O trabalho foi financiado pelo G0601253 UK Medical Research Council concessão do projeto para GSB e RWB e uma subvenção SULSA Bioskape para GSB

Estes métodos foram utilizados na pesquisa, publicada em Bancos, RW et ai. 2 Os ratos foram humanamente eutanasiados por deslocamento cervical. No Reino Unido, esta é uma Anexo 1 método legalmente aprovado listado nas Animais (Scientific Procedures) Act de 1986 e da Directiva Europeia 2010/63 / UE. Esta legislação federal é aplicada localmente na Universidade de Aberdeen pelo Bem-Estar Animal e Ethical Review Board, que aprovaram todos os procedimentos. 1. Orelhas preparando para Labeling <ol><li> Prepara-se uma solução salina fisiológica convencional, tal como de Liley (1956) 5 e satura com 90% de O2 / 5% de CO 2 (carbogénio). Solução salina de Liley é (mM): NaHCO3 (12), KCl (4), KH 2 PO 4 (1), NaCl (138,8), MgCl2 (1), CaCl2 (2) e glicose (11). NOTA: Durante o resto deste manuscrito, &quot;salina&quot; irá referir-se a solução salina que está totalmente saturado com carbogênio. durante dissection, atualizar a solução salina cobrindo a preparação a cada 15 - 20 min. </li><li> Humanamente sacrificá um rato adulto sem danificar o crânio. NOTA: Nós usamos ratos C57 / Bl6J e MF1, mas qualquer tensão mouse pode ser usado. O aspecto mais importante é não usar grandes adultos (&gt; 25 g). Rotulagem em camundongos maiores é menos confiável, sendo muitas vezes confinados a pequenas e dispersas grupos de folículos. </li><li> Retire as orelhas externas (pavilhões auriculares) perto da base com ~ 25 cm tesoura, logo acima da linha do cabelo denso, e mergulhe em solução salina em um silicone revestido de borracha cultura / placa de Petri (50 mm são geralmente conveniente). </li><li> Posição anterior lateral (côncava) o pavilhão auricular para baixo e fixar as margens para o silicone em intervalos regulares com pinos finos de insectos (~ 6 - 8 por orelha, ~ 0,2 mm de diâmetro pinos). Atualizar salina a cada 15 - 20 minutos, ou usar um banho constantemente perfundidos. </li><li> Retire cuidadosamente afastado a pele posterior da pele anterior por dissecção romba, inicialmente aceder a partir da base de corte da orelha sobrea cartilagem central grosso e sistematicamente a trabalhar para as margens externas finas, livre de cartilagem. <ol><li> Para fazer isso, mantenha o centro da aresta de corte da pele posterior com um par de nenhuma. 3 fórceps. Em seguida, com as mandíbulas fechadas, colocar os pontos de um outro conjunto de nenhuma. 3 fórceps no espaço entre a pele ea cartilagem subjacente. </li><li> Suavemente trabalhar os pontos de pinça fechadas a partir de lado-a-lado no interior da abertura, por meio da força mínima necessária, cuidadosamente solte enquanto aderências descascar a pele posterior a separar as camadas. </li></ol></li><li> Com a pele posterior removida, deixar a pele anterior em posição. Pin a pele posterior, o lado dérmico-se, ao lado da pele anterior (conforme 1.5, acima). </li><li> Em seguida, cuidadosamente e remover completamente a cartilagem do pavilhão que foi ensanduichada entre as camadas da pele a partir da pele anterior pela mesma técnica de dissecção romba como em 1.6. Evitar fazer furos com a pinça. </li><li> Em seguida, fou ambas as preparações para a pele delicadamente Pinna casca, coragem e esfregar a fina camada de tecido conjuntivo, assemelhando-se espuma de poliestireno expandido, que cobre as bases do folículo piloso. NOTA: A obtenção de compensação ideal pode demorar um pouco de prática; remoção insuficiente de tecido obstrui o acesso, tanto para a solução de corante e para geração de imagens, enquanto raspagem demasiado vigorosa remove as redes neurais, que estão na base dos folículos. </li><li> Atualizar a solução salina. </li></ol> Rotulagem 2. Lanceolate Terminal NOTA: O seguinte protocolo é otimizado para corante de estirilo piridínio. Outros, quimicamente semelhantes, corantes piridï¿½nio estirilo deve funcionar, talvez depois de algum ajuste na concentração e tempo de incubação. Use luvas e uma bata de laboratório ao manusear soluções de corantes. Ou comprar solução de corante 10 mM diretamente do fabricante ou preparar estoque dissolvendo o pó de corante em solução salina sem glicose. Alíquota (10 mL é geralmente conveniente, mas ajustar isso para a grande scale experimentos) e armazene congelado por até 6 meses a -20 ° C ou ~ 1 ano a -80 ° C. Pó irá armazenar durante pelo menos 2 anos. Evite congelamento repetido / descongelamento de soluções de corantes; este desnatura-se rapidamente o corante. Uma vez descongelado, armazenar a 4 ° C e usar dentro de uma semana. <ol><li> Pré-aquecer num banho de água a 30 ° C, com uma plataforma de ~ 3-5 mm abaixo da superfície da água. </li><li> Recém preparar 10 mM solução