بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح R01HL105635 إلى SEJ. فإن الكتاب أود أن أشكر دييغو خامسا Bohórquez للحصول على المشورة الفنية. كما نشكر ر إيان كومينغ للحصول على المساعدة الفنية وأداء التدفق الخلوي في مرفق دوق لقاح الإنسان معهد بحوث التدفق الخلوي الموارد المشتركة (دورهام بولاية نورث كارولاينا). التدفق الخلوي أجريت في مختبر الاحتواء البيولوجي الإقليمي في جامعة ديوك الذي حصل على دعم جزئي للبناء من المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (UC6-AI058607).

وقد تمت الموافقة على الإجراءات التي تجرى على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة ديوك. 1. إدارة الطريق الأنفي من الأزرق سريع للأزرق سريع، إدارة الصبغة لا يقل عن 2 أيام قبل القتل الرحيم الماوس. سوف الصبغة تستمر لمدة تصل إلى ثمانية أسابيع. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفأر مع التخدير استنشاق خفيفة (2.5٪ سيفوفلوران) حتى التنفس يبدأ في التباطؤ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ماصة 200 ميكرولتر مع نصائح تصفيتها لغرس ببطء 40 ميكرولتر من محلول الصبغة (0.4 ملي سريع الأزرق، 1٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد، والمياه المالحة DMSO، في الفوسفات، PBS) في الأنف، والتوقف من حين لآخر لضمان الفأر هو الشفط الحل (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد الماوس عموديا، يصل رئيس، وتدليك بلطف الصدر لضمان ينتشر صبغ جميع أنحاء الرئتين. </li></ol> 2. الاستعدادات على تشريح وتحليل يوم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 10 مل0؛ العقد التفكك الحل (GADS) من خلال الجمع بين المكونات كما هو محدد في الجدول 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء استخراج الحمض النووي الريبي في منطقة مختبر مخصصة. قبل البدء في التجربة، وتنظيف الأسطح مع الايثانول 70٪، 10٪ التبييض، وريبونوكلياز إزالة التلوث كاشف. ويشمل ذلك أجهزة الطرد المركزي RNA، أي رفوف أنبوب، والماصات. تأكد من وجود مخصصة صناديق مرشح نصيحة لاستخدام الحمض النووي الريبي فقط. لا تستخدم هذه المعدات والمنطقة لإعداد الحمض النووي، حيث سيؤدي ذلك إلى تلوث العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج جديدة 70٪، و 80٪ من الإيثانول مع ريبونوكلياز خالية من المياه. إعداد 1 مل لكل عينة لاستخدامها في استخراج الحمض النووي الريبي. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> عنصر </td><td> كمية </td></tr><tr><td> المتقدم DMEM / F12 </td><td> 9.5 مل </td></tr><tr><td> الجلوتامين </td><td> 100 ميكرولتر </td></tr><tr><td> HEPES (10 ملم) </td><td> 100 ميكرولتر </td></tr><tr><td> ملحق N2 </td><td> 100 ميكرولتر </td></tr><tr><td> B27 (أي فيتامين أ) </td><td> 200 ميكرولتر </td></tr><tr><td> نيسان الخليج (50 ميكروغرام / مل) </td><td> 10 ميكرولتر </td></tr></tbody></table> الجدول 1. الكاشف خليط لالعقد التفكك الحل (GADS). 3. إجراء تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء أنابيب 1.5 مل مع 500 ميكرولتر GADS، واحد لكل العينة التجريبية، واحد لمراقبة فرز إيجابية، واحد لمراقبة فرز السلبية. مخزن أنابيب على الجليد في جميع أنحاء تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح خارج العقدة العقداء وجعل اثنين من التخفيضات الجزئية لتسهيل التفكك، ثم وضعها في أنبوب العينة التجريبية. يرجى الرجوع إلى بروتوكول إن الرب التالية لتشريح العقد العقيدي 16 و 17 DRG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح وقطع جزئيا غير المسماة العقد، مثل العقد الجذرية الظهرية (DRG)، لعناصر الفرز. استخدام اثنين من العقد لمراقبة إيجابية واثنين من gangliوللسيطرة سلبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على الخلايا العصبية كثير العقد كافية للفرز ناجحة، والجمع بين العقد من 5 الفئران في واحدة أنبوب العينة التجريبية التي تحتوي على GADS. </li></ol> 4. الحسية العقد التفكك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة من 500 GADS ميكرولتر، وترك العقد في الأنبوب. غسل العقد مرة واحدة عن طريق إضافة 1 مل PBS، انتظر العقد لتستقر في قاع الأنبوب، ثم ماصة من برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل GADS و 22 ميكرولتر من انزيم الهضم (كولاجيناز I / II ومزيج الأنزيم البروتيني، 2.5 ملغ / مل في H 2 O) إلى كل أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر سريع الأزرق (5.26 ملم) لأنبوب السيطرة إيجابي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأنابيب في كتلة حمام الماء أو تدفئة بالفعل تعيين عند 37 درجة مئوية. ملاحظة: المرة من الهضم العقد يعتمد على عمر انزيم الهضم. في غضون شهر 1 من حل انزيم الهضم، الهضم لمدة 30 دقيقة، في 2-6 أشهر هضم لمدة 45 دقيقة. إذا الانزيم أكثر من 6 أشهر من العمر، هضم العقد وأو 60 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتغطي كل 15 دقيقة أنابيب هزة لفترة وجيزة ونفض الغبار لهم لضمان العقد من الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين يتم هضمها العقد، وإعداد التدرجات كثافة باستخدام محلول الجسيمات (جزيئات السيليكا الغروية المغلفة مع بوفيدون). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 12 حل الجسيمات٪ في GADS، 500 ميكرولتر لكل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 28 حل الجسيمات٪ في GADS، 500 ميكرولتر لكل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ببطء وبعناية إضافة 400 ميكرولتر 12٪ محلول كثافة فوق 400 ميكرولتر 28٪ محلول الكثافة في أنبوب 1.5 مل الطازجة لكل عينة. لا تسمح طبقتين لخلط. وينبغي أن يكون طبقتين متميزتين مرئية في أنبوب. واحدة أغمق من جهة أخرى. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين يتم هضمها العقد، تسمية الأنابيب الجديدة 1.5 مل جمع للفرز (واحد أزرق ايجابية واحدة سريعة أنبوب سلبي أزرق سريع في فرز عينة). تبعا لاحتياجات المنشأة والفرز، ويجب أن يكون هذه الأنابيب أغطية للانفصال وذلك لعدم INTERFERالبريد مع فارز الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد وقت الهضم المناسب، وإزالة GADS مع انزيم الهضم ويغسل العقد مرتين مع 1 مل برنامج تلفزيوني. إضافة 200 ميكرولتر من GADS جديدة إلى كل أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ماصة 200 ميكرولتر، لتعيين 100 حجم ميكرولتر، والعقد ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لكسر الخلايا عن بعضها البعض. كرر حتى لا ترى قطعة سليمة من الأنسجة. تجنب خلق فقاعات في الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمر خلايا فصلها من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر GADS آخر لأنبوب تفارق الأصلي لالتقاط أي الخلايا الضالة الذين تبقوا وتمرير حل إضافي من خلال مصفاة الخلية. باستخدام طرف ماصة جديدة، وجمع أي سوائل التي تحتوي على الخلايا المتبقية التي مرت من خلال مصفاة وتمسكوا شبكة. الحجم النهائي للخلايا معلقة في GADS 300 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طبقة بعناية 300 ميكرولتر من الخلايا على أعلى درجة الكثافة التي سبق. تجنب فقاعات وخلط جملتعلمي اللغة اإلنكليزية مع الطبقات كثافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 2900 x ج في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن الخلايا هي في أجهزة الطرد المركزي، مزيج تحلل العازلة (1 مل لكل عينة تجريبية) على النحو التالي: 10 ميكرولتر 2-المركابتويثانول في 1 مل العازلة RLT (من RNA عدة الاستخراج). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 300 العازلة تحلل ميكرولتر لسريع أنبوب جمع إيجابي الأزرق و 600 ميكرولتر سريع أنبوب جمع السلبي الأزرق (أنابيب وصفت من الخطوة 4.7). هذا الحجم يعتمد على عدد من الخلايا المتوقع أن يتم جمعها. ل&lt;2000 الخلايا، إضافة 300 ميكرولتر، ل&gt; 7000 الخلايا تضيف 600 ميكرولتر. وهذا يضمن الفرز السائل غمد لا يخفف إلى حد كبير من تحلل العازلة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة اكتمال الطرد المركزي، وإزالة بعناية وتجاهل الطبقة ميكرولتر كبار 700. تحتوي هذه الطبقة معظم الحطام الخلية التي سوف تتداخل خلاف مع فرز الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 700 GADS جديدة ميكرولتر إلى الخلية المتبقية تحتوي على حل والماصةالشركة المصرية للاتصالات صعودا وعدة مرات وصولا الى المزيج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 2900 x ج لتكوير الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن الخلايا هي في أجهزة الطرد المركزي، خلط فرز GADS (500 ميكرولتر لكل عينة) وذلك بإضافة 5 ميكرولتر الدناز (10 ملغ / مل) إلى 1 مل GADS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة ويتم الطرد المركزي، وإزالة بعناية وتجاهل طاف، وترك بيليه الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق بيليه خلية في 200-300 GADS ميكرولتر الترتيب بواسطة pipetting صعودا وهبوطا مع ماصة 1000 ميكرولتر المقرر أن 200 ميكرولتر عدة مرات. وضع العينات على الجليد. الخلايا هي الآن جاهزة للفرز. </li></ol> 5. الإسفار خلية المنشط (FAC) الفرز ملاحظة: هذا القسم يتطلب معرفة التشغيلية لفارز FACS أو المساعدة من الموظفين المهرة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 ميكرولتر يوديد propidium (PI) حل سهم (50 ميكروغرام / مل) لكل عينة لاختبار لبقاء الخلية. تقسيم السيطرة السلبية إلى 2 الأنابيب، واحدة مع PI واحد دون. PI يربط الحمض النووي فقط في الخلايا الميتة. إذابعد أنواع القليلة الأولى هناك أي خلايا ميتة لتسمية، ليست هناك حاجة لاستخدام PI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا النقل في التدفق الخلوي الصك، على سبيل المثال، دينار بحريني FACS AriaII تشغيل المغنية 8 البرمجيات، على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منذ حجم الخلية هو متغير في هذه الفئة من السكان، واستخدام فوهة كبيرة (100 ميكرون) للفرز. لتقليل مقدار الضغط تجربة الخلايا وزيادة قابلية الخلية تستخدم ضغط منخفض (20 رطل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البرنامج فارز FACS لإعداد المؤامرات التحليل، مبعثر إلى الأمام، الجانب مبعثر (SSC)، الأزرق سريع، وPI، إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاعادة تعليق الخلايا، دوامة برفق لفترة وجيزة عينة قبل تحميله في فارز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بادئ ذي بدء سيطرة سلبية، لا الأزرق السريع أو PI، لتعيين عتبة باب (الشكل 2A). هذا وسوف يحدد مبلغ تألق ذاتي في خلية السكان. اختياري: تشغيل العينة سلبية مع PI لتحديد ما إذا كان هناك عدد من الخلايا الميتة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فرز عينة مراقبة إيجابية (المؤتمر الوطني العراقيubated مع الأزرق السريع)، لتعيين المعلمات التعويض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم تعيين بوابات والمعلمات، تبدأ فرز العينات التجريبية. يتم فرز العينات في أنابيب جمع مستعدة تحتوي على العازلة RNA تحلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاحتفاظ بعينات فرزها على الجليد حتى الفرز خلية كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ الخطوة استخراج الحمض النووي الريبي على الفور بعد أن يتم فرز الخلايا. </li></ol> 6. استخراج الحمض النووي الريبي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة الخلايا مرتبة في تحلل العازلة لمدة 1 دقيقة إلى التجانس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى حجم 1 من 70٪ من الإيثانول ومزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ما يصل إلى 700 ميكرولتر من العينة إلى عمود الدوران. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في 8000 ز س. تجاهل التدفق من خلال. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر حتى يتم تمرير الحجم الكلي للعينة من خلال عمود الدوران. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 350 ميكرولتر العازلة RW1 ومواصلة عملية تنقية الحمض النووي الريبي، بما في ذلك خطوة العلاج الدناز، وفقا لprotoco الشركة المصنعةلتر بالنسبة للخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم استخراج الحمض النووي الريبي، اختبار الحمض النووي الريبي الجودة باستخدام نظام الكهربائي ميكروفلويديك وفقا لمواصفات الشركة الصانعة. </li></ol>

<ol>
	<li>Manteniotis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+RNA-Seq+Expression+Analysis+of+Sensory+Ganglia+with+a+Focus+on+Ion+Channels+and+GPCRs+in+Trigeminal+Ganglia.">Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia.</a> PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).</li><li>Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+mRNA+expression+analysis+of+TRP+channel+genes+at+the+single+trigeminal+and+dorsal+root+ganglion+level+in+mouse.">Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse.</a> BMC Neurosci. 14 (1), 21 (2013).</li><li>Paintal, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vagal+sensory+receptors+and+their+reflex+effects.">Vagal sensory receptors and their reflex effects.</a> Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).</li><li>Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+tracing+shows+that+CGRP-immunoreactive+nerves+of+rat+trachea+and+lung+originate+from+vagal+and+dorsal+root+ganglia.">Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia.</a> J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).</li><li>Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interganglionic+segregation+of+distinct+vagal+afferent+fibre+phenotypes+in+guinea-pig+airways.">Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways.</a> J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).</li><li>Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+transient+receptor+potential+channels+and+two-pore+potassium+channels+in+subtypes+of+vagal+afferent+neurons+in+rat.">Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).</li><li>Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurochemistry+of+the+nodose+ganglion.">Neurochemistry of the nodose ganglion.</a> Prog Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).</li><li>Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vagal+Sensory+Neuron+Subtypes+that+Differentially+Control+Breathing.">Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing.</a> Cell. 161, 1-12 (2015).</li><li>Kaczy&#324;ska, K., Szereda-Przestaszewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodose+ganglia-modulatory+effects+on+respiration.">Nodose ganglia-modulatory effects on respiration.</a> Physiol Res. 62, 227-235 (2013).</li><li>Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+pulmonary+oxidative+stress+by+lung+vagal+afferents.">Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents.</a> Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).</li><li>Bautista, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPA1+mediates+the+inflammatory+actions+of+environmental+irritants+and+proalgesic+agents.">TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents.</a> Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).</li><li>Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+survival+of+vagal+and+glossopharyngeal+sensory+neurons+is+dependent+upon+dystonin.">The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin.</a> Neuroscience. 137 (2), 531-536 (2006).</li><li>Hondoh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+expression+of+cold+receptors+(TRPM8+and+TRPA1)+in+the+rat+nodose-petrosal+ganglion+complex.">Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex.</a> Brain Res. 1319, 60-69 (2010).</li><li>Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sensory+and+sympathetic+innervation+of+guinea-pig+lung+and+trachea+as+studied+by+retrograde+neuronal+tracing+and+double-labelling+immunohistochemistry.">The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry.</a> Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).</li><li>Choi, D., Li, D., Raisman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+retrograde+neuronal+tracers+that+label+the+rat+facial+nucleus:+A+comparison+of+Fast+Blue,+Fluoro-ruby,+Fluoro-emerald,+Fluoro-Gold+and+DiI.">Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI.</a> J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).</li><li>Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+of+Nodose+Ganglia+Injection+in+Sprague-Dawley+Rat.">A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat.</a> J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).</li><li>Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+specific+sensory+neuron+populations+for+study+of+expressed+ion+channels.">Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels.</a> J Vis Exp. (82), e50782 (2013).</li><li>Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM8+function+and+expression+in+vagal+sensory+neurons+and+afferent+nerves+innervating+guinea+pig+esophagus.">TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus.</a> Am J Physiol - Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).</li><li>Kwong, K., Lee, L. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGE(2)+sensitizes+cultured+pulmonary+vagal+sensory+neurons+to+chemical+and+electrical+stimuli.">PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli.</a> J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).</li><li>Joachim, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+induces+substance+P+in+vagal+sensory+neurons+innervating+the+mouse+airways.">Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways.</a> Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).</li><li>Kaan, T. K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+blockade+of+P2X3+and+P2X2/3+receptors+attenuates+bone+cancer+pain+behaviour+in+rats.">Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats.</a> Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).</li><li>Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helt+determines+GABAergic+over+glutamatergic+neuronal+fate+by+repressing+Ngn+genes+in+the+developing+mesencephalon.">Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon.</a> Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).</li><li>Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS-array+profiling+of+striatal+projection+neuron+subtypes+in+juvenile+and+adult+mouse+brains.">FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains.</a> Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).</li><li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing.">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

يصف هذا البروتوكول وسيلة لاستهداف الخلايا العصبية الهوائية-التعصيب في العقد العقيدي من العصب المبهم. مرة واحدة وصفت، وفصل في العقد بلطف للحفاظ على النحو الأمثل أعداد الخلايا وقدرتها على البقاء. هذه الخلايا العصبية هي ثم فرزها القوات المسلحة الكونغولية مباشرة إلى ت?...

الأعصاب الحسية الجسدية تنبيغ الحرارية والميكانيكية والكيميائية، والمحفزات الضارة الناجمة عن كل من وكلاء الذاتية والبيئية. وتقع الهيئات خلية من هذه الأعصاب وارد في العقد الحسية، مثل الجذر الظهري، مثلث التوائم، أو العقد عقدي. كل العقدة الحسية يعصب مناطق محددة من الجسم، وتحتوي الخلايا التي يعصب أعضاء وأنسجة منفصلة داخل تلك المنطقة. على سبيل المثال، توجد العقد الجذرية الظهرية (DRG) في العمود الفقري وتوسيع العمليات في جميع أنحاء الجسم والأطراف، بينما تقع العقد مثلث التوائم في الجمجمة، والتي تحتوي على الخلايا العصبية التي يعصب الوجه والعينين، السحايا أو العليا الهوائية 1، 2. يقع العقد العقيدي من العصب المبهم في الرقبة تحت الجمجمة ويحتوي على أجسام الخلايا التي تمتد الألياف العصبية في جميع أنحاء الجهاز الهضمي والقلب، وانخفاض الهوائية والرئتين 3. في البشر العقدة العقداء تقف وحدها، ولكن في الماوس وتنصهر ذلكمع العقدة الوريد، والتي يعصب أيضا الرئتين 4. وغالبا ما تسمى هذه العقدة تنصهر الوداجي / معقدة كثير العقد، العقدة العصب الحائر، أو ببساطة العقدة العقداء 5. هنا، ويشار إليها باسم العقدة العقداء. الألياف وارد في كثير العقد تمرير المعلومات من الأحشاء لنواة السبيل المفرد (NTS) في الدماغ. المدخلات الحسية لهذه العقدة فريدة يسيطر على مجموعة متنوعة من الوظائف، مثل الأمعاء على الحركة 6، 7 معدل ضربات القلب والتنفس 8،9، واستجابات الجهاز التنفسي تنشيط إزعاج 10،11. مع هذا التنوع في الوظائف وأجهزة معصب، فمن الأهمية بمكان لاستهداف وعزل القطعان-جهاز معين من العقدة العقداء من أجل دراسة مسارات العصبية الفردية. ومع ذلك، ونظرا لصغر حجم كثير العقد وعدد محدود من الخلايا العصبية التي يتضمنها هذا ليس بالأمر الهين. كل فأر كثير العقد العقدة يحتوي على ما يقرب من 5000 الخلايا العصبية 12بالإضافة إلى السكان واسعة من دعم الخلايا الأقمار الصناعية. من 5000 الخلايا العصبية العقداء، فقط 3-5٪ يعصب الشعب الهوائية. ولذلك، فإن أي تغييرات وظيفية، المورفولوجية أو الجزيئية في الخلايا العصبية الهوائية-التعصيب، بسبب تحفيز الجهاز التنفسي أو أمراض، سوف تضيع في العقدة العقداء المزدحمة بالسكان. لحل هذه المشكلة، تم تطوير طريقة لتحديد وعزل الخلايا العصبية التي يعصب الشعب الهوائية. تعرضت الشعب الهوائية إلى الصبغة الكاشفة الفلورسنت لتحديد اللاحقة الخلايا العصبية التعصيب كثير العقد. اختير سريع الأزرق من قبل الخلايا العصبية، ويسافر بسرعة إلى الهيئات المحمولة الخاصة بهم حيث يتم الاحتفاظ بها لمدة تصل إلى ثمانية أسابيع 13-15. وبمجرد تحديدها، وكان يستخدم لطيف، وكفؤ، بروتوكول التفكك للحفاظ على وضع العلامات صبغ وبقاء الخلية لفلوري خلية المنشط (FAC) وحدة الفرز. تستخدم الخلايا الترتيب لاستخراج الحمض النووي الريبي جودة عالية (RNA) لتحديد التعبير الجيني أو وأو غيرها من التحليل الجزيئي المصب. يوفر هذا البروتوكول تقنية مفيدة وقوية لعزل الخلايا العصبية الحسية التي يعصب على الأنسجة من الاهتمام.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="942">
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:405px;">Fast Blue</td>
			<td style="width:157px;">Polysciences, Inc.</td>
			<td style="width:132px;">17740-2</td>
			<td style="width:248px;">stock 2 mg/ml in water</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">NeuroTrace 530/615 red Nissle stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>N21482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D128-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:405px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">glutamine (Glutamax)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">N2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">B27 (no vitamin A)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Nerve Growth Factor (NGF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6009</td>
			<td>stock 50 &#181;g/ml in PBS/10% FBS</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">digestion enzyme, Liberase DH Research Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401054001</td>
			<td>stock 2.5 mg/ml in water</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">particle solution (Percoll)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1644-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Heating block</td>
			<td>LabNet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">70 um cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Absolute Ethanol (200 proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">RNase free water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2484-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">RNase decontamination reagent, RNase AWAY</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>10328-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-6010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">DNase kit, RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td>stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-10MG</td>
			<td>stock 10 &#181;g/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to target and isolate airway-innervating sensory neurons in mice

الأعصاب الحسية الجسدية تنبيغ الحرارية والميكانيكية والكيميائية، والمحفزات الضارة الناجمة عن كل من وكلاء الذاتية والبيئية. توجد أجسام الخلايا من هذه الخلايا العصبية وارد في العقد الحسية. العقد الحسية يعصب جهاز معين أو جزء من الجسم. على سبيل المثال، توجد العقد الجذرية الظهرية (DRG) في العمود الفقري وتوسيع العمليات في جميع أنحاء الجسم والأطراف. وتقع العقد مثلث التوائم في الجمجمة وعصب الوجه والمجاري التنفسية العليا. afferents العصب الحائر من العقد العقداء تمتد في جميع أنحاء الأمعاء والقلب والرئتين. الخلايا العصبية العقداء تسيطر مجموعة متنوعة من الوظائف مثل: معدل التنفس، وتهيج الشعب الهوائية، وردود الفعل السعال. وهكذا، لفهم والتعامل مع وظيفتها، فمن الأهمية بمكان لتحديد وعزل مجرى الهواء محددة العصبية الفرعية من السكان. في الماوس، ويتعرض الشعب الهوائية إلى الصبغة الكاشفة الفلورسنت، الوجبات الأزرق، للبحث عن المفقودين إلى الوراء ل-مجرى الهواء محددة كثير العقد العصبيةالصورة. ونأت العقدة العقداء ويستخدم مضان خلية المنشط (