作業は、英国医学研究審議会のプロジェクト助成GSBにG0601253とRWBとGSBへSULSA Bioskapeの助成金によって賄われていました

これらの方法は、2匹のマウスは人道的に頸椎脱臼により安楽死させRW ら銀行に報告研究で使用しました。英国では、これは動物に記載されている1方法（科学的手続）法、1986年から欧州指令63分の2010 / EU法的に承認されたスケジュールです。この連邦法は、動物福祉およびすべての手順を承認した倫理審査委員会によって、アバディーン大学で局所的に適用されます。 ラベリング1.準備耳<ol><li>このようなLileyの（1956）5のように、標準的な生理食塩水を準備し、90％O 2/5％CO 2（カルボゲン）でそれを飽和。 （12）のNaHCO 3、KClの（4）、KH 2 PO 4（1）、塩化ナトリウム（138.8）のMgCl 2（1） の CaCl 2（2）及びグルコース（11）Lileyの生理食塩水（mm）です。注：この原稿の残りの部分で、「生理食塩水」は、完全にカルボゲンで飽和されている食塩水を参照します。 dissectio中、20分 - nが、準備ごとに15をカバーする生理食塩水をリフレッシュ。 </li><li>人道的に頭蓋骨を損傷することなく、成体マウスを安楽死させます。注：私たちは、C57 / Bl6JとMF1マウスを使用しているが、任意のマウス系統を使用することができます。最も重要な側面は、大規模な成人（&gt; 25 g）を使用しないことです。大きいマウスでのラベリングは、多くの場合、卵胞の小さな散乱グループに限定され、信頼性が低いです。 </li><li> （50ミリメートルは通常便利である）だけ緻密なヘアラインの上、~25センチハサミでベースの近くに外部の耳（耳介）を削除して、シリコーンゴムでライニング文化/シャーレに生理食塩水に浸します。 </li><li>位置耳介前部（凹）側を下にし、細かい虫ピンで定期的に、シリコーンにマージンをピン（〜6から8耳あたり、〜0.2ミリメートルの直径のピン）。 20分、または絶えず灌流風呂を使用 - 生理食塩水ごとに15を更新します。 </li><li>慎重に最初に耳介のカットベースの上からアクセスし、鈍的切開によって、前部皮膚から後方皮をはがし厚い中央軟骨および体系的に薄い、軟骨無外部余白に向けて取り組んでいます。 <ol><li>これを行うには、無一対の後部皮膚のカットエッジの中心を保持します。 3鉗子。そして、顎と無の別のセットのポイントを配置、閉じました。皮膚とその下にある軟骨との間のギャップで3鉗子。 </li><li>ゆっくり層を分離するために後方皮膚をバック剥離しながら、慎重に癒着を緩め、必要最小限の力を利用して、ギャップ内左右にから、閉じた鉗子のポイントを働きます。 </li></ol></li><li>後部の皮膚を除去した、位置の前方の皮膚を残します。 （上記、1.5ごとに）前方の皮膚の横に、最大事後皮膚、真皮側をピン。 </li><li>次に、慎重かつ完全に1.6と同様の鈍的切開法により前方皮膚から皮膚層の間に挟まれた耳介軟骨を除去します。鉗子で穿刺穴をあけないでください。 </li><li>そして、Fまたは両方の耳介皮膚の準備優しくピール、摘むと毛包の拠点をカバーする発泡ポリスチレンフォームを、似ている、結合組織の薄い層を離れてこします。注：最適なクリアリングを得ることが少し練習を取ることができます。あまりにも積極的に掻きする卵胞のベースであるニューラルネットワークを削除しながら、不十分な組織除去は、色素溶液のためおよびイメージングのための両方のアクセスを妨げます。 </li><li>生理食塩水をリフレッシュします。 </li></ol> 2.披針形ターミナルラベリング注：以下のプロトコルは、スチリルピリジニウム色素のために最適化されています。その他、化学的に類似し、スチリルピリジニウム色素は、おそらく濃度およびインキュベーション時間内にいくつかの調整後、動作するはずです。染料溶液を取り扱う際は手袋と白衣を着用してください。メーカーから直接10mMストック染料溶液を購入したり、グルコースを含まない生理食塩水で染料粉末を溶解させてストックを準備するのどちらか。アリコート（10μlのは、通常は便利ですが、大きなSCAのためにこれを調整しますル実験）とストアが-80℃-20℃で6ヶ月まで、または約1年のために凍結します。粉末は、少なくとも2年間は保存されます。染料溶液を繰り返し凍結/融解を避けます。これは急速に染料を変性させます。一度、解凍し、4℃で保存し、1週間以内に使用します。 <ol><li>水面下の5ミリメートル - プラットフォーム〜3で、30℃に水浴を事前に加熱します。 </li><li>新たに10μMスチリルピリジニウム色素溶液（10mLの生理食塩水で新鮮に解凍し、10mMのスチリルピリジニウム色素を10μl）を調製し、水浴中で平衡化します。 </li><li>生理食塩水の2ミリメートル（典型的なボリューム、〜2ミリリットル） - ピンは、シリコーンゴムの各製剤は、1に沈め35mm培養皿を並びます。動物の使用を最小限に抑えるために、 - （15cmの長さ10）頂部から半分に切断した場合の各耳介皮膚製剤は、小さなはさみでベースに2つの調製物が得られます。 </li><li> 30°Cの水浴に沈めたプラットフォーム上で、生理食塩水で覆われた耳介の準備を含む35mm皿を置きます。確保水の深さは、適切な温暖化のために十分であるが、オープン皿に生理食塩水を汚染しません。 </li><li>ピン罰金-継続的に準備をガスに各皿のシリコーンベースにO 2 / CO 2を流しながら（0.5 1ミリメートル外径）チューブ。また、水槽に洗濯/皿のさわやか用色素フリーの生理食塩水100ミリリットルを配置します。カルボゲン飽和を維持し、水の汚染を防止するために密栓ボトルを使用してください。 </li><li>ボトルを栓100ミリリットルから耳介の製剤より生理食塩水を交換し、その後30分間30℃ですべてを平衡化します。さらに30分インキュベートします。注：この置換は、生理食塩水の蒸発やガスラインの泡立ちに起因する任意のかさ体積の損失を補償します。 </li><li>その後、迅速かつ慎重に、次の追加する染料溶液に希釈効果を最小化するためにティッシュペーパーと準備の周りに残っている任意の液体を離れてしみ、100ミリリットル廃棄物のビーカーに無染料の生理食塩水を離れて注ぎます。 （触れないように注意してください<em&gt;つまり、損傷）に直接さらさ深い真皮面。 </li><li>その後、30℃で40分間、10μMスチリルピリジニウム色素の3ミリリットル手順の残りのためのR / Tに戻る - 2に耳介の準備をインキュベートします。 </li><li> R / Tでのソリューションを使用して、3段階で非内在化色素を除去。注：これらの手順は、最高のイメージングのために目の暗適応を開始するために、最小限の環境光（ブラックアウトブラインド、赤/オレンジ低強度の照明）で行われています。 <ol><li>廃棄物のビーカーに皿から標識溶液を離れて注ぎ、すぐに立て続けに無染料の生理食塩水を3回交換ですすぎます。これは準備に付着した残留スチリルピリジニウム色素溶液と簡単にさらさ膜からdepartitions任意の色素を除去します。 </li><li>表面膜から最も残りの染料をDEPARTITIONするさらに30分間、無染料の生理食塩水、 すなわち最終的な変化でインキュベートし、端末によって内在化されない染料。 </li><li>永続的な色素を除去トンを立ち往生スルホン化β-シクロデキストリン誘導体とキレート化することによって露出した膜の外部リーフレットO（Advasep-7、1 mMのは、5分- 表1を参照します）。このように、残りのすべての染料は、組織内であろう。 </li></ol></li><li>イメージングのための新鮮な無染料の生理食塩水に入れて、徹底的にティッシュペーパーで皿の外側を乾燥させます。 注：端末は今イメージングのための準備が整いました。披針形の語尾がゆっくりと再びエンドサイトーシススチリルピリジニウム色素を放出するので、生きているとことを認識することが重要です。これは、R / Tで遅くなりますが、撮像中/前に遅延を最小限に抑えることが重要です。実験は、複数の製剤のラベリングを必要とする場合は、最初に30℃で、それらすべてが標識されていない維持します。彼らは、数時間生存可能であろう。最初に画像化しながら、 - その後、第2の調製（2.8.3 2.7ステップ）を標識することにより、間隔で順次ラベルを付けます。 </li></ol>披針形エンディング標識3.イメージング。 注：オブザーバー次の画像形成工程のために暗順応でなければなりません。これがもたらす増加した視力が低い励起光レベルはイメージングのための卵胞を見つけるために必要とされていることを意味します。これは、光毒性を最小限に抑えるのではなく、光退色の不便を軽減するために最も重要です。完全な強度の光照射によって生成されたフリーラジカルは速やかに（60秒以内）に住ん神経終末（GSビューイック、S. FadulとWJベッツ、未発表の観察）を死滅させることができます。 <ol><li>撮影前に、解剖実体顕微鏡下準備を確認し、慎重に任意の表面の破片を除去します。これは、画像を汚染する自家蛍光を防ぐことができます。 <ol><li>標準フルオレセインフィルターセットを持つ直立落射蛍光顕微鏡のステージ上に皿をマウント（480から488 nm励起、500 - スチリルピリジニウム色素のための520 nmの発光）。 </li></ol></li><li>快適に、端末を特定するためにちょうど十分なまでNDフィルターで励起光強度を減衰させます秒。 </li><li>低で観察することにより標識した卵胞を見つけて - その後、次第に高い（10倍と20倍の水浸対物レンズ）倍率の目標を（3.5倍乾燥対物レンズ4倍）。 </li><li>低消費電力と高倍率用の20倍の水浸対物レンズ用の10倍のドライ対物レンズを通してラベルされた披針形端子の画像をキャプチャします。光強度と露光時間を最小限（0.5のカメラ積分時間 - 1秒が提案されています）。 </li><li>標準的なデジタルカメラの画像をキャプチャし、独自のソフトウェアを使用して、コンピュータのハードドライブに画像を保存します。注：典型的な例は、図1に示されています。 </li><li>各調製物からの画像〜20披針形の語尾。このマージンイメージング順番にそれぞれの卵胞に沿っ耳介皮膚や仕事のベースにカットエッジからマージン遠いで起動します。ない画像に明らかに破損している同じ卵胞二回といずれかを注意しながら、カットエッジに平行に若干の重複分野にまたがって動作。注記：再は、典型的には、それらをすべての重要な自発的な脱色が起こる前の画像にあまりにも多くの披針形端子です。したがって、我々は体系的に以下のプロトコルを使用して人口をサンプリングすることをお勧めします。 </li><li>マージナルストリップを完了した後、耳介の付け根に向かって一つのフィールド幅を移動し、逆方向に処理を繰り返します。 </li><li>画像すべての端末が明らかに非常にはるか斜め光学面に標準環状分析ROI内に完全にフィットしにくい指向時折ものを除いて、遭遇する（セクション4を参照）。彼らは明らかに破損しているか、バックグラウンド強度は、ローカライズされた組織の損傷を示し、特に高くない限り、周囲の端末に比べて異常に明るくしたり、調光器lanceolatesを除外しないでください。 </li><li>皮膚領域の10％以上が/端子が/使用不能に破損している場合の準備を捨てます。注：時間とともに脱色lanceolatesとして、完全なイメージング洗浄の最後の20分以内に各製剤。 </li><li>私F複数の調製物を用いて、強度の比較は、時間整合調製物による有効であることを確認します。これを行うには、脱染色時間の比較可能性を確保するために、30分〜により各製剤を染色のタイミングオフセット。 </li><li> 5または10分間隔で脱染色（エキソサイトーシス）、画像同じ端末を監視します。実践では、いずれか1つの製剤中の各時点での3つの別々の端子まで画像化することが可能です。 </li></ol>披針形エンディング標識4.分析。 注：次の手順では、端末の強度を分析するための迅速な方法です。 <ol><li>関心領域（ROI）の環状領域を作る毛包の基部（ 図2）で毛シャフトの先端を中心に。分析されるべき任意の卵胞に毛幹の自家蛍光を回避するのに十分な大きさの環状のROIの内周を設定するが、それでも全ての端末蛍光を包含する。外周最大terminを同封するのに十分な大きさであることを確認してください主光/卵胞軸に近い向く遭遇するアル可能性が高いです。 </li><li>分析中のターミナルの近くに地元の染色強度を決定するために、ターゲット環形（正方形または円形、通常、〜400ミクロン2）の領域でほぼ等しい背景ROIを行います。 注：これらの2つのROIの大きさは、分析の開始時に設定され、いずれかの実験ですべての製剤全体のすべての後続の卵胞/披針形端子を分析するために使用されます。だから、初めに注意してそのパラメータを設定することが重要です。 </li><li>端子、毛包間のない低強度の皮膚の基礎となる皮脂腺内のローカルバックグラウンドを表すために卵胞に十分近い背景ROIを配置したが、いずれかの末端領域を含めるしないように注意してください。 </li><li> 「メジャー」またはスプレッドシートへのソフトウェアおよび転送データの「分析ROI」機能を使用して2つのROIの平均強度を記録します。</li><li>スプレッドシートでは、各個々の卵胞のネット強度を与えるために線維輪のものから平均局所バックグラウンド強度を差し引きます。ローカライズされた背景のこの調整は、大幅間、卵胞のばらつきを低減します。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

