وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة منحة المشروع G0601253 إلى GSB ومراسلون بلا حدود ومنحة SULSA Bioskape إلى GSB

<ol>
	<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+organization+of+cutaneous+low-threshold+mechanosensory+neurons.">The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons.</a> Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).</li><li>Banks, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+modulation+of+synaptic-like+vesicle+recycling+in+mechanosensory+lanceolate+nerve+terminals+of+mammalian+hair+follicles.">Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles.</a> J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).</li><li>Andres, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+microstructure+of+receptors+on+sinus+hair.">On the microstructure of receptors on sinus hair.</a> Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 75, 339-365 (1966).</li><li>Shenton, F., Bewick, G. S., Banks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+expression+of+small+conductance+calcium-activated+potassium+channels+(SK1-3)+in+sensory+endings+of+muscle+spindles+and+lanceolate+endings+of+hair+follicles+in+the+rat.">A study of the expression of small conductance calcium-activated potassium channels (SK1-3) in sensory endings of muscle spindles and lanceolate endings of hair follicles in the rat.</a> PLoS One. 9, e107073 (2014).</li><li>Liley, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+spontaneous+activity+at+the+neuromuscular+junction+of+the+rat.">An investigation of spontaneous activity at the neuromuscular junction of the rat.</a> J. Physiol. 132 (3), 650-666 (1956).</li><li>Suzuki, M., Ebara, S., Koike, T., Tonomura, S., Kumamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+hair+follicles+are+innervated+by+one+afferent+axon?+A+confocal+microscopic+analysis+of+palisade+endings+in+the+auricular+skin+of+thy1-YFP+transgenic+mouse.">How many hair follicles are innervated by one afferent axon? A confocal microscopic analysis of palisade endings in the auricular skin of thy1-YFP transgenic mouse.</a> Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci. 88 (10), 583-595 (2012).</li><li>Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+fluorescent+staining+and+destaining+of+living+vertebrate+motor+nerve+terminals.">Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals.</a> J. Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).</li><li>Betz, W. J., Bewick, G. S., Ridge, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+movements+of+fluorescently+labeled+synaptic+vesicles+in+frog+motor+nerve+terminals+during+nerve+stimulation.">Intracellular movements of fluorescently labeled synaptic vesicles in frog motor nerve terminals during nerve stimulation.</a> Neuron. 9 (5), 805-813 (1992).</li><li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255 (5041), 200-203 (1992).</li><li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+monitoring+of+transmitter+release+and+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Optical monitoring of transmitter release and synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> J. Physiol. 460 (1), 287-309 (1993).</li><li>Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autogenic+modulation+of+mechanoreceptor+excitability+by+glutamate+release+from+synaptic-like+vesicles:+evidence+from+the+rat+muscle+spindle+primary+sensory+ending.">Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending.</a> J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).</li><li>Drew, L., Wood, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM1-43+is+a+permeant+blocker+of+mechanosensitive+ion+channels+in+sensory+neurons+and+inhibits+behavioural+responses+to+mechanical+stimuli.">FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli.</a> Molecular Pain. 3, (2007).</li><li>Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM1-43+reveals+membrane+recycling+in+adult+inner+hair+cells+of+the+mammalian+cochlea.">FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea.</a> J. Neurosci. 22 (10), 3939-3952 (2002).</li><li>Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+endocytosis+in+outer+hair+cells+of+the+mammalian+cochlea.">Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea.</a> Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).</li><li>Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gadolinium+and+FM1-43+as+blockers+of+stretch-evoked+firing+of+rat+muscle+spindle+afferents.">Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents.</a> Proc. Physiol. Soc. 21, P22 (2010).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Bewick وبيتز وضعت أصلا لN- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) البيريدينيوم ثنائي البروميد ذات الصلة الأصباغ styryl البيريدينيوم 7-10 لمراقبة إعادة التدوير المحلي للغشاء الحويصلة متشابك. صبغ امتصاص، وبالتالي زيادة مضان، وبالتالي يعكس متشابك استيعاب غشاء الحويصلة (الإلتقام). وفي وقت لاحق، وهذا صبغ المنضوية يمكن إعادة إصدارها من قبل المزيد من النشاط الكهربائي، والتي تبين فقدان الصبغة تراقب تخريج غشاء الحويصلة (إيماس). في نقاط الاشتباك العصبي، وهذا هو وكيل لإفراز الناقل العصبي. في نفس الوقت، كما وجدنا هذه الأصباغ علامة مميزة النهايات العصبية ميكانيكية حسية الابتدائية 7. وفي الآونة الأخيرة 11، Bewick، البنوك وزملاؤه ثم أظهر أن هذا يعكس عملية مماثلة في ناضجة، والمحطات ميكانيكية حسية متباينة خارج الحي. هنا مرة أخرى، والأصباغ بوسم 50 نانومتر قطر الحويصلات &quot;مثل متشابك&quot; (يتعامل هؤلاء الموردون) أن إعادة تدوير جوهري للافراج عن الغلوتامات.في محطات ميكانيكية حسية، على عكس نظرائهم متشابك، وهذا التدوير هو عفوية في المقام الأول. والتضمين أيضا من قبل الميكانيكية، بدلا من مجرد الكهربائي، التحفيز. لالخلايا العصبية الحسية في الثقافة وفي خلايا الشعر القوقعة، والأصباغ styryl بشكل عام وstyryl صبغ البيريدينيوم على وجه الخصوص وقد ثبت أن تمر عبر قنوات ميكانيكية حسية، ومنع القنوات ميكانيكية حسية وصفها بشكل لا رجعة فيه الأغشية الداخلية 12. ومع ذلك، في تركيزات styryl صبغ مماثلة في محطات ميكانيكية حسية متباينة في الموقع، وهنا في النهايات سناني الشكل 2، أو في نهايات الأول (أ) في مغزل العضلات 11، وفي خلايا الشعر التي لا يتم تحفيز ميكانيكيا 13 و 14 و وضع العلامات من قبل الإلتقام الغشاء. في النهايات العصبية ميكانيكية حسية، على سبيل المثال، وضع العلامات هو عكسها ولا يمنع الردود ميكانيكية حسية في التراكيز المستخدمة هنا 2، 11، 15. وفي حين أن بعض استيعاب صبغ من قبل تخلل قناة في هذه النهايات لا يمكن استبعاده تماما، ويزيل اللون شبه الكامل مع latrotoxin يشير إلى أن الغالبية العظمى من وضع العلامات في محطات الناضجة هي عن طريق استيعاب مع غشاء الحويصلة إعادة التدوير. لقد وبالتالي، وتستخدم هذه التقنية لدراسة اعتماد النشاط 11، ومؤخرا، والصيدلة 2 من إعادة التدوير السلفادور في المحطات وارد ميكانيكية حسية من خلال دراسة آثار المخدرات على امتصاص وإطلاق الأصباغ. كما هو الحال مع معظم التقنيات العملية، واستنساخ يتطلب التكرار والممارسة. سيتم الآن مناقشة بعض النقاط الرئيسية لضمان موثوقية. وضع العلامات سناني الشكل في الحيوانات الأصغر سنا هو أكثر موثوقية - وكان أصغر حيوان استخدمنا 15 غرام من وزن الجسم. وليس من الواضح تماما لماذا هذا هو الحال، ولكن قد يكون ذلك بسبب تشريح النسيج الضام الشابة يتطلب أقل الصدمات الميكانيكية ولوأفيس أقل المتبقية بقايا عند إزالة الأنسجة التي تغمر طبقة تعصيب. وعموما، فإن إعداد الأنسجة بسيط للغاية، مع تقشير طبقات الجلد عدا كونها الجانب العملي الأكثر تحديا تقنيا وبعد ذلك فقط في الفئران الأكبر سنا. في هذه، وطبقات الجلد تلتزم بقوة معا في القاعدة حيث يبدأ تشريح، ولكن حتى هنا الفصل بين طبقات يصبح أسهل بكثير نحو الهوامش. لحسن الحظ، أو ربما نتيجة لذلك، هذه مناطق الجلد هامشية أرق وعادة ما تعطي وصفها مرضية للغاية، وكذلك الجلد الأمامي بشكل عام. لذلك، لا سيما تجنب استيعاب الجلد رقيقة جدا في الهوامش. للحد من خطر تلف، والتعامل معها التحضيرات بشكل غير مباشر عن طريق دفع مع ملقط مغلقة بدلا من استيعاب مباشرة، أو إذا فهم أساسي الأنسجة فقط أكثر صرامة من غير المرجح أن يكون المسمى. كن دقيقا في إزالة طبقة &quot;ورقة البوليسترين&quot; المغطي على الفور المسام، وهذا هو لي الرئيسيانسداد chanical التصوير وصول المخدرات. ومع ذلك، فمن الضروري تقليل الاتصال الجسدي مع الهياكل الأساسية مثل هذا الضرر (أي تجرد بعيدا) والشبكات العصبية ومحطات أقل بقليل. إذا مضان السائد هو أصفر / أبيض في الغدد الدهنية، وبارز لصناعة السيارات في مضان من قواعد عمود الشعر