estiril piridínio corante (10 ul de corante de estirilo piridínio 10 mM recém-descongelado em 10 ml de solução salina) e equilibrar em banho-maria. </li><li> Pin cada preparação de um silicone de borracha forrada 35 mm de placas de cultura submersa em 1 - 2 mm de solução salina (volume típico, ~ 2 ml). Cada preparação da pele do pavilhão auricular irá produzir duas preparações se cortar pela metade a partir do vértice à base com uma tesoura pequena (10 - 15 cm de comprimento), para minimizar a utilização de animais. </li><li> Colocar as cápsulas de 35 mm contendo as preparações Pinna coberta com solução salina na plataforma submersa no 30 ° C banho-maria. garantir aa profundidade da água é suficiente para o aquecimento adequado, mas não contamina a solução salina no prato aberto. </li><li> Bem Pin (0,5 - diâmetro exterior 1 mm) tubulação com fluxo O 2 / CO 2 para a base de silicone de cada prato para o gás de forma contínua os preparativos. Também coloque em banho-maria 100 ml de solução salina livre de corante para refrescante lavagem / prato. Use uma garrafa com rolha firmemente para manter a saturação carbogênio e prevenir a contaminação da água. </li><li> Equilibrar tudo a 30 ° C durante 30 min e depois substituir a solução salina sobre as preparações de Pinna os 100 ml recipiente rolhado. Incubar mais 30 minutos. NOTA: Esta substituição compensa a evaporação de solução salina e quaisquer perdas de volume em massa resultantes da linha de gás borbulhante. </li><li> Deite fora salina livre de corante em um 100 ml copo de resíduos, em seguida, rapidamente e cuidadosamente apagar afastado qualquer líquido restante em torno da preparação com papel de seda para minimizar os efeitos de diluição na solução de corante para ser adicionado ao lado. Tome cuidado para não tocar ( <em&gt; ou seja, danos) as superfícies dérmicas profundas expostas diretamente. </li><li> Incubar preparações Pinna em 2 - 3 ml de 10 uM de corante de estirilo piridinio durante 40 min a 30 ° C, em seguida, voltar para o R / T para o resto do procedimento. </li><li> Remover o corante não-internalizado em três etapas, usando soluções em R / T. NOTA: Estes passos são melhor realizadas em luz mínima ambiente (persianas, vermelho / laranja iluminação baixa intensidade) para começar a olho escuro-adaptação para a imagem latente. <ol><li> Deite fora a solução de rotulagem dos pratos em um copo de resíduos e rapidamente enxaguar em três mudas de solução salina livre de corante em rápida sucessão. Isto remove a solução de corante de estirilo piridínio residual aderente às preparações e qualquer corante que facilmente departitions a partir de membranas expostas. </li><li> Incubar numa mudança final de solução salina livre de corante durante mais 30 min para departition corante mais restante a partir de membranas de superfície, isto é, não corante internalizado pelos terminais. </li><li> Remover corante persistente preso tO folheto externa das membranas expostas por quelação com o derivado sulfonado b-ciclodextrina (ADVASEP-7, 1 mM, 5 min - ver Tabela 1). Assim, todos os restantes corante estará dentro dos tecidos. </li></ol></li><li> Colocar em solução salina livre de corante fresco para imagiologia e secar o exterior do prato cuidadosamente com papel de seda. NOTA: Os terminais estão agora prontos para a imagem latente. É importante estar ciente de que as terminações lanceoladas estão vivos e, portanto, liberando lentamente o corante piridínio estiril endocitado novamente. Embora esta será mais lenta em R / T, é importante para minimizar os atrasos antes / durante a imagem. Se a experiência exige a rotulagem de várias preparações, inicialmente manter todos eles não marcado a 30 ° C. Eles vão ser viável por várias horas. Em seguida, rotular sequencialmente em intervalos, ao rotular o segundo preparação (passos 2.7 - 2.8.3), enquanto imagem da primeira. </li></ol> 3. Imagem Rotulado Lanceolate Endings. NOTA: O observadordeve ser escuro-adaptado para as seguintes etapas de imagem. O aumento da acuidade visual este proporciona significa que os níveis mais baixos de luz de excitação são necessários para encontrar os folículos para a imagem latente. Isso é mais importante para minimizar fototoxicidade em vez de reduzir a inconveniência de fotodegradação. Os radicais livres gerados pela iluminação intensidade total pode rapidamente (dentro de 60 seg) matar vivendo terminais nervosos (GS Bewick, S. Fadul e WJ Betz, observações não publicadas). <ol><li> Antes de imagem, verifique a preparação sob um microscópio estereoscópico de dissecação e remova cuidadosamente quaisquer detritos superfície. Isto impede a auto-fluorescência contaminando as imagens. <ol><li> Monte o prato no palco de um microscópio de epifluorescência na posição