ビューイックとベッツは、もともとシナプス小胞の膜の地域循環を監視するために、ピリジニウムジブロマイド関連スチリルピリジニウム色素7-10を N-（3-triethylammoniumpropyl）-4-（4-（ジブチルアミノ）スチリル）を開発しました。色素取り込み、ひいては蛍光の増加、したがって、シナプス小胞の膜内在（エンドサイトーシス）を反映しています。続いて、この内在化色素は、さらに電気的活動によって再リリースすることができ、染料の損失を示すことは小胞膜の外部化（エキソサイトーシス）を監視します。シナプスでは、これは、神経伝達物質の分泌のためのプロキシです。同時に、我々はまた、これらの染料は、一次機械刺激神経終末7にラベルを発見しました。さらに最近では11、ビューイック、銀行や同僚は、これは成熟した、差別機械刺激端末のex vivoでの同様のプロセスを反映していることが示されました。グルタミン酸を放出するように構成的にリサイクルここで再び、染料ラベル50nmの直径「シナプス様」小胞（SLVS）。機械刺激の端末では、そのシナプスの対応とは異なり、このリサイクルは主に自発的です。また、機械的ではなく、単に電気刺激によって調節されます。 文化および蝸牛の有毛細胞における感覚ニューロンのために、一般、特にスチリルピリジニウム色素でスチリル色素は、機械刺激チャネルを遮断し、不可逆的に内部の膜12を標識し 、機械刺激チャネルを通過することが示されています。しかし、筋紡錘11で2、またはIaの終末で披針形語尾のように、ここでその場で差別機械刺激端末、で同等のスチリル色素の濃度でかつ機械的に13、14を刺激されていない有毛細胞では、標識は、膜のエンドサイトーシスによるものです。機械刺激神経終末では、例えば、標識が可逆的であり、2、11、1、ここで使用される濃度では機械刺激応答をブロックしません。これらの終末におけるチャネル透過による一部の染料内在化を完全に排除できないものの5。、ラトロトキシンとほぼ完全脱色は、成熟した端末で、標識の大部分はリサイクル小胞の膜と内在化することによってであることを示します。我々は、したがって、色素の取り込みと放出に対する薬物効果を調べることによって、最も最近では、機械刺激求心性端末でSLVリサイクルの薬理2を活性依存性11を研究するためにこの技術を使用するとしています。 最も実用的な技術と同様に、再現性が反復と練習が必要です。信頼性を確保するための重要な点のいくつかを説明します。若い動物での披針形の標識は、より信頼性がある - 私たちが使用している最小の動物は、15グラムの体重でした。これが事実である理由は、必ずしも明らかではないが、若い結合組織の切開が少なく、機械的外傷およびルを必要とするので、それであってもよいです神経支配層を覆う組織を除去する際に鳥類少ない残基を残り。 全体的に、組織標本は、皮膚層が離れて最も技術的に困難な実用的な側面であること剥離した後にのみ、古いマウスではと、非常に簡単です。これらには、皮膚層は解剖が起動しますが、ここでも層の分離は、余白に向かってはるかに容易になるベースで一緒に強く接着します。一般的に前方皮膚がそうであるようにありがたいことに、またはおそらくその結果、これらの薄い限界皮膚領域は、通常、最も満足の標識を与えます。そのため、特にマージンで非常に薄い皮膚を把握することは避けてください。損傷のリスクを最小限に抑えるために、閉じた鉗子で押すのではなく、直接把握することで、または本質的な把握が唯一の厳しい組織ラベル付けされる可能性が低い場合には、間接的に準備を操作します。これは主に私のようにすぐに、毛包の上にある「シートポリスチレン」層を除去するのに十分なことイメージングおよび薬物のアクセスにchanical閉塞。しかし、それだけで以下の根底にあるこの損害賠償などの構造（ すなわち、剥ぎ）ニューラルネットワークと端末との物理的接触を最小限にすることが不可欠です。支配的な蛍光は皮脂腺、毛拠点と黄色/オレンジ披針形の語尾の数三日月の著名な自家蛍光の白/黄色の場合、これは神経叢層を示し、関連する披針形端子は、クリアランスの間に除去されています。これは、古い（&gt; 30グラム）マウスを用いた主な問題であるように思われます。染色手順を通して、すべてが30℃であり、十分に酸素を確認してください。ラベルされた端末がまだ生きていることに注意してください。