وبعض أهلة برتقالي / أصفر النهايات سناني الشكل، وهذا يشير تم إزالة طبقة الضفيرة العصبية ومحطات سناني الشكل المقترنة أثناء إزالة. هذا ويبدو أن المشكلة الرئيسية مع كبار السن (&gt; 30 ز) الفئران. من خلال كافة الإجراءات تلطيخ، وضمان كل شيء عند 30 درجة مئوية والاوكسيجين بشكل جيد. كن على علم بأن المحطات وصفت لا تزال على قيد الحياة. ونتيجة لذلك، سوف تفرز الصبغة التي كتبها عفوية (التأسيسي) الإفراج exocytic مستمر. هذا وسوف يكون أبطأ في R / T، وإنما هو ممارسة جيدة للحد من التأخير بين إزالة حل خالب والتصوير، للحد من فقدان الصبغة. وعلاوة على ذلك، لمدة تتراوح بين الجماعات الصورة المقارنةtudies من شدة، فمن الضروري لضمان تمثيل جميع الفئات غير المطابقة للوقت. استخدام عامل صباغة مخلبية قبل التصوير يحسن إلى حد كبير على النقيض من الصورة. لذلك، في حين أن تكلفة نسبيا، فإن الخطوة عملية إزالة معدن ثقيل مهمة جدا لضمان جودة الصورة جيدة. استخدام خالب يمكن التقليل عن طريق إعادة استخدام الحل عدة مرات، وحتى على 2-3 أيام متتالية، إذا المخزنة في 4 درجات مئوية بين الاستخدامات. تجاهل الحل خالب بمجرد أن يذهب بشكل ملحوظ وردي، والتي تبين عزل صبغ بها تقترب من مستويات التشبع. أثناء التصوير، ويكون على بينة من احتمال حدوث ضرر الضوئي السمي لهذه المحطات الحية، وهي نتيجة تراكمية لكل من شدة ومدة التعرض للضوء الإثارة. وهذا الاعتبار هو أقل أهمية للصور timepoint واحد، حيث جودة الصورة هي الشغل الشاغل. ومع ذلك، فإنه من الأهمية بمكان أثناء التصوير تتكرر في دراسات حركية للحد من التعرض للضوء الإثارة إلى أدنى حد ممكن. في حين أن تطوير هذه الأصباغ لنقاط الاشتباك العصبي التسمية، وجدنا الإثارة ل&gt; 1 دقيقة في السلطة الكاملة الإثارة الإضاءة سوف يتسبب في ضرر لا يمكن إصلاحه مثيرة وإلى النهايات العصبية. لأول مرة في وقت لاحق توسيع بشكل كبير، ثم تنهار تماما على مدى فترة من ~ 15 دقيقة. نحن لم يختبر بشكل منهجي المساهمات النسبية من وقت التعرض وشدته، ولكن هذه الملاحظات تشير إلى أن المبدأ التوجيهي يجب أن يكون للحد من كليهما. لذلك، فمن المستحسن أن ضوء الإثارة كثافة ومدة هي الحد الأدنى يتناسب مع الحصول على صور جيدة، وتؤخذ الصور الرقابة المناسبة في الدراسات قتا بالطبع. لاختبار أن البيانات لا تتأثر الضيائية في ظل ظروف التصوير المتكررة، في كل نقطة زمنية التقاط صورة إضافية من محطة unviewed سابقا. هذا هو التأكد من سلوك وصفها في محطات ساذجة يشبه في بصيلات يجري تصويره مرارا وتكرارا. هناك عدد من العوامل يمكن أن تقلل من التباين داخل المجموعة من صافي كثافة دآتا. وضع دقيق للرويس، ولا سيما العائد على الاستثمار الخلفية، مهم، حتى مناطق صغيرة من تلطيخ غير مناسب يمكن أن تؤثر بشكل كبير بين-جراب تقلب البيانات. ويتأثر التغير في صافي كثافة أيضا كيف تماما المحاصرة كل بصيلات الشعر من جرف النهايات. مقارنة على سبيل المثال، على شكل هلال توزيع العلامات في الشكل 1B مع نمط تقريبا دائري تماما هو مبين في الشكل 2. المزيد تحليل مركب، ربما باستخدام برامج الكشف الآلي والعتبة والتي تكون ضرورية إذا كانت درجة تطويق معلمة ذات الصلة. يرجى ملاحظة أن توزع الكثافة حتى لجماعات بصيلات معظم تحليلها بدقة ليست موزعة بشكل طبيعي (انظر الشكل 3)، مما استلزم استخدام الإحصاءات غير المعلمية للمقارنات بين معاملة الوساطات السكان بدلا من الوسائل. تقنيات التطبيع، مثل التعبير عن شدة كنسبة مئوية من سيتم فرض رقابة F المقابل، أو وجود مجموعة مراقبة تتكون من عدة الاستعدادات، ويمكن تطبيقها للحد من زيادة التقلبات. البند الفني النهائي للنظر هو التصميم التجريبي لاختبار الدوائية. وخلال التحقيقات الدوائية، قبل احتضان إعداد في حل المخدرات لمدة 30 دقيقة قبل تطبيق الصبغة. ثم، والحفاظ على تركيز الدواء في محلول الصبغة. في الضوابط، استخدم إما مالحة أو، إذا تم حل المخدرات في سيارة، والمياه المالحة بالإضافة إلى السيارة. توضح هذه المادة كيف يقدم هذا المستحضر الصيوان جديد صور عالية الجودة من النهايات ميكانيكية حسية في الجلد مع الحد الأدنى من الإعداد. وتبين لنا أيضا أنها يمكن أن تستخدم لدراسة الصيدلة من عنصرين هامين لإعادة تدوير حويصلة. وتبين لنا أولا أن ناهض مستقبلات الغلوتامات يمكن أن تزيد استيعاب صبغ (علامة من الإلتقام)، والثانية، يتم فقدان الصبغة من جديد مع latrotoxin (منبه من إيماس). وتكمن أهمية هذا preparatأيون والتقنية هو أنه يوفر سهولة الوصول إلى الذين يعيشون الجلد محطات mechanosenory في الموقع لتجارب التصوير، وتكفل فرصا فريدة لرصد بصري وظيفة الطرفية والهيكل وعلاقتها ببعضها. تحقيقا لهذه الغاية الأخيرة، وقد وضعنا أيضا أكثر من ذلك لاستخدامها في دراسات مشتركة البصرية / الكهربية (انظر شقيقة المادة إن الرب لمزيد من التفاصيل).

