרי לתוך 10 מ&quot;ל של לוריא- Bertani (LB) בינוני עם טיפול אנטיביוטי מתאים (gentamycin 25 מיקרוגרם / מ&quot;ל, Rifamycin 25 מיקרוגרם / מ&quot;ל, spectinomycin 100 מיקרוגרם / ml עבור pH35CG, pXNGW ו pXCGW בונה; הריכוזים אותו של gentamycin ו Rifamycin עם מיליליטר / מיקרוגרם 50 Kanamycin עבור P19 (לבטא חלבונים נגד השתקה מהונדסת) 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תרבויות Agrobacterium שייקר C 28 ° במהירות של 200 סל&quot;ד במשך כ -16 שעות ולאחר מכן למדוד את OD 600 (מוערך ל -1.5 - 1.8) (איור 2 א-ב). ספין למטה התרבויות ב 2500 XG במשך 10 דקות. Re- להשעות ו ווהsh את כדורי תא עם 10 מ&quot;מ של 2 MgCl (הפתרון הסתננות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה התרבויות שוב מחדש להשעות את הכדורים עם כמות מתאימה של הפתרון החדיר להגיע OD הסופי 600 = 0.5 (איור 2 ג-ד). לפני שחדר צמחים, לעזוב את תערובות תא בטמפרטורת החדר למשך 1 - 3 שעות. פעולה זו מסייעת לשמור על הומאוסטזיס תא. </li></ol> 3. צמח טבק ליף הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש צמחי טבק (ניקוטיאנה benthamiana), גדלו 4 - 5 שבועות בן בתא גידול צמחים סטנדרטי (23 ° C עם מחזורים של 16 שעות אור / 8 hr-כהה) 14 להזרקה עלה. הערה: בשלב זה, צמחי טבק בדרך כלל יש 6 עלים (2 גדולים, 2 בינוני, ו -2 קטנים). שני העלים והבינוניים הם האופטימליים ביותר להזרקת עלה (שני הגדולים הם זקנים מדי, בעוד שני הקטנים הם לעתים קרובות מדי צעירים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני יום הסתננות, להשקות את tobacצמחי שיתוף כדי להרוות את האדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום חדירה, טרום דגירה הצמחים בחושך במשך 1 - שעות 3. שלב זה מאפשר הפיוניות באפידרמיס לפתוח נרחב, אשר מאוד מקל על Agrobacterium כאשר חודר לתוך התאים באפידרמיס עלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קלטות צבע שכותרתו עם תאריכים, דגל העלים כדי להיות שחדר. סמן את האזורים המיועדים הסתננו עם לנוכל עבה שחור (אופציונלי; האזורים הסתננו גלויים לאחר להידבק.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח כמויות שוות של מחדש ההשעיה Agrobacterium ומערבבים אותם בצלחת 100 x 15 מ&quot;מ פטרי ידי מתערבל עדין (איור 2E). הערה: במקרה שלנו, ערבבנו 1 מ&quot;ל של P19 עם 1 מ&quot;ל של CFP-בזל, 1 מ&quot;ל של DNyda-nYFP ו 1 מ&quot;ל של DNmpk-cYFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתהליך של חדירה, למלא מזרק מחטים 3 מ&quot;ל עם תערובת חדירת (1 - 2 מ&quot;ל) ולדחוף לתוך הצד התחתון (abaxial) של העלה טבק (איור 2F). בעוד חדירה, זה מועילאחד להשתמש ביד לדחוף מצד שני לתמוך בצד העליון בעדינות (adaxial, מפני הכוח לדחוף). הערה: לאחר התערובת החדירה מוזרקת בהצלחה, האזורים הנגועים יהפכו קל לזיהוי באפידרמיס. עם זאת, החדירה עלולה להיכשל בשל הזרקה קשה (ניזק לרקמות) או לדחוף מספיק (אין חדירה נוזלית). עבור כל בדיקה, אנו מציעים לפחות שתי זריקות בשני עלים עצמאיים (מצמחים שונים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצמחים הנגועים בחזרה לתוך תא צמיחה. באופן כללי, ביטויי חלבון ניתנים לזיהוי לאחר החדירה הבאה 48 שעות. </li></ol> 4. הדמיה Confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעה 48 חדירת שעות שלאחר, להשתמש מחורר שיחתוך דיסק עלה מאזור מוזרק (בדרך כלל 3 - 4 דיסקים / שטח יכול להיות מיוצר) (איור 2G). להשתמש בפינצטה כדי להעביר את הדיסקים עלה בעדינות לשקופית (הצד abaxial כלפי מעלה) ואת הר אותם עם טיפות מים. הימנע לחיצה מדי הרד על להחליק את המכסה כי סחט / תאים פגומים לא להראות טוב תחת מיקרוסקופ confocal (איור 2H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הדמית confocal, לסרוק את הדגימות הרכובות על מיקרוסקופ מתחם עלית ניאון כדי לבדוק את רמות הביטוי. הערה: בהתבסס על הניסיון שלנו, התאים המציגים רמות ביטוי ביניים מיוצגים הטוב ביותר תחת מיקרוסקופ confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל עם עדשת 40X (NA 1.3) על מיקרוסקופ confocal. התאם את השקופית למיקום הרצוי כך תאי מבטאי רמות בינוניות של חלבון פלורסנט להישאר במרכז. ספקטרום עירור / פליטה עבור CFP ו YFP הם 458 ננומטר / 480 - 500 ננומטר ו 514 ננומטר / 520 - 540 ננומטר, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור &quot;החי&quot; כדי לצפות בתצוגה מקדימה של תמונות ולאחר מכן להתאים עוצמת ליזר ורווח חכם עבור היחס עוצם / רעש קרינה המאוזן ביותר. כדי לשפר את איכות הדמיה, להגדיל פיקסלים סריקה ו / או מסגרת / קו ממוצע. לבסוף, להתאים את כפתור המיקוד כדי Reach המטוס החציוני מוקדים ולחץ על &quot;לכיד&quot; לקחת את התמונה. הערה: CFP ותמונות YFP ניתן ללכוד ברצף או בו זמנית על ידי סימון או ביטול האפשרות של מצב סריקה &quot;עוקב&quot;, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הקרנת Z היא רצויה עבור התצוגה המעמיקה של התאים, בחר במצב הדמיה &quot;xyz&quot;, להגדיר את עומק טווח הסריקה (10 - 15 מיקרומטר) ולאסוף את התמונות מהחלק העליון לחלק התחתון של תא המטרה . לקמפל את התמונות המתקבלות עם התוכנה ליקה על ידי לחיצה ימנית על קובץ התמונה כדי לבחור &quot;שינוי שם&quot; ותמונות יצוא כקבצי .tiff. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה 30 - 40 תאים לניתוח כימות. </li></ol> עיבוד תמונה 5. וניתוח כימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת פיג&#39;י (http://fiji.sc/Fiji) כדי לעבד תמונות ולערוך כימות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שרטט את הגרפים עוצמת הקרינה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש טוב יותר אם ביטוי CFP / YFP הואמפוזרים באופן אחיד, להשתמש פיג&#39;י להפגין את עוצמת האות של CFP ו YFP לאורך הפריפריה התא. כדי להשיג זאת, הראשונה להשיק פיג&#39;י ולאחר מכן בחר &quot;קובץ&quot; ו &quot;פתח&quot; כדי להתחיל את התמונה. לחץ על &quot;קו&quot; בתפריט הכלי ובחר &quot;קו מקוטע&quot; על ידי לחיצה ימנית. החלט האזור של עניין ולשרטט קו לאורך בפריפריה התא להתחקות אחר CFP או האות YFP (איור 3A-C). הערה: פיג&#39;י מודד את ערך עוצמת קרינה המוחלט לאורך הקווים המפולחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את התפריט הנפתח &quot;נתח&quot; &quot;פרופיל מגרש&quot; כדי ליצור גרף עם ערכי מיקום ועצמה המייצגים את הרמות של CFP / YFP לאורך הקו המפולח. אם תרצה, לשכפל את ערכי העצמה (על ידי בחירה בתפריט &quot;העתק&quot;) לתוך Excel או תוכנה גרפית אחרת כדי ליצור גרפים עוצמים דומים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת תואר קוטביות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף כ 20 represenתאי tative מן 3 ניסויים לשכפל להעריך את מידת הקוטביות של CFP ו YFP בתאי טבק. חשב את מידת הקוטביות מבוססת על היחס בין עוצמת קרינה הגבוהה (מוגדר H) על עוצמת הקרינה הנמוכה (מוגדר L). הערה: שיטת כימות מוסברת באיור 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את ערכי H ו- L, למתוח קו מקוטע לאורך האזור המעוניין בשולי התא (כמתואר לעיל), לחץ על &quot;נתח&quot; מהתפריט הנפתח, ולאחר מכן בחר &quot;מדוד&quot;. כאשר &quot;תוצאות&quot; חלון צץ, להשתמש &quot;Mean&quot; ערכים לבצע כימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מן התאים המציגים ביטוי אחיד יחסית של CFP ו YFP, למשל, CFP-בזל (איור 3 א) או YFP השלים מתוך שיתוף-ביטוי DNyda-nYFP ו DNmpk6-cYFP (איור 3 ב) יש לקבל את ערכי H ו- L על ידי מדידת שני אקראי שנבחרו מגזרים היקפיים עם אורך שווה. </li> &lt;li&gt; מן התאים המציגים הצטברות הקוטב ברור של חלבוני ניאון, במקרה זה, את שיתוף ביטוי CFP-בזל, DNyda-nYFP ו DNmpk6-cYFP (איור 3 ג), לאסוף את ערכי H מאזורי הפריפריה עם אותות הקרינה מועשר ואת Ls מהאזורים עם נמוכה / לא הצטברות קרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פינת היחסים כתוצאה של H / L מ -20 תאים יחד ולבדוק עבור התפלגות נורמלית. חשב את ערכי p על ידי מבחן t של סטודנט (עבור התפלגות נורמלית) או מבחן קולמוגורוב-סמירנוב (KS) (לחלוקה הלא-נורמלי). </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BASL+controls+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis.">BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis.</a> Cell. 137, 1320-1330 (2009).</li><li>Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAPKK+kinase+gene+regulates+extra-embryonic+cell+fate+in+Arabidopsis.">A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis.</a> Cell. 116, 109-119 (2004).</li><li>Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+development+and+pattern+controlled+by+a+MAPKK+kinase.">Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase.</a> Science. 304, 1494-1497 (2004).</li><li>Lampard, G. R., Lukowitz, W., Ellis, B. E., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+and+expanded+roles+for+MAPK+signaling+in+Arabidopsis+stomatal+cell+fate+revealed+by+cell+type-specific+manipulations.">Novel and expanded roles for MAPK signaling in Arabidopsis stomatal cell fate revealed by cell type-specific manipulations.</a> Plant Cell. 21, 3506-3517 (2009).</li><li>Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+development+and+patterning+are+regulated+by+environmentally+responsive+mitogen-activated+protein+kinases+in+Arabidopsis.">Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 19, 63-73 (2007).</li><li>Zhang, Y., Wang, P., Shao, W., Zhu, J. K., Dong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BASL+Polarity+Protein+Controls+a+MAPK+Signaling+Feedback+Loop+in+Asymmetric+Cell+Division.">The BASL Polarity Protein Controls a MAPK Signaling Feedback Loop in Asymmetric Cell Division.