その結果、色素は、継続的な自発的（構成）エキソサイトーシスリリースにより分泌されます。これは、R / Tで遅くなりますが、染料の損失を最小限にするために、キレート剤溶液およびイメージングの除去の間の遅延を最小限にすることをお勧めします。また、群間の比較のために強度のtudies、それはすべてのグループの画像化を確実にするために不可欠なことは、時間的に整合します。イメージングの前に染料キレート剤の使用は、非常に画像のコントラストを向上させることができます。そこで、比較的高価ながら、キレート化ステップは、良好な画像品質を確保するために非常に重要です。使用の間、4℃で保存した場合、3日連続 - キレート剤の使用は、溶液を複数回再利用することにより、最小化、さらには2にすることができます。それは、その染料の隔離が飽和に近づいている示し、顕著にピンクの行く一度キレート剤液を捨てます。 撮影時には、強度と励起光の露光時間の両方の累積結果であるこれらの生活の端末に光毒性損傷の可能性、に注意してください。この考慮事項は、画質が主要な関心事である単一の時点の画像、のためにそれほど重要ではありません。しかし、最小の励起光曝露を低減するために動力学研究における繰り返し撮像中に重要です。これらの染料を開発している間ラベルのシナプスは、我々は神経末端への劇的な回復不能な損傷を与える可能性がありますフルパワーの励起照明で&gt; 1分間の励起を見つけました。彼らはまず、その後、絶大な展開後、〜15分間かけて完全に崩壊します。我々は体系的に露光時間と強度の相対的な寄与をテストしていないが、これらの観​​察は、基本理念は、両方を最小化することであるべき示唆しています。だから、励起光の強度および持続時間は、良好な画像を得るに見合っ最小であり、かつ適切な制御画像は経時研究で取られることをお勧めします。データが繰り返し撮影条件の下で光毒性によって影響されないことをテストするために、各時点で、以前に未視聴端末の追加の画像を取ります。これはナイーブ端末内の標識の挙動は卵胞で繰り返し撮像されていることに似ているようにすることです。 多くの要因は、正味の強度Dの群内変動性を低減することができますATA。不適切な染色の小さな領域が大きく間、卵胞のデータの変動に影響を与えることができるようROIの正確な配置、特に背景ROIは、重要です。ネット強度の変動は、各毛包が語尾の柵で囲まれている方法を完全に影響されます。例えば、 図2に見られるほぼ完全に円形パターンを有する図1Bの三日月形の標識分布を比較してください。より複雑な分析、おそらくソフトウェアの自動検出としきい値を使用して、包囲の程度は、関連するパラメータである場合に必要です。最も正確に分析した卵胞のグループのための強度分布は、通常、人口の中央値ではなく、手段の間の処理の比較のためのノンパラメトリック統計の使用を必要とする、（ 図3参照）は配信されませんのでご了承ください。このようなパーセンテージOなどの強度を表現するよう正規化技術、F対コントロール、またはいくつかの調製物からなる対照群、さらにばらつきを低減するために適用することができます。考慮すべき最後の技術的な項目は、薬理学的試験のための実験的なデザインです。薬理学的調査の間に、染料を適用する前の30分間の薬液で準備を事前にインキュベートします。その後、染料溶液中の薬物濃度を維持します。薬物は車両、生理食塩水を加えた車両に溶解された場合のコントロールでは、生理食塩水または、いずれかを使用します。 本資料では、この新しい耳介製剤は最小限の準備で皮膚に機械刺激終末の高品質の画像を提供しています方法を示しています。我々はまた、小胞のリサイクルの2つの重要な側面の薬理学を調べるために使用できることを示します。私たちは、グルタミン酸受容体アゴニストは色素の内在（エンドサイトーシスのマーカー）を増加させることができ、そして第二に、その色素はラトロトキシン（エキソサイトーシスの刺激剤）で再度失われていることを最初に示しています。このpreparatの意義イオンおよび技術は、端末の機能、構造およびそれらの相互関係の光学的監視のためのユニークな機会を与える、イメージング実験のためにその場で皮膚mechanosenory端子を生きへの優れたアクセスを提供することです。この後者の目的のために、我々はまた、結合された光/電気生理学的研究（詳細については、姉妹Joveの記事を参照してください）​​で使用するためにさらにそれを開発しました。