النهايات العصبية ميكانيكية حسية وعادة ما تكون صغيرة، وزعت منتشرة ويصعب الوصول إليها في الموقع، وعادة ما يتم دفنها عميقا في الجلد أو الأنسجة المحيطة بها. تصور لهم، ولذلك عادة ما يتطلب باجتزاء تليها immunolabeling لفترة طويلة / فترة تلطيخ، أو التأخير وتكاليف الحصول على خطوط الفأر مع التعبير الجيني للتسميات فلوري مثل البروتين الفلوري الأخضر أو الأصفر (GFP / YFP) 1. نحن هنا تظهر الأنسجة مريحة وطريقة سريعة وبسيطة للوصول إلى أعداد كبيرة من afferents بصيلات الشعر للدراسة، وكيف يمكن أن توصف بسرعة للرصد البصري وظيفة محطة 2. مع الممارسة، ويمكن الانتهاء من تقنية كاملة من تشريح التصوير في اقل من 2 ساعة. محطات سناني الشكل من المحاور الحسية التعصيب بصيلات الشعر في الثدييات تشكل الحواجز حول ظهارة الشعر المسام، مع كلمحطة تقع بين الدبقية خلية / شوان العمليات 2-4. والغرض من هذه المحطات هو الكشف عن تشريد الميكانيكية من الشعر يحيطون. هم خليط من النهايات التكيف بسرعة وببطء، ولكنها تنتج في الغالب رشقات نارية قصيرة من النشاط في الاستجابة لحركة الشعر. عادة، يتوقف اطلاق النار بسرعة كبيرة عندما تتوقف الحركة، حتى في وجود استمر النزوح. هذا النموذج الصيوان الفئران لدراسة محطات سناني الشكل طريق وسائل بصرية لديها العديد من الميزات مفيدة لدراسة بنية ووظيفة هذه النهايات. الصيوان هو في الغالب طبقتين من الجلد الرئيسي يعارضها-العودة إلى الوراء، مع كمية صغيرة فقط من نسيج الغضروف بين. الجلد رقيقة جدا وتشريح بسهولة نظرا لكميات ضئيلة من النسيج الضام لاصقة ضعيفة بالنسبة إلى مناطق أخرى من الجسم. طبقات الجلد فصلها بسهولة، وبالتالي، تعطي سهولة الوصول إلى بصيلات والمحطات. تعصيبيمكن الوصول إليها بسهولة والتعرف. يتم توزيع بصيلات الشعر أكثر قليلة منه في مناطق الجلد الأخرى، وتسهيل التصوير من الأفراد أو الجماعات الصغيرة من المسام. طبقة الجلد الأساسية رقيقة يعطي الوصول جيدة لالأصباغ والأدوية الصيدلانية، وذلك هو المثل الأعلى للتصوير بواسطة المجهر مضان دون مزيد من المعالجة. التصوير من محطات المسمى إما أن تكون محطات الذين يعيشون أو، في حالة استخدام التناظرية صبغ قابل للتثبيت، بعد تثبيت ومزيد من المعالجة النسيجي. وقد استخدمنا هذا التحضير لإظهار أن الغشاء يحدث إعادة التدوير في النهايات سناني الشكل، يتضح من امتصاص (الإلتقام) وإطلاق (إيماس) من صبغة styryl البيريدينيوم (FM1-43؛ ن - (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) البيريدينيوم ثنائي البروميد). الصبغة لا، ومع ذلك، يبدو أن تسمية بشكل كبير خلايا شوان الاستثمار العمليات 2. أظهرنا أيضا أن هذه الصبغة امتصاص / الإفراج عنهم، وبالتالي غشاء صecycling، يخضع للتعديل glutamatergic من خلال شاذة (فسفوليباز يقترن D) metabotropic مستقبلات الغلوتامات. ويوضح نتائج التحفيز وتحليل بروتوكولات بسيطة، وتسليط الضوء على قضايا تحليل المحتملة المشتركة أيضا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1435">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PDMS - Sylgard 184</td>
			<td style="width:111px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:989px;">Flexible, inert, translucent solid silicone polymer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">No. 3 Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Austerlitz Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FM1-43/Synaptogreen C4</td>
			<td>Biotium/Cambridge Bioscience</td>
			<td>BT70020</td>
			<td>Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Advasep 7</td>
			<td>Biotium/Cambridge Bioscience</td>
			<td>BT70029</td>
			<td>A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (&#38; other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Retiga Exi Fast 1394</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td></td>
			<td>Monochrome, cooled CCD camera - basic model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Volocity 3D Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>Image capture and analysis software.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical monitoring of living nerve terminal labeling in hair follicle lanceolate endings of the ex vivo mouse ear skin