</a> Dev Cell. 33, 136-149 (2015).</li><li>Xu, R., Li, Q. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+Streamline+cloning+of+genes+into+binary+vectors+in+Agrobacterium+via+the+Gateway(R)+TOPO+vector+system.">Protocol: Streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway(R) TOPO vector system.</a> Plant methods. 4, 4 (2008).</li><li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+evidence+that+the+Arabidopsis+MAP+kinase+MPK6+is+involved+in+anther,+inflorescence,+and+embryo+development.">Mutational evidence that the Arabidopsis MAP kinase MPK6 is involved in anther, inflorescence, and embryo development.</a> J Exp Bot. 58, 2181-2191 (2007).</li><li>Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-mediated+site-directed+mutagenesis.">PCR-mediated site-directed mutagenesis.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 738-742 (2013).</li><li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation.">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes Dev. 19, 1855-1860 (2005).</li><li>Yuan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+regulation+of+transport+activity+by+heterotrimerization+of+Arabidopsis+ammonium+transporter+complexes+in+vivo.">Allosteric regulation of transport activity by heterotrimerization of Arabidopsis ammonium transporter complexes in vivo.</a> Plant Cell. 25, 974-984 (2013).</li><li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+agrobacterium+using+the+freeze-thaw+method.">Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method.</a> CSH protocols. 2006 (7), (2006).</li><li>Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+transient+expression+system+in+plants+based+on+suppression+of+gene+silencing+by+the+p19+protein+of+tomato+bushy+stunt+virus.">An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus.</a> Plant J. 33, 949-956 (2003).</li><li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+Arabidopsis+plants:+growth,+preservation+of+seeds,+transformation,+and+genetic+crosses.">Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses.</a> Methods in molecular biology. 1062, 3-25 (2014).</li><li>Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+polarity+signaling+in+Arabidopsis.">Cell polarity signaling in Arabidopsis.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 551-575 (2008).</li><li>Zhang, J., Nodzynski, T., Pencik, A., Rolcik, J., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIN+phosphorylation+is+sufficient+to+mediate+PIN+polarity+and+direct+auxin+transport.">PIN phosphorylation is sufficient to mediate PIN polarity and direct auxin transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 918-922 (2010).</li><li>Furutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar-localized+NPH3-like+proteins+regulate+polarity+and+endocytosis+of+PIN-FORMED+auxin+efflux+carriers.">Polar-localized NPH3-like proteins regulate polarity and endocytosis of PIN-FORMED auxin efflux carriers.</a> Development. 138, 2069-2078 (2011).</li><li>Takano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+localization+and+degradation+of+Arabidopsis+boron+transporters+through+distinct+trafficking+pathways.">Polar localization and degradation of Arabidopsis boron transporters through distinct trafficking pathways.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 5220-5225 (2010).</li><li>Truernit, E., Bauby, H., Belcram, K., Barthelemy, J., Palauqui, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OCTOPUS,+a+polarly+localised+membrane-associated+protein,+regulates+phloem+differentiation+entry+in+Arabidopsis+thaliana.">OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 139, 1306-1315 (2012).</li><li>Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+stomatal+meristemoids+reveals+new+component+of+asymmetric+cell+division+and+commonalities+among+stem+cell+populations+in+Arabidopsis.">Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).</li><li>Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRX+mediates+feedback+between+brassinosteroid+levels+and+auxin+signalling+in+root+growth.">BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth.</a> Nature. 443, 458-461 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