彼らは通常、皮膚または他の周囲の組織の奥深くに埋もれているように機械刺激神経終末は、 その場でのアクセスに、一般的に小さな広く分布し、困難です。それらの可視化、したがって、通常は長期の免疫標識/染色期間、またはそのような緑や黄色蛍光タンパク質（GFP / YFP）1などの蛍光ラベルの遺伝子発現とマウス系統を得るための遅延と費用が続く切片が必要です。ここでは、便利な組織や研究のための毛包の求心性神経の多数へのアクセスを獲得するために迅速かつ簡単な方法を示し、それらはすぐに端末機能2の光学的監視のために標識することができますか。練習では、切開からの撮像に全体の技術は、わずか2時間で完了することができます。 感覚軸索の披針形端子はそれぞれに、哺乳動物における毛包は、毛包の上皮の周りに柵を形成支配しますグリア/シュワン細胞の間に挟まれた端末は、2-4を処理します 。端子の目的は、それらが取り囲む毛の機械的変位を検出することです。彼らは急速に、ゆっくりと適応語尾の混合物であるが、それらは主に髪の動きに応じて活動の短いバーストを生成します。動きがあっても継続的な変位の存在下で、停止するとき、通常、焼成は非常に迅速に停止します。 光学的方法によって披針形端​​子を研究するためのこのマウス耳介のモデルでは、これらの終末の構造と機能を研究するための多くの有利な特徴を持っています。耳介は、主に皮膚の二層の間の軟骨組織の量が少ないと、バックツーバック並置されています。皮膚は非常に薄く、簡単に起因する身体の他の部位に比べて弱く、接着剤、結合組織の最小量に解剖です。容易に分離表皮層は、したがって、卵胞および端末への良好なアクセスを与えます。神経支配簡単にアクセス可能と識別可能です。毛包は、よりまばら卵胞の個人または小グループのイメージングを容易に、他の皮膚領域よりも分布しています。薄い下層の真皮層は、そのようにさらに処理することなく、蛍光顕微鏡による撮影に最適です、染料および薬理学的薬剤への良好なアクセスを提供します。固定し、さらに組織学的処理の後、固定可能色素アナログを使用している場合はラベルされた端末のイメージングは​​、生きている端末であるか、いずれかです。 我々は、膜のリサイクルは披針形の語尾で起こることを示すために、この準備を使用し取り込み（エンドサイトーシス）によって証明し、スチリルピリジニウム色素（FM1-43の放出（エキソサイトーシス）している; N - （3-triethylammoniumpropyl）-4-（4- （ジブチルアミノ）スチリル）ピリジニウムブロミド）。染料は、しかし、かなりの投資シュワン細胞プロセス2にラベルを付けていないようです。また、この色素取り込み/リリースすることを示し、したがって膜R電子機器のリサイクル、非定型（ホスホリパーゼD-結合された）代謝型グルタミン酸受容体を介してグルタミン酸変調の対象となります。単純な刺激と分析プロトコルの結果が示されており、共通電位分析上の問題も強調されています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1435">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PDMS - Sylgard 184</td>
			<td style="width:111px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:989px;">Flexible, inert, translucent solid silicone polymer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">No. 3 Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Austerlitz Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FM1-43/Synaptogreen C4</td>
			<td>Biotium/Cambridge Bioscience</td>
			<td>BT70020</td>
			<td>Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Advasep 7</td>
			<td>Biotium/Cambridge Bioscience</td>
			<td>BT70029</td>
			<td>A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (&#38; other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Retiga Exi Fast 1394</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td></td>
			<td>Monochrome, cooled CCD camera - basic model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Volocity 3D Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>Image capture and analysis software.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical monitoring of living nerve terminal labeling in hair follicle lanceolate endings of the ex vivo mouse ear skin