ووصف تشريح والتسجيل تقنية جديدة لتلطيخ الرصد البصري واجتثاث تلطيخ محطات سناني الشكل المحيطة بصيلات الشعر في الجلد من الصيوان الماوس. إعداد بسيط وسريع نسبيا، مما أسفر موثوق مناطق واسعة من وحدات المسمى متعددة من الذين يعيشون النهايات العصبية لدراسة امتصاص وإطلاق الأصباغ البيريدينيوم styryl تستخدم على نطاق واسع في الدراسات لإعادة تدوير حويصلة. تقسيم الاستعدادات قبل وضع العلامات يسمح اختبار مقابل مقارنات تحكم في نفس الأذن من فرد واحد. يتم إعطاء نصائح مفيدة لتحسين نوعية إعداد ووضع العلامات والمعلمات التصوير. هذا النظام الجديد هو مناسب لمعايرة دواء وامتصاص وإطلاق هذه الأصباغ الحيوية في محطات سناني الشكل في كل من النوع البري والحيوانات المعدلة وراثيا ميكانيكيا التي يسببها. وثمة أمثلة عن التأثيرات تغييري على وضع العلامات كثافة.

وينظر بصيلات الشعر في هذا الإعداد الصيوان بسهولة تحت تضوء دون مضان (الشكل 1A)، مما يدل على طبيعة ضئيلة للغاية من إعداد والسهولة النسبية في الحصول أنه يتيح لهذه المحطات ميكانيكية حسية. وتتميز كل من قاعدة عمود الشعر بارزة اختراق الهلال المظلم من الغدة الدهنية. تحت epifluorescence، محطات سناني الشكل المسمى المحيطة بكل بصيلات الشعر وينظر بشكل واضح وتظهر عادة قوية عفوية styryl صبغ امتصاص (الشكل 1B). يحدث هذا دون حركة المفروضة. وشهدت محطات سناني الشكل لتطويق عمود الشعر، وعلى الرغم من أن مدى تطويق هو متغير 6. الكثير من العلامات غير منقط (بقع) بدلا من الترتيب الخطي الذي كان متوقعا. ويعكس نمط منقط المحطات التي لوحظت في طائرة البصرية على طول المعبر. ثيالصورة إعداد تلقي أي مزيد من المعالجة لتصور بعد وضع العلامات، تم نقله ببساطة إلى مرحلة المجهر وتصويرها في الموقع، والذي يوضح مرة أخرى بساطة هذا المستحضر. مثال التجارب التي هذا المستحضر الجديد هو مناسبة في الشكل 3. ويمكن استخدامه لدراسة كل الإلتقام وإيماس في محطات المعيشة، وكذلك تعديل بهم. وهكذا، على الإلتقام، يمكن أن الغلوتامات منبهات مستقبلات زيادة كثافة العلامات، في حين وقف الكالسيوم 2+ قنوات مع بروابط أو الكاتيونات مثل المغنيسيوم 2+، ني 2+ أو الكادميوم 2+ يقلل النتيجة 2. بدلا من ذلك، هذا المستحضر يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة حركية إيماس، كما هو مبين في الشكل 3C. أولا، ينظر إلى محطة المسمى دي تلطيخ من تلقاء أنفسهم. ومع ذلك، هو تسارع هذا يزيل اللون من قبل منبه إيماس، latrotoxin. المزيد دي<html> ويمكن رؤية ذيول من النتائج التجريبية في البنوك، RW وآخرون. 2. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53855/53855fig1.jpg" /> الشكل 1. قوية Styryl صبغ وصفها المسجلة في بينا ماوس. (أ) الفصل من إعداد الصيوان الخالي من الملصقات في الإضاءة المجال مشرق، والتي تبين بوضوح كيف تظهر بصيلات الشعر في المناطق التي تم تطهيرها من المغطي الأنسجة الهالي / الدهنية. الظلام، الفص عادة، الأشكال الهلال هي الغدد الدهنية المحيطة رمح الشعر المركزي. (ب) منطقة مماثلة، في التكبير أعلى قليلا والتقط مع epifluorescence، والتي تبين النهايات سناني الشكل المسمى مع صبغة styryl. أشرطة النطاق - 40 ميكرون <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53855/53855fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <html> &quot;1&quot;&gt; <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/53855/53855fig2.jpg" /> الشكل 2. تحليل Styryl صبغ وصفها كثافة. (أ) نمط دائري نموذجي لوضع العلامات بصيلات الشعر مع صبغ styryl، تركزت على جذع الشعرة (غير مرئية في هذه الصورة). ويعرف (ب) تحليل الرئيسي &quot;المنطقة من الفوائد&quot; (ROI) من قبل بالطوق القياسية فرضه على موقف جرف من النهايات العصبية سناني الشكل تطويق المسام. يتم الاحتفاظ هذا العائد على الاستثمار المستمر في الشكل والمنطقة لأي تجربة واحدة لضمان وضع العلامات كثافة يمكن مقارنتها إلى حد ما بين التحضيرات وفي جميع العلاجات. يتم احتساب صافي كثافة كل العائد على الاستثمار عن طريق طرح قوة من المنطقة الخلفية مربعة أو دائرية المجاورة (~ 400 ميكرون 2). مرة أخرى، يتم الاحتفاظ هذه المنطقة الخلفية مربع المستمر في الشكل ومنطقة في جميع أنحاء أي تجربة معينة.الهدف = &quot;_ فارغة&quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53855/53855fig3.jpg" /> لا يتم توزيع الشكل 3. صفها كثافة الشعر المسام وارد Lanceloate النهايات عادة، ويمكن استخدامه لفحص كل من لانهائي وإيماس. البيانات النموذجية من قياسات كثافة styryl الصبغة في المحطات سناني الشكل المسمى بصورة تلقائية باستخدام أسلوب التحليل هو موضح أعلاه. (A) كثافة وصفها في ظل ظروف التحكم (54 جراب، 4 آذان) و1 الغلوتامات ملي (42 جراب، 4 آذان). يتم عرض القيم كثافة من النهايات الفردية والمؤامرات كتلة نقطة. وتمثل كل نقطة من شدة جرف محطة واحدة حول المسام. لاحظ أنه حتى في ظل ظروف سيطرة عدد قليل من نقاط البيانات (جراب) مكثفة للغاية، في حين تتجمع الأكثر عرضة للشدة أقل. النقطة الأولى في INTENS معينيتم رسم إيتي في المركز ويتم رسم نقاط البيانات اللاحقة من نفس كثافة تدريجيا أكثر إبداعا في أي من الجانبين. وبالتالي، يمثل انتشار الأفقي وتيرة بصيلات أي وضع العلامات كثافة معينة. خطوط أفقية تمثل متوسط ​​± 25٪ مجموعة الشرائح الربعية. الحضانة مع 1 ملم الغلوتامات تعزز كثافة وسيطة التي كتبها ~ 50٪ (*** P &lt;0.001، مان ويتني)، ولكن وضع العلامات يمكن أن تتعزز 200-300٪ في بعض المحطات. (ب) الصور يدل بوساطة الغلوتامات تعزيز الصبغة امتصاص (الإلتقام). حضانة إعداد بصيلات الشعر في الغلوتامات (1 ملم) يزيد بشكل ملحوظ styryl صبغ امتصاص، كما تجلى في زيادة كثافة العلامات. مقياس شريط 20 ميكرون. (ج) تعزيز الإفراج صبغ (إيماس). بعد وضع العلامات، وصبغ styryl صدر من تلقاء أنفسهم مرة أخرى، كما وصفها في 0 دقيقة أكثر إشراقا بشكل واضح مما كانت عليه في 60 دقيقة، حتى بعد الطرح الخلفية للسيطرة ل photobleaching. هذا الإصدار هو إلى حد كبير بوtentiated التي كتبها latrotoxin، وهي أرملة السوداء العنكبوت السم التأسيسية، التي يطلق غير المنضبط إيماس حويصلة. بعد 60 دقيقة في السم، ووضع العلامات محطة غير قابل للكشف تقريبا. هذه العودة إلى الوراء من العلامات styryl صبغ يدعم فرضية أن يرجع إلى استيعاب خلال إعادة التدوير المحلي للحويصلات تشبه متشابك مضان المحطة. مقياس شريط 20 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53855/53855fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin at JoVE.com

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

رصد بصري الأعصاب الطرفية المعيشة وصفها في الشعر المسام سناني الشكل النهايات لل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; ماوس الأذن الجلد

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

optical-monitoring-living-nerve-terminal-labeling-hair-follicle

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

7.4K Views.  University of Aberdeen. Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

Video: Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives from their characteristic apical bundle of stereocilia, a critical element for detection and transduction of sound energy 1. OHCs are able to change shape &#x2014;elongate, shorten and bend&#x2014; in response to electrical, mechanical and chemical stimulation, a motor response considered crucial for cochlear amplification of acoustic signals 2.
OHC stimulation induces two different motile responses: i) electromotility, a.k.a fast motility, changes in length in the microsecond range derived from electrically-driven conformational changes in motor proteins densely packed in OHC plasma membrane, and ii) slow motility, shape changes in the millisecond to seconds range involving cytoskeletal reorganization 2, 3. OHC bending is associated with electromotility, and result either from an asymmetric distribution of motor proteins in the lateral plasma membrane, or asymmetric electrical stimulation of those motor proteins (e.g., with an electrical field perpendicular to the long axis of the cells) 4. Mechanical and chemical stimuli induce essentially slow motile responses, even though changes in the ionic conditions of the cells and/or their environment can also stimulate the plasma membrane-embedded motor proteins 5, 6. Since OHC motile responses are an essential component of the cochlear amplifier, the qualitative and quantitative analysis of these motile responses at acoustic frequencies (roughly from 20 Hz to 20 kHz in humans) is a very important matter in the field of hearing research 7.
The development of new imaging technology combining high-speed videocameras, LED-based illumination systems, and sophisticated image analysis software now provides the ability to perform reliable qualitative and quantitative studies of the motile response of isolated OHCs to an external alternating electrical field (EAEF) 8. This is a simple and non-invasive technique that circumvents most of the limitations of previous approaches 9-11. Moreover, the LED-based illumination system provides extreme brightness with insignificant thermal effects on the samples and, because of the use of video microscopy, optical resolution is at least 10-fold higher than with conventional light microscopy techniques 12. For instance, with the experimental setup described here, changes in cell length of about 20 nm can be routinely and reliably detected at frequencies of 10 kHz, and this resolution can be further improved at lower frequencies. 
We are confident that this experimental approach will help to extend our understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying OHC motility.