vertical com um conjunto de filtros de fluoresceína padrão (480-488 nm de excitação, 500-520 nm de emissão para estiril corante piridínio). </li></ol></li><li> Atenuar a intensidade da luz de excitação com filtros de densidade neutros até que apenas o suficiente para localizar o terminal confortavelmentes. </li><li> Localize folículos rotulados, observando com baixa (3,5x - 4x objetivo seco), em seguida, progressivamente objetivos maiores (objetiva de imersão 10x e 20x de água) de ampliação. </li><li> Capturar imagens de terminais lanceoladas marcados através de 10x objetivo seco para baixa potência e 20x objetivos de imersão em água para maior ampliação. Minimizar a luz intensidade e tempo de exposição (a tempo de integração da câmera de 0,5 - é sugerido 1 seg). </li><li> Capturar imagens em uma câmera digital padrão e salvar imagens no disco rígido do computador utilizando o software proprietário. NOTA: Um exemplo típico é mostrado na Figura 1. </li><li> Imagem ~ 20 terminações lanceoladas de cada preparação. Comece pelo mais distante margem a partir da borda corte na base da pele do pavilhão auricular e do trabalho ao longo desta margem de imagiologia cada folículo, por sua vez. Trabalhar transversalmente em ligeiramente sobrepostos campos paralela à borda do corte, tomando cuidado para não imagem do mesmo folículo duas vezes e as que são, obviamente, danificado. Note ore são tipicamente muitos terminais lanceoladas a imagem todos eles antes significativa espontânea de-coloração ocorre. Assim, sugerimos que sistematicamente amostragem da população usando o seguinte protocolo. </li><li> Depois de completar a tira marginal, mover um campo de largura em direcção à base do pavilhão, e repetir o processo no sentido inverso. </li><li> Imagem todos os terminais encontrou, exceto os ocasionais claramente orientados muito mais obliquamente ao plano óptico e improvável para caber inteiramente dentro do ROI análise anular padrão (ver secção 4). Não excluem lanceolates excepcionalmente brilhantes ou dimmer em comparação com os terminais vizinhos, a menos que eles são, obviamente, danificado ou intensidade fundo é particularmente elevado, indicando dano tecidual localizada. </li><li> Descartar a preparação, se mais do que 10% da área de pele / terminais estão danificados / inutilizável. NOTA: Como lanceolates Destain com o tempo, a imagem completa de cada preparação dentro de 20 minutos do final da lavagem. </li><li> Euf usando mais de uma preparação, garantir comparações intensidade são válidos por preparações de correspondência de tempo. Para fazer isso, compensar horários de coloração cada preparação por ~ 30 min, para assegurar a comparabilidade dos tempos de-mancha. </li><li> Para monitorar de-mancha (exocitose), a imagem do mesmo terminal em intervalos de 5 ou 10 min. Com a prática, é possível para a imagem até 3 terminais separados em cada ponto no tempo em qualquer uma preparação. </li></ol> 4. Análise Rotulado Lanceolate Endings. Nota: O procedimento que se segue é um método rápido para analisar a intensidade do terminal. <ol><li> Realizar uma região anelar de interesse (ROI) centrado na ponta do eixo do cabelo na base do folículo (Figura 2). Definir a circunferência interna do ROI anular grande o suficiente para evitar o eixo do cabelo auto-fluorescência em qualquer folículo a ser analisado, mas ainda abranger toda a fluorescência do terminal. Certifique-se que a circunferência externa é grande o suficiente para envolver o maior terminai que poderão ser encontrados que está orientada para próximo do eixo óptico / folículo principal. </li><li> Adicione uma ROI fundo aproximadamente igual em área alvo para o anel tubular (quadrado ou círculo, tipicamente ~ 400? M 2) para determinar a intensidade da coloração local, na vizinhança do terminal em análise. Nota: Os tamanhos destes dois ROIs são definidas no início da análise e utilizado para analisar todos os folículos / terminais lanceoladas subsequentes em todas as preparações em qualquer experiência. Então, é importante para definir os seus parâmetros com cuidado no início. </li><li> Coloque o ROI de fundo perto o suficiente para o folículo para representar fundo local nas glândulas sebáceas que estão na base dos terminais, não a pele menor intensidade entre os folículos, mas tome cuidado para não incluir quaisquer regiões terminais. </li><li> Grave a intensidade média das duas ROIs usando o &#39;medida&#39; ou &#39;analisar ROI&#39; função do software e transferência de dados para uma planilha.</li><li> Na planilha, para cada folículo indivíduo subtrair o local de intensidade média de fundo do que no anel para dar uma intensidade líquida. Este ajustamento para o fundo localizada reduz bastante variabilidade entre folículo. </li></ol>