小説解剖と記録技術は、光監視染色およびマウスの耳介の皮膚に毛包を取り巻く披針形端子の脱染色のために記載されています。準備が確実に広範囲に小胞のリサイクルの研究で使用さスチリルピリジニウム色素の取り込みと放出を研究する神経終末を生きることの複数の標識された単位の大規模な領域を得、シンプルかつ比較的速いです。標識は、単一の個体から同じ耳における制御の比較対テストを可能にする前に準備を細分化。役立つヒントは、調製、標識および撮像パラメータの品質を向上させるために与えられます。この新しいシステムは、薬理学的アッセイおよび取り込み、これらの両方の野生型で披針形端子に不可欠な染料および遺伝子改変動物の解放を機械的に誘発されるのに適しています。標識強度の調節の影響の例が示されています。

この耳介準備中の毛包は、簡単に準備して、これらの機械刺激の端子に与えるアクセシビリティの相対的な容易さの非常に薄い性質を示す、蛍光（ 図1A）なし透照の下で見られています。それぞれが皮脂腺の暗い三日月を貫通する著名な毛幹ベースに代表されます。エピ蛍光下では、各毛包を囲むラベル付き披針形端子が明らかと一般的に堅牢な自発的なスチリル色素の取り込み（ 図1B）を示しています。これは、課せられた移動なしに発生します。包囲の程度が可変6であるが、披針形端子は、毛幹を囲むように見られています。標識化の多くは、点状（スポット）よりもむしろ予想される線形配置です。斑点状のパターンは、端末の長さに沿った光学面で観察されている端末を反映しています。ティ調製物は、標識後の可視化のための更なる処理を受けていない、それは、もう一度この製剤の単純さを示しており、顕微鏡ステージに移し、 その場で画像化しました。 この新規の製剤が適している実施例の実験は、 図3に示されている。エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシスのリビング末端で、ならびにそれらの変調の両方を研究するために使用することができます。例えば、Mg 2+とNi 2+またはCDなどのリガンドまたはカチオンとのCa 2+チャネルを遮断する2+それ2を減少しつつ、エンドサイトーシスのために、グルタミン酸受容体アゴニストは、標識強度を増加させることができます。あるいは、この製剤はまた、図3（c）に示すように 、エキソサイトーシスの動態を研究するために使用することができます。まず、標識された端末は自発的に脱染色を見られています。しかしながら、この脱色はラトロトキシン、エキソサイトーシスの刺激によって促進されます。詳細デ実験結果の尾部は、RW ら 2バンクに見ることができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53855/53855fig1.jpg" /> 図1.マウスの耳介に記録された堅牢なスチリル色素標識化 。 （A）毛包が乳輪/脂肪組織の上にあるのクリアエリアに表示される方法を明確に示す明視野照明で標識されていない耳介の準備、の一部。暗い、通常bilobed、三日月形状は、中央毛幹を囲む皮脂腺です。わずかに高い倍率で（B）同様の面積、およびスチリル色素で標識された披針形の語尾を示す、落射蛍光で画像化。スケールバー- 。40ミクロン<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53855/53855fig1large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> &quot;1&quot;&gt; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53855/53855fig2.jpg" /> スチリル色素標識強度の図2.分析 。 （A）（この画像では見えない）毛幹を中心スチリル色素と毛包の標識の典型的な円形パターン、。 （B）の主な分析」、関心領域」（ROI）は、卵胞を囲む披針形の神経終末の柵の位置に重畳標準弁輪によって定義されます。このROIは、標識強度はかなり準備の間、すべての処置間で比較することができることを確認するために、任意の単一の実験のための形状と面積で一定に保たれます。各ROIの正味強度は、隣接する正方形または円形の背景領域（〜400ミクロン2）の強度を差し引くことによって計算されます。再び、この正方形の背景領域は、任意の所与の実験を通して形状および面積で一定に保たれます。ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53855/53855fig3.jpg" /> 毛包求心性Lanceloateエンディングの図3.標識強度は通常、分散されず、エンド-およびエキソサイトーシスの両方を検査するために使用することができます。スチリル色素の強度測定値から代表的なデータを、上記の分析方法を用いて、自然にラベル付け披針形端子に。制御条件の下で（A）ラベリング強度（54包、4耳）および1mMグルタミン酸（42包、4耳）。個々の末端の強度値は、クラスタドットプロットとして表示されます。各点は、毛包の周囲の一方の端子柵の強度を表します。ほとんどが低い強度でクラスタ化されている間であっても制御条件の下で、いくつかのデータポイント（卵胞）は、非常に強いであることに注意してください。特定のINTENSで最初のドット性は、中央にプロットされ、同じ強度の後続のデータ点は、両側に次第に横方向にプロットされています。したがって、横方向の広がりは、任意の特定の標識強度の卵胞の周波数を表します。水平線は中央値±25％の四分位範囲を表します。 1 mMのグルタミン酸とのインキュベーションは、〜50％（*** P &lt;0.001、マン・ホイットニー）により中央値強度を向上させるが、標識は200によって向上させることができます - 一部の端末では300％。 （B）画像は、グルタミン酸が媒介する強化された色素取り込み（エンドサイトーシス）を実証します。増加ラベリング強度によって示されるように、グルタミン酸（1 mM）の中の毛包製剤のインキュベーションは著しく、スチリル色素の取り込みを増加させます。スケールバーは20μm。 （C）強化色素放出（エキソサイトーシス）。 0分での標識化は、光退色のために制御することがあってもバックグラウンドを差し引いた後、明らかに60分でより明るいよう標識後、スチリル色素が自発的に、再び解放されます。このリリースは大幅に経口であります制御されていない小胞のエキソサイトーシスをトリガーラトロトキシン、クロゴケグモ毒成分によってtentiated。毒素で60分後、末端標識はほとんど検出不可能です。スチリル色素標識のこの可逆性は、端末蛍光がシナプスのような小胞の地域循環中に内在化によるものであるという仮説をサポートしています。スケールバーは20μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53855/53855fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

の毛包披針形語尾に神経末端標識リビングの光監視<em&gt; ex vivoで</em&gt;マウスの耳皮膚

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

optical-monitoring-living-nerve-terminal-labeling-hair-follicle

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

7.4K ビュー.  University of Aberdeen. Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

ビデオ: Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives from their characteristic apical bundle of stereocilia, a critical element for detection and transduction of sound energy 1. OHCs are able to change shape &#x2014;elongate, shorten and bend&#x2014; in response to electrical, mechanical and chemical stimulation, a motor response considered crucial for cochlear amplification of acoustic signals 2.
OHC stimulation induces two different motile responses: i) electromotility, a.k.a fast motility, changes in length in the microsecond range derived from electrically-driven conformational changes in motor proteins densely packed in OHC plasma membrane, and ii) slow motility, shape changes in the millisecond to seconds range involving cytoskeletal reorganization 2, 3. OHC bending is associated with electromotility, and result either from an asymmetric distribution of motor proteins in the lateral plasma membrane, or asymmetric electrical stimulation of those motor proteins (e.g., with an electrical field perpendicular to the long axis of the cells) 4. Mechanical and chemical stimuli induce essentially slow motile responses, even though changes in the ionic conditions of the cells and/or their environment can also stimulate the plasma membrane-embedded motor proteins 5, 6. Since OHC motile responses are an essential component of the cochlear amplifier, the qualitative and quantitative analysis of these motile responses at acoustic frequencies (roughly from 20 Hz to 20 kHz in humans) is a very important matter in the field of hearing research 7.
The development of new imaging technology combining high-speed videocameras, LED-based illumination systems, and sophisticated image analysis software now provides the ability to perform reliable qualitative and quantitative studies of the motile response of isolated OHCs to an external alternating electrical field (EAEF) 8. This is a simple and non-invasive technique that circumvents most of the limitations of previous approaches 9-11. Moreover, the LED-based illumination system provides extreme brightness with insignificant thermal effects on the samples and, because of the use of video microscopy, optical resolution is at least 10-fold higher than with conventional light microscopy techniques 12. For instance, with the experimental setup described here, changes in cell length of about 20 nm can be routinely and reliably detected at frequencies of 10 kHz, and this resolution can be further improved at lower frequencies. 
We are confident that this experimental approach will help to extend our understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying OHC motility.

A reliable method to investigate outer hair cell (OHC) motile responses, including electromotility, slow motility and bending, is described. OHC motility is elicited by stimulation with an external alternating electrical field, and the method takes advantage of high-speed image recording, LED-based illumination, and last generation image analysis software.

外部交互電場刺激と高速画像解析の組み合わせで外有毛細胞の運動性の調査

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives ...

神経科学

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

スキンと四肢骨の神経支配マウス感覚神経線維の組織の調製と免疫染色

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

開発マウス内耳への遺伝子導入による<emインビボで&gt;</em&gt;エレクトロポレーション

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

内耳有毛細胞におけるパッチクランプ記録は、単離されたゼブラフィッシュから

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

ex vivoでマウス神経上皮における単一細胞分裂のライブイメージング

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

皮膚における単一神経終末のin vivo二光子顕微鏡で

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel cell clusters), sebaceous glands, nerves and nerve endings, and capillaries. The spatial arrangement of these structures is tightly controlled on a microscopic scale - as seen, for example, in the orderly arrangement of cell types within a single hair follicle - and on a macroscopic scale - as seen by the nearly identical orientations of thousands of hair follicles within a local region of skin. Visualizing these structures without physically sectioning the skin is possible because of the 2-dimensional geometry of this organ. In this protocol, we show that mouse skin can be dissected, fixed, permeabilized, stained, and clarified as an intact two dimensional object, a flat mount. The protocol allows for easy visualization of skin structures in their entirety through the full thickness of large areas of skin by optical sectioning and reconstruction. Images of these structures can also be integrated with information about position and orientation relative to the body axes.

Mammalian skin contains a diverse array of structures - such as hair follicles and nerve endings - that exhibit distinctive patterns of spatial organization. Analyzing skin as a flat mount takes advantage of the 2-dimensional geometry of this tissue to produce full-thickness high-resolution images of skin structures.

マウス皮膚や毛包パターニングおよび感覚軸索形態の解析への応用のフラットマウントイメージング

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

無傷の鋤鼻器官と副嗅球のex vivoでの準備

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

同時<em&gt; ex vivoで</emによる二つの網膜の&gt;機能テスト<em&gt; in vivoで</em&gt;電図システム

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The technique is very cost-effective and easily undertaken with materials commonly found in most electrophysiology laboratories, or easily purchased. The dissection is simple and fast, with the mechanical displacement provided by a generic electroceramic wafer controlled by proprietary software. The same software also records and analyses the electroneurogram output. The recording of the evoked nerve activity is through a commercial differential amplifier connected to fire-polished standard glass microelectrodes. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the stimulation and the recording conditions to optimize recording quality. The system is suitable for assaying the electrophysiological and optical properties of lanceolate terminals of palisade endings of hair follicles, as well as the outcomes from their pharmacological and/or genetic manipulation. An example of combining electrical recording with mechanical stimulation and labeling with a styryl pyridinium vital dye is given.

A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.

マウスの毛包披針形エンディングで機械的に刺激された求心性の出力および神経ターミナルラベリングの複合記録

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...