A reliable method to investigate outer hair cell (OHC) motile responses, including electromotility, slow motility and bending, is described. OHC motility is elicited by stimulation with an external alternating electrical field, and the method takes advantage of high-speed image recording, LED-based illumination, and last generation image analysis software.

التحقيق الخارجي على الحركة خلية الشعر مع مزيج من التحفيز الخارجي المتردد مجال كهربائي عالي السرعة وتحليل الصور

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

تحضير الأنسجة وImmunostaining من الألياف العصبية الحسية ماوس التعصيب الجلد والعظام الاطراف

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

نقل الجينات إلى الأذن الداخلية عن طريق تطوير ماوس<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

تسجيلات المشبك التصحيح في الأذن الداخلية خلايا الشعر المعزولة من اسماك الزرد

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

فيفو السابقين التصوير لايف من الانقسامات الخلوية واحدة في الظهارة العصبية ماوس

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

في فيفو الميكروسكوب ثنائي الفوتون من النهايات العصبية في الجلد واحدة

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel cell clusters), sebaceous glands, nerves and nerve endings, and capillaries. The spatial arrangement of these structures is tightly controlled on a microscopic scale - as seen, for example, in the orderly arrangement of cell types within a single hair follicle - and on a macroscopic scale - as seen by the nearly identical orientations of thousands of hair follicles within a local region of skin. Visualizing these structures without physically sectioning the skin is possible because of the 2-dimensional geometry of this organ. In this protocol, we show that mouse skin can be dissected, fixed, permeabilized, stained, and clarified as an intact two dimensional object, a flat mount. The protocol allows for easy visualization of skin structures in their entirety through the full thickness of large areas of skin by optical sectioning and reconstruction. Images of these structures can also be integrated with information about position and orientation relative to the body axes.

Mammalian skin contains a diverse array of structures - such as hair follicles and nerve endings - that exhibit distinctive patterns of spatial organization. Analyzing skin as a flat mount takes advantage of the 2-dimensional geometry of this tissue to produce full-thickness high-resolution images of skin structures.

شقة التصوير من جبل ماوس الجلد وتطبيقه على تحليل الشعر جريب الزخرفة والحسية أكسون الصرف

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

فيفو السابقين الاستعدادات للالميكعي الجهاز سليمة والإكسسوار الشم لمبة

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

متزامنة<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; اختبار وظيفي اثنين من شبكية العين من قبل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; نظام مخطط كهربية

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The technique is very cost-effective and easily undertaken with materials commonly found in most electrophysiology laboratories, or easily purchased. The dissection is simple and fast, with the mechanical displacement provided by a generic electroceramic wafer controlled by proprietary software. The same software also records and analyses the electroneurogram output. The recording of the evoked nerve activity is through a commercial differential amplifier connected to fire-polished standard glass microelectrodes. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the stimulation and the recording conditions to optimize recording quality. The system is suitable for assaying the electrophysiological and optical properties of lanceolate terminals of palisade endings of hair follicles, as well as the outcomes from their pharmacological and/or genetic manipulation. An example of combining electrical recording with mechanical stimulation and labeling with a styryl pyridinium vital dye is given.

A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.

المشتركة تسجيل من ميكانيكيا بتنشيط وارد الناتج والأعصاب الطرفية وسمها في ماوس الشعر المسام سناني الشكل النهايات

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...