כללי גלישה ו שינויים אפשריים של מערכת הביטוי החולפת טבק התמר אות: התבטאות יתר של חלבון פלואורסצנטי (FP) -tagged חלבונים באפידרמיס הטבק שמש בהצלחה לבדיקה מהירה של לוקליזציה חלבון subcellular בתאי צמח. עם זאת, לומד הפצת איתות דינמית של מורכבות חלבון planta הוא נושא מאת...

חלבוני אינטראקציה בתוך מתחמי רשת טופס היררכיים מסובכים כי לשחק תפקיד מרכזי כמעט כל תהליכים ביולוגיים המתרחשים בסביבת הסלולר צפויה. עם זאת, מן התפתחות צמח לתגובות צמיחה, חל חוסר כלים נוחים שיכול לא רק במהירות אלא גם ביעילות לזהות ולנטר איתות אירועים אלה דינמיים ברמת subcellular. מערכת ביטוי חלבון החולפת באפידרמיס עלה טבק מושכת יתרונות המאפשר הדמית חלבוני ניאון בתאים חיים. מערכת זו מספקת למחצה בתנאי vivo המאפשרים שלאחר translational שינוי חלבון ובדיקה מהירה של לוקליזציה חלבון. על ידי בחינת אות YFP השלימה את השלמת פלורסנט bimolecular (BiFC) assay מודיע האפשרות של אינטראקציה בין חלבונים בתאי צמח. בהשוואה לשיטות אחרות, למשל, שמרים ושתיים היברידיים (Y2H) ושיתוף-immunoprecipitation (Co-IP), BiFC גם מספק אמצעי רב עוצמה של ביטוי חזותי תאים שבו אינטראקציות בין חלבונים עלולה להתרחש ברמה subcellular. בגלל חלוקת התא סימטרית (ACD) שומרת גזע אוכלוסיית תאים תוך יצירת סוגי תאים חדשים לייצור רקמות / איברים, זה מנגנון הכרחי לקידום רב-תאיות איקריוטיים. פיתוח הפיוניות ארבידופסיס נוצל בעבר כמערכת מודל לחקר ACD בצמחים. התא המבשר, התא האם meristemoid, מהחלק סימטרי לייצר שני לתאי בת אחרים, meristemoid (עובר גזע חטיבות דמויי תאים לפני הסיום לתוך זוג התאים שומרים) ו תא קרקע השושלת הפיוניות (SLGC) (עשוי להתחלק להתמיין תא מדרכה), בהתאמה (איור 1). בשנת הפיוניות ACD, שבירת חלבון הרומן של אסימטריה בשושלת הפיוניות (בזל) מקוטבת premitotically לנהוג סימטריות חלוקות, אשר incאסימטריה גופנית lude ואסימטריה תא גורל 1. אשד MAPK המורכב של תודה MAPKKK ואת MAPKs, MPK3 ו -6 הנו מכשיר מרכזי דפוסי חלוקת הפיוניות ואימוץ גורל 2,3, 4,5. לאחרונה, ג&#39;אנג et al. קשר בין בזל חלבון קוטביות אל מסלול איתות Yda-MAPK ארבידופסיס הפיוניות 6 ACD. מסלול יודה-MAPK הקנונית, דרך MPK3 / 6, phosphorylates בזל ומפעיל הקיטוב שלו. פונקציות בזל פוספורילציה כמו פיגום ומגייסת יודה (Yda) ו MPK3 / 6 להקים קומפלקס חלבון ולרכז את איתות לעבר התא בקליפת 6. קיטוב של רכיבים MAPK ואת לולאת המשוב החיובי בין בזל ואת מסלול Yda-MAPK מייצג מנגנון חדשני עבור קיטוב חלבון בתאי הצמח. מקומית איתות MAPK מועשרת שאמורות להיות קשורים קשר הדוק בידול גורל תא ב הפיוניות ACD 6 (איור 1). אחד kנתוני הניסוי EY שתמכו מודל זה בא מן מבחני טבק המצביעים על חלוקה מחדש של המרחב MAPKs המושרה על ידי ביטוי של בזל 6. באופן כללי, זה לא קל לעקוב אחר המקום שבו איתות MAPK מתרחשת משום מולקולות MAPK ולרוב מצאו מקום בתוך התא. במחקר זה, השתמשנו במערכת מפוצלת YFP לדמיין את האינטראקציה בין קינאז במעלה או במורד הזרם אלה להציע שבו ממסר איתות מתרחשת. בנוסף, אנו הרחבנו את השימוש במערכת BiFC ידי להביע שיתוף חלבון שלישי (CFP-tagged) עם זוג פיצול YFP (המרמז על אינטראקציה בין חלבונים) כדי לחזות האם וכיצד YFP השלים יכול להיות מווסת מרחבית על ידי השיתוף הביע חלבון CFP. בעשותם כך, הראינו כי שיתוף ביטוי של CFP-בזל המושרה מחדש המרחבי של אינטראקציות בין Yda ו MPK6, מן חלוקה שווה דפוסים מקוטב על קליפת התא של טבק epidermתאי al. מערכת זו ולכן יש פוטנציאל להתפתח לניטור אירועים איתות דינמי בתאי הצמח בתנאים כאשר תאים מאותגרים על ידי גירויים פנימיים או חיצוניים (כגון שיתוף ביטוי של חלבונים אחרים, יישום כימי, התקפה הפתוגן או שינויים סביבתיים, וכו &#39;. ).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D/TOPO</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K2400-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit</td>
			<td>Agilent Technology</td>
			<td>200521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J106-2KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J673-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3632-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K4000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4014-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25x75mm Slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24x50 mm Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td>&#160;LAS AF Lite software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 x objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HCX&#160;Plan APO&#160;</td>
			<td>HCX&#160;Plan APO&#160;, NA 1.30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SORVALL 6+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml falcon tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 5 Forceps</td>
			<td>Canemco &#38; Marivac</td>
			<td>205EQA-Spec</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging spatial reorganization of a mapk signaling pathway using the tobacco transient expression system

ויזואליזציה של אירועי איתות דינמיים בתאים חיים כבר אתגר. הרחבנו מערכת ביטוי חולף הוקמה, השלמה פלורסנט biomolecular (BiFC) assay בתאים אפידרמיס טבק, מאינטראקציה בין חלבונים בדיקות ניטור הפריסה המרחבית של הולכת אותות בתאי הצמח. בפרוטוקול זה, השתמשנו assay BiFC להראות כי האינטראקציה ואת האיתות בין יודה ארבידופסיס MAPKKK ו MAPK6 להתרחש קרום הפלזמה. כאשר בזל חלבון פיגום היה שיתוף הביע, האינטראקציה יודה-MAPK מחדש ושיתוף מקוטב מרחבית עם CFP-בזל. מערכת ביטוי טבק מהונדס זה מאפשרת בדיקה מהירה של איתות שינויי לוקליזציה ודינמית (פחות מ -4 ימים) והוא יכול להכיל מספר רב של צבעי חלבון פלואורסצנטי (לפחות שלוש). גם הצגנו שיטות מפורטות לכמת הפצת חלבון (לוקליזציה מרחבית סימטרית, או &quot;קיטוב&quot;;) בתאי טבק. יש מערכת ביטוי טבק מתקדמת זו יש פוטנציאל להיות בשימוש נרחב לבדיקה מהירה של אירועי איתות דינמיים בתאי צמח חיים.

כדי למנוע מוות של תאים המושרה על ידי איתות MAPK היפראקטיבי, הגרסאות פעיל קינאז של Yda (DNyda) ו MPK6 (DNmpk6) ששימשו assay שיתוף ביטוי בתאים טבק. לא האינטראקציה בין DNyda ו DNmpk6 נחשף על ידי BiFC ולא CFP-בזל עצמו שנוצר דפוס הפצה אחידה (איור 3A-B). עם זאת, כאשר CFP-בזל הוכנ...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System at JoVE.com

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

The overall goal of this procedure is to visualize dynamic spatial distribution of protein

imaging-spatial-reorganization-mapk-signaling-pathway-using-tobacco

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Views.  Rutgers, The State University of New Jersey. The overall goal of this procedure is to visualize dynamic spatial distribution of protein

Video: Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

שימוש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

שימוש מונה תא אוטומטי כדי לפשט את הביטוי מחקרים ג&#39;ין: siRNA מציאה הביטוי IL 4-Gene תלויים תאים Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

ויזואליזציה של Caenorhabditis elegans לציפורן מבנים באמצעות דיי ויטל lipophilic, DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

הדמית עבודה גבוהה תוכן ללמוד Grb2 מכלולי איתות על ידי שיבוט ביטוי

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration היעילה של צמחים לביטוי חולף ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטי

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

כימות זמניות של ביטוי MAPK מושרה בתאי שמרים יחיד

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

ביטוי חולף של חלבונים על ידי הידרודינמית ג&#39;ין משלוח בעכברים

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

מדידה של קצב חילוף החומרים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; באמצעות Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.