<ol>
	<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+organization+of+cutaneous+low-threshold+mechanosensory+neurons.">The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons.</a> Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).</li><li>Banks, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+modulation+of+synaptic-like+vesicle+recycling+in+mechanosensory+lanceolate+nerve+terminals+of+mammalian+hair+follicles.">Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles.</a> J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).</li><li>Andres, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+microstructure+of+receptors+on+sinus+hair.">On the microstructure of receptors on sinus hair.</a> Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 75, 339-365 (1966).</li><li>Shenton, F., Bewick, G. S., Banks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+expression+of+small+conductance+calcium-activated+potassium+channels+(SK1-3)+in+sensory+endings+of+muscle+spindles+and+lanceolate+endings+of+hair+follicles+in+the+rat.">A study of the expression of small conductance calcium-activated potassium channels (SK1-3) in sensory endings of muscle spindles and lanceolate endings of hair follicles in the rat.</a> PLoS One. 9, e107073 (2014).</li><li>Liley, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+spontaneous+activity+at+the+neuromuscular+junction+of+the+rat.">An investigation of spontaneous activity at the neuromuscular junction of the rat.</a> J. Physiol. 132 (3), 650-666 (1956).</li><li>Suzuki, M., Ebara, S., Koike, T., Tonomura, S., Kumamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+hair+follicles+are+innervated+by+one+afferent+axon?+A+confocal+microscopic+analysis+of+palisade+endings+in+the+auricular+skin+of+thy1-YFP+transgenic+mouse.">How many hair follicles are innervated by one afferent axon? A confocal microscopic analysis of palisade endings in the auricular skin of thy1-YFP transgenic mouse.</a> Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci. 88 (10), 583-595 (2012).</li><li>Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+fluorescent+staining+and+destaining+of+living+vertebrate+motor+nerve+terminals.">Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals.</a> J. Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).</li><li>Betz, W. J., Bewick, G. S., Ridge, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+movements+of+fluorescently+labeled+synaptic+vesicles+in+frog+motor+nerve+terminals+during+nerve+stimulation.">Intracellular movements of fluorescently labeled synaptic vesicles in frog motor nerve terminals during nerve stimulation.</a> Neuron. 9 (5), 805-813 (1992).</li><li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255 (5041), 200-203 (1992).</li><li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+monitoring+of+transmitter+release+and+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Optical monitoring of transmitter release and synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> J. Physiol. 460 (1), 287-309 (1993).</li><li>Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autogenic+modulation+of+mechanoreceptor+excitability+by+glutamate+release+from+synaptic-like+vesicles:+evidence+from+the+rat+muscle+spindle+primary+sensory+ending.">Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending.</a> J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).</li><li>Drew, L., Wood, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM1-43+is+a+permeant+blocker+of+mechanosensitive+ion+channels+in+sensory+neurons+and+inhibits+behavioural+responses+to+mechanical+stimuli.">FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli.</a> Molecular Pain. 3, (2007).</li><li>Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM1-43+reveals+membrane+recycling+in+adult+inner+hair+cells+of+the+mammalian+cochlea.">FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea.</a> J. Neurosci. 22 (10), 3939-3952 (2002).</li><li>Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+endocytosis+in+outer+hair+cells+of+the+mammalian+cochlea.">Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea.</a> Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).</li><li>Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gadolinium+and+FM1-43+as+blockers+of+stretch-evoked+firing+of+rat+muscle+spindle+afferents.">Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents.</a> Proc. Physiol. Soc. 21, P22 (2010).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Bewick e Betz originalmente desenvolvido a N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutilamino) estiril) piridinio-dibrometo relacionada corantes de estirilo piridínio 7-10 para monitorizar reciclagem local da membrana de vesículas sinápticas. a absorção do corante, e, consequentemente, aumento da fluorescência, portanto, reflete a internalização da membrana das vesículas sinápticas (endocitose). Posteriormente, este corante internalizado pode ser re-lançado por uma maior atividade elétrica, que mostra a perda de corante monitora externalização membrana da vesícula (exocitose). Em sinapses, este é um proxy para a secreção de neurotransmissor. Ao mesmo tempo, também encontramos estes corantes rotular terminações nervosas mecanosensorial primários 7. Mais recentemente 11, Bewick, Banks e seus colegas, em seguida, mostrou que isso reflete um processo semelhante em maduros terminais, diferenciadas mecanosensorial ex vivo. Aqui, novamente, os corantes rotular 50 nm de diâmetro vesículas sinápticas &quot;-like&quot; (SLVs) que reciclam constitutivamente para libertar glutamato.Em terminais mecanosensorial, ao contrário dos seus homólogos sinápticos, esta reciclagem é principalmente espontânea. Também é modulada por processos mecânicos, em vez de simplesmente eléctrica, a estimulação. Para neurónios sensoriais em cultura e em células capilares cóclea, corantes de estirilo em geral e corante de estirilo piridínio, em particular, têm sido mostrados para passar através dos canais mecanosensorial, bloqueando os canais mecanosensorial e rotulagem irreversivelmente membranas internas 12. No entanto, em concentrações estiril corante comparáveis ​​em terminais mecanosensorial diferenciadas in situ, como aqui em terminações lanceoladas 2, ou em terminações Ia em fusos musculares 11, e em células de cabelo que não são mecanicamente estimuladas 13, 14, a rotulagem é por endocitose membrana. Nos terminais nervosos mecanosensorial, por exemplo, a rotulagem é reversível e não bloqueia as respostas mecanosensorial nas concentrações utilizadas aqui 2, 11, 15. Enquanto alguns internalização corante por permeação canal nessas terminações não pode ser completamente descartada, o destain quase total com latrotoxin indica a grande maioria da rotulagem em terminais maduros é de internalização com membrana de reciclagem de vesícula. Temos, portanto, usou esta técnica para estudar a dependência atividade 11 e, mais recentemente, a farmacologia 2 de reciclagem SLV em terminais aferentes mecanosensorial examinando efeitos de drogas sobre a captação e liberação dos corantes. Tal como acontece com a maioria das técnicas práticas, reprodutibilidade exige repetição e prática. Alguns dos pontos-chave para garantir a confiabilidade será agora discutida. rotulagem Lanceolate em animais mais jovens é mais confiável - o menor animais temos utilizado foi de 15 g de peso corporal. Não é completamente claro porque este é o caso, mas pode ser devido a dissecção do tecido conjuntivo mais jovens requer menos trauma mecânico e leaves menos restantes resíduos ao remover os tecidos que recobrem a camada de inervação. No geral, a preparação do tecido é bastante simples, com descascar as camadas da pele para além de ser o aspecto prático tecnicamente mais desafiadora e apenas em ratos mais velhos. Nestes, as camadas da pele aderir fortemente em conjunto na base onde a dissecção começa, mas mesmo aqui a separação das camadas torna-se muito mais fácil para as margens. Felizmente, ou talvez, por conseguinte, estas áreas da pele marginais mais finas, geralmente, dão a rotulagem mais satisfatória, assim como a pele anterior em geral. Portanto, evitar particularmente agarrar a pele muito fina nas margens. Para minimizar o risco de danos, manipular preparações indiretamente, empurrando com uma pinça fechadas em vez de agarrar diretamente, ou se aperto essencial tecidos única mais duras improváveis ​​de ser rotulados. Ser completo na remoção da &#39;folha de poliestireno&#39; camada imediatamente que recobre os folículos, pois esta é a principal meobstrução mecânica de imagem e acesso a medicamentos. No entanto, é essencial para minimizar o contacto físico com as estruturas subjacentes como esta danos (ie, desnuda) as redes neurais e terminais logo abaixo. Se a fluorescência predominante é o amarelo / branco nas glândulas sebáceas, proeminente auto-fluorescência das bases eixo do cabelo e alguns crescentes de laranja / amarelo terminações lanceoladas, isso indica a camada de plexo nervoso e terminais lanceoladas associados foram removidos durante a remoção. Este parece ser o principal problema com (&gt; 30 g) os ratinhos mais velhos. Ao longo dos procedimentos de coloração, garantir que tudo está a 30 ° C e bem oxigenado. Esteja ciente de que os terminais marcados ainda estão vivos. Consequentemente, corante vai ser secretada pela liberação contínua espontânea (constitutiva) exocítico. Este será mais lenta em R / T, mas é uma boa prática para minimizar o atraso entre a remoção da solução quelante e de imagem, para minimizar a perda de corante. Além disso, para entre-grupos s comparativostudies de intensidade, que é essencial para assegurar a imagiologia de todos os grupos é combinado em tempo. Utilização de um agente corante quelante antes de imagem melhora grandemente o contraste da imagem. Assim, embora relativamente caro, o passo de quelação é muito importante para garantir uma boa qualidade de imagem. utilização quelante pode ser minimizado através da reutilização da solução várias vezes, e mesmo em 2 - 3 dias consecutivos, se armazenado a 4 ° C entre as utilizações. Descartar a solução quelante uma vez que vai visivelmente rosa, mostrando a sua sequestro de corante está se aproximando da saturação. Durante a gravação, estar ciente do potencial de danos fototóxico para estes terminais vivos, que é o resultado cumulativo de ambos a intensidade e o tempo de exposição da luz de excitação. Esta consideração é menos importante para imagens único ponto no tempo, onde a qualidade da imagem é a principal preocupação. No entanto, é crucial durante a imagem repetida em estudos cinéticos para reduzir a exposição a luz de excitação a um mínimo. Ao desenvolver estes corantes parasinapses etiqueta, encontramos excitação para&gt; 1 min a excitação iluminação plena potência causará dramática e irreparáveis ​​danos a terminais nervosos. Eles primeiro subsequentemente expandir enormemente, em seguida, entrar em colapso completo ao longo de um período de ~ 15 min. Nós não testar sistematicamente as contribuições relativas de tempo de exposição e intensidade, mas estas observações sugerem o princípio orientador deve ser minimizar ambos. Assim, recomenda-se que a intensidade da luz de excitação e duração são o mínimo compatível com a obtenção de boas imagens, e as imagens de controlo adequadas são tomadas em estudos de tempo do curso. Para testar se os dados não são afetados por fototoxicidade em condições de imagens repetidas, em cada momento tomar uma imagem adicional de um terminal ainda não foi visualizada. Isto é para assegurar o comportamento da rotulagem em terminais naive assemelha-se em folículos a ser trabalhada repetidamente. Um número de factores pode reduzir a variabilidade dentro-grupo da intensidade líquida data. a colocação exata das ROIs, em particular o ROI fundo, é importante, pois mesmo pequenas áreas de coloração inadequada pode afetar grandemente entre folículo-variabilidade dos dados. A variabilidade da intensidade líquida também é influenciada por quão completamente cada folículo piloso é cercado por paliçada de terminações. Compare, por exemplo, a distribuição em forma de crescente rotulagem na Figura 1B com o padrão quase completamente circular, visto na Figura 2. Uma análise mais complexa, talvez usando detecção software automatizado e de limiar, são necessários se o grau de cerco é um parâmetro relevante. Por favor, note que as distribuições de intensidade até mesmo para os grupos folículo mais analisados ​​com precisão não são normalmente distribuídos (ver Figura 3), que impliquem a utilização de estatísticas não paramétricos para as comparações entre o tratamento de medianas da população, em vez de meios. técnicas de normalização, tais como a expressão de intensidades em percentagem ócontralateral de controlo F, ou de um grupo de controlo constituído por várias preparações, pode ser aplicado para reduzir ainda mais a variabilidade. O item técnico final a ser considerado é o desenho experimental para testes farmacológicos. Durante os estudos farmacológicos, pré-incubar a preparação em solução de um fármaco, durante 30 min antes da aplicação do corante. Em seguida, manter a concentração da droga na solução do corante. Em controlos, utilizar solução salina ou, se a droga é dissolvida num veículo, salina com veículo. O presente artigo demonstra como esta nova preparação pavilhão auricular oferece imagens de alta qualidade de terminações mecanosensorial na pele com o mínimo de preparação. Também mostramos que pode ser usado para examinar a farmacologia dos dois aspectos críticos de reciclagem vesícula. Nós mostramos pela primeira vez que um agonista do receptor de glutamato pode aumentar a internalização de corante (um marcador de endocitose), e segundo, que o corante é perdido novamente com latrotoxin (um estimulante de exocitose). O significado desta preparation e técnica é que ela oferece um excelente acesso a viver pele terminais mechanosenory in situ para experimentos com imagens, proporcionando oportunidades únicas para o monitoramento óptico da função terminal, estrutura e suas inter-relações. Para este último fim, nós também desenvolveram-lo ainda mais para uso em estudos combinados ópticos / eletrofisiológicos (ver a irmã artigo JoVE para detalhes).

Terminações nervosas mecanosensorial são tipicamente pequenos, difusamente distribuídos e de difícil acesso in situ, como eles são geralmente enterradas profundamente na pele ou outros tecidos circundantes. Visualizá-los, portanto, geralmente requer seccionamento seguido por um imunomarcação prolongado / período de coloração, ou a demora eo custo de obtenção de linhas de rato com expressão genética de marcadores fluorescentes, tais como a proteína fluorescente verde ou amarela (GFP / YFP) 1. Aqui nós mostramos um tecido conveniente e um método rápido e simples para ter acesso a um grande número de aferentes do folículo piloso para estudo, e como eles podem ser rapidamente marcado para o monitoramento óptico da função terminal 2. Com a prática, toda a técnica de dissecção a imagem pode ser concluída em menos de 2 horas. Os terminais de axónios lanceoladas sensoriais que inervam folículos de cabelo em mamíferos formar paliçadas todo o epitélio do cabelo folicular, com cadaterminal de imprensado entre células / Schwann glial processa 2-4. A finalidade dos terminais é detectar deslocamento mecânico dos pêlos que cercam. Eles são uma mistura de terminações rapidamente e de adaptação lenta, mas eles produzem predominantemente curtos períodos de actividade em resposta ao movimento do cabelo. Tipicamente, o disparo pára muito rapidamente quando o movimento cessa, mesmo na presença de deslocamento continuado. Este modelo murino pavilhão auricular para estudar terminais lanceoladas por métodos ópticos tem muitas características vantajosas para o estudo da estrutura e função dessas terminações. O pavilhão é predominantemente duas camadas da pele apposed back-to-back, com apenas uma pequena quantidade de tecido de cartilagem entre os dois. A pele é muito fina e facilmente dissecado devido a quantidades mínimas de tecido conjuntivo fracamente adesiva em relação a outras regiões do corpo. As camadas de pele facilmente separados, portanto, dar um bom acesso para os folículos e terminais. a inervaçãoé facilmente acessível e identificável. Os folículos pilosos são mais esparsamente distribuído do que em outras regiões da pele, facilitando a imagem de indivíduos ou pequenos grupos de folículos. A camada dérmica subjacente fina dá uma boa acessibilidade aos corantes e drogas farmacológicas, por isso é ideal para geração de imagens por microscopia de fluorescência no estado inalterado. A imagem de terminais marcados podem ser tanto de terminais vivos ou, se estiver usando um análogo do corante solucionáveis, após a fixação e posterior processamento histológico. Usámos esta preparação para mostrar que a membrana de reciclagem ocorre nas terminações lanceoladas, evidenciado por absorção (endocitose) e libertação (exocitose) de um corante de estirilo piridínio (FM1-43; N - (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutilamino) estiril) piridínio dibrometo). O corante não, no entanto, parecem rotular significativamente a célula de Schwann investir processa 2. Também mostramos que esta absorção do corante / release e, portanto, membrana reciclagem, está sujeita a modulação glutamatérgica através de um receptor de glutamato metabotrópico atípica (fosfolipase D-acoplado). Os resultados de protocolos de estimulação e análise simples são ilustrados, e as questões de análise de potenciais comuns também são destacados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1435">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PDMS - Sylgard 184</td>
			<td style="width:111px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:989px;">Flexible, inert, translucent solid silicone polymer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">No. 3 Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Austerlitz Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FM1-43/Synaptogreen C4</td>
			<td>Biotium/Cambridge Bioscience</td>
			<td>BT70020</td>
			<td>Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Advasep 7</td>
			<td>Biotium/Cambridge Bioscience</td>
			<td>BT70029</td>
			<td>A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (&#38; other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Retiga Exi Fast 1394</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td></td>
			<td>Monochrome, cooled CCD camera - basic model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Volocity 3D Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>Image capture and analysis software.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical monitoring of living nerve terminal labeling in hair follicle lanceolate endings of the ex vivo mouse ear skin

Um romance técnica de dissecção ea gravação é descrita para a coloração de monitorização óptica e de tirar manchas de terminais lanceoladas circundantes folículos pilosos na pele do pavilhão auricular mouse. A preparação é simples e relativamente rápido, produzindo de forma confiável extensas regiões de múltiplas unidades rotulados de viver terminais nervosos para estudar a absorção e liberação de corantes piridï¿½nio estirilo amplamente utilizados em estudos de reciclagem de vesícula. Subdividindo os preparativos antes da rotulagem permite teste vs. comparações de controle na mesma orelha de um único indivíduo. dicas úteis são dadas para a melhoria da qualidade da preparação, a marcação e os parâmetros de imagem. Este novo sistema é adequado para ensaiar farmacologicamente e absorção e liberação desses corantes vitais em terminais lanceoladas, tanto do tipo selvagem e animais geneticamente modificados mecanicamente induzida. Exemplos de influências moduladoras de intensidade de marcação são dadas.

Os folículos pilosos desta preparação pavilhão auricular são facilmente visíveis em transillumination sem fluorescência (Figura 1A), que ilustra a natureza extremamente fino da preparação e da relativa facilidade de acessibilidade que proporciona a estes terminais mecanosensorial. Cada um é tipificado pela base eixo do cabelo proeminente perfurando o crescente escuro da glândula sebácea. Sob epifluorescência, os terminais lanceoladas marcados em torno de cada folículo de cabelo e são claramente vistas mostram a absorção de corante de estirilo espontânea tipicamente robusta (Figura 1B). Isso ocorre sem movimento imposto. Os terminais lanceoladas são vistos para circundar o eixo do cabelo, embora o grau de cerco é variável 6. Grande parte do rótulo é pontuada (manchas), em vez de o arranjo linear que poderia ser esperado. O padrão salpicado de pontos terminais reflecte a ser observada num plano óptico ao longo do comprimento do terminal. This preparação recebeu nenhum processamento adicional para visualização após a marcação, foi simplesmente transferido para um estágio de microscópio e fotografada in situ, o que novamente ilustra a simplicidade desta preparação. Exemplo experiências para que esta nova preparação é adaptado são mostrados na Figura 3. Ele pode ser usado para estudar tanto a endocitose e a exocitose em terminais vivos, bem como a sua modulação. Assim, para a endocitose, agonistas do receptor de glutamato pode aumentar a intensidade de rotulagem, enquanto bloqueia canais de Ca2 + com ligandos ou catiões tais como Mg 2+, Ni 2+ ou Cd 2+ diminui-lo 2. Alternativamente, esta preparação pode também ser utilizado para estudar a cinética da exocitose, como mostrado na Figura 3C. Primeiro, um terminal marcado é visto de-coloração espontaneamente. No entanto, este destain é acelerada pela estimulante exocitose, latrotoxin. mais decaudas dos resultados experimentais podem ser observados em Bancos, RW et ai. 2. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53855/53855fig1.jpg" /> Figura 1. Robust Estiril Dye Labeling Gravado no mouse Pinna. (A) Parte de uma preparação pavilhão auricular não marcado em iluminação de campo brilhante, mostrando como claramente folículos pilosos aparecem em áreas desmatadas do que recobre tecidos areolar / adiposas. Os, geralmente bilobado, formas crescentes escuras são glândulas sebáceas em torno do eixo do cabelo central. (B) uma área semelhante, com uma ampliação ligeiramente superior e fotografada com epifluorescência, mostrando terminações lanceoladas marcadas com corante de estirilo. Barras de escala -. 40 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53855/53855fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53855/53855fig2.jpg" /> Figura 2. Análise da Estiril Dye Labeling Intensidade. (A) padrão circular típica de rotulagem do folículo de cabelo com corante de estirilo, centrado no eixo do cabelo (não visível nesta imagem). (B) «região de interesse» A análise principal (ROI) é definida por um anel tubular padrão sobrepor a posição da paliçada de terminações nervosas lanceoladas circundando o folículo. Este ROI é mantida constante em forma e área para qualquer única experiência para garantir intensidade de marcação podem ser comparados de maneira justa entre os preparativos e em todos os tratamentos. Intensidade líquida de cada ROI é calculado subtraindo-se a intensidade de uma região de fundo quadrado ou circular adjacente (~ 400? M 2). Mais uma vez, esta região de fundo quadrado é mantido constante em forma e área ao longo de qualquer dada experiência.target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53855/53855fig3.jpg" /> Figura 3. Rotulagem Intensidade do folículo de cabelo aferentes Lanceloate Endings não é normalmente distribuída, e pode ser usado para examinar Ambos endo e exocitose. Dados típicos de medições de intensidade estiril corante em terminais lanceoladas espontaneamente rotulados usando o método descrito acima. (A) a intensidade de Etiquetagem em condições de controle (54 folículos, 4 orelhas) e glutamato 1 mM (42 folículos, 4 orelhas). Os valores de intensidade de terminações individuais são apresentados como gráficos de pontos de cluster. Cada ponto representa a intensidade de uma paliçada de terminal em torno de um folículo. Note-se que, mesmo sob condições de controle poucos pontos de dados (folículos) são extremamente intensa, enquanto a maioria são agrupados em intensidades mais baixas. O primeiro ponto em um determinado intensdade é representada no centro e os pontos de dados subsequentes da mesma intensidade são traçados progressivamente mais lateralmente em ambos os lados. Assim, espalhamento lateral representa a frequência de folículos de qualquer intensidade de marcação particular. As linhas horizontais representam mediana intervalo interquartil ± 25%. A incubação com glutamato 1 mM aumenta a intensidade média de ~ 50% (*** P &lt;0,001, Mann-Whitney), mas rotulagem pode ser reforçada por 200-300%, em alguns terminais. (B) As imagens que demonstram a absorção de corante melhorada mediada por glutamato (endocitose). A incubação da preparação do folículo de cabelo em glutamato (1 mM) aumenta acentuadamente a absorção do corante de estirilo, como demonstrado pelo aumento da intensidade de etiquetagem. Barra de escala 20? m. (C) aumentar a libertação de corante (exocitose). Após a marcação, corante de estirilo é espontaneamente liberada novamente, como a rotulagem a 0 min é claramente mais brilhante do que a 60 min, mesmo após a subtracção de fundo para controlar a fotodegradação. Esta versão é muito potentiated por latrotoxin, uma viúva negra veneno da aranha constituinte, o que desencadeia a exocitose da vesícula descontrolada. Depois de 60 min em toxina, rotulagem do terminal é quase indetectável. Essa reversibilidade da rotulagem estiril corante suporta a hipótese de que a fluorescência do terminal é devido à internalização durante reciclagem local das vesículas sinápticas-like. Barra de escala de 20 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53855/53855fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin at JoVE.com

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

Monitoramento óptico do nervo Viver Terminal Etiquetagem na folículo piloso Lanceolate Endings da<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse pele da orelha

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

optical-monitoring-living-nerve-terminal-labeling-hair-follicle

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

7.4K visualizações.  University of Aberdeen. Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

Vídeo: Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives from their characteristic apical bundle of stereocilia, a critical element for detection and transduction of sound energy 1. OHCs are able to change shape &#x2014;elongate, shorten and bend&#x2014; in response to electrical, mechanical and chemical stimulation, a motor response considered crucial for cochlear amplification of acoustic signals 2.
OHC stimulation induces two different motile responses: i) electromotility, a.k.a fast motility, changes in length in the microsecond range derived from electrically-driven conformational changes in motor proteins densely packed in OHC plasma membrane, and ii) slow motility, shape changes in the millisecond to seconds range involving cytoskeletal reorganization 2, 3. OHC bending is associated with electromotility, and result either from an asymmetric distribution of motor proteins in the lateral plasma membrane, or asymmetric electrical stimulation of those motor proteins (e.g., with an electrical field perpendicular to the long axis of the cells) 4. Mechanical and chemical stimuli induce essentially slow motile responses, even though changes in the ionic conditions of the cells and/or their environment can also stimulate the plasma membrane-embedded motor proteins 5, 6. Since OHC motile responses are an essential component of the cochlear amplifier, the qualitative and quantitative analysis of these motile responses at acoustic frequencies (roughly from 20 Hz to 20 kHz in humans) is a very important matter in the field of hearing research 7.
The development of new imaging technology combining high-speed videocameras, LED-based illumination systems, and sophisticated image analysis software now provides the ability to perform reliable qualitative and quantitative studies of the motile response of isolated OHCs to an external alternating electrical field (EAEF) 8. This is a simple and non-invasive technique that circumvents most of the limitations of previous approaches 9-11. Moreover, the LED-based illumination system provides extreme brightness with insignificant thermal effects on the samples and, because of the use of video microscopy, optical resolution is at least 10-fold higher than with conventional light microscopy techniques 12. For instance, with the experimental setup described here, changes in cell length of about 20 nm can be routinely and reliably detected at frequencies of 10 kHz, and this resolution can be further improved at lower frequencies. 
We are confident that this experimental approach will help to extend our understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying OHC motility.

A reliable method to investigate outer hair cell (OHC) motile responses, including electromotility, slow motility and bending, is described. OHC motility is elicited by stimulation with an external alternating electrical field, and the method takes advantage of high-speed image recording, LED-based illumination, and last generation image analysis software.

Investigando Motilidade das células ciliadas externas com uma combinação de estimulação de campo externo elétrica alternada de alta velocidade e Análise de Imagem

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives ...

Neurociência

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Preparação do tecido e imunocoloração de Fibras nervosas sensoriais que inervam rato da Pele e Ossos Limb

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

Transferência de genes para a orelha do camundongo Desenvolvimento Inner por<em&gt; In Vivo</em&gt; Eletroporação

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Gravações patch clamp em células ciliadas da orelha interna Isolado de Zebrafish

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo imagens ao vivo de divisões celulares simples no mouse neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In Vivo Two-Photon Microscopia de terminações nervosas individuais em Pele

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel cell clusters), sebaceous glands, nerves and nerve endings, and capillaries. The spatial arrangement of these structures is tightly controlled on a microscopic scale - as seen, for example, in the orderly arrangement of cell types within a single hair follicle - and on a macroscopic scale - as seen by the nearly identical orientations of thousands of hair follicles within a local region of skin. Visualizing these structures without physically sectioning the skin is possible because of the 2-dimensional geometry of this organ. In this protocol, we show that mouse skin can be dissected, fixed, permeabilized, stained, and clarified as an intact two dimensional object, a flat mount. The protocol allows for easy visualization of skin structures in their entirety through the full thickness of large areas of skin by optical sectioning and reconstruction. Images of these structures can also be integrated with information about position and orientation relative to the body axes.

Mammalian skin contains a diverse array of structures - such as hair follicles and nerve endings - that exhibit distinctive patterns of spatial organization. Analyzing skin as a flat mount takes advantage of the 2-dimensional geometry of this tissue to produce full-thickness high-resolution images of skin structures.

Plano Monte imagem de Rato pele e sua aplicação à análise do folículo piloso Padronização e Sensorial Axon Morfologia

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo preparações da Intacta Vomeronasal Órgão e acessórios bulbo olfatório

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Simultâneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Teste Funcional de Dois retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Eletrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The technique is very cost-effective and easily undertaken with materials commonly found in most electrophysiology laboratories, or easily purchased. The dissection is simple and fast, with the mechanical displacement provided by a generic electroceramic wafer controlled by proprietary software. The same software also records and analyses the electroneurogram output. The recording of the evoked nerve activity is through a commercial differential amplifier connected to fire-polished standard glass microelectrodes. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the stimulation and the recording conditions to optimize recording quality. The system is suitable for assaying the electrophysiological and optical properties of lanceolate terminals of palisade endings of hair follicles, as well as the outcomes from their pharmacological and/or genetic manipulation. An example of combining electrical recording with mechanical stimulation and labeling with a styryl pyridinium vital dye is given.

A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.

Gravação combinado de saída Mecanicamente Stimulated aferentes e Nerve Terminal Rotulagem no mouse do folículo piloso Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

Monitoramento óptico do nervo Viver Terminal Etiquetagem na folículo piloso Lanceolate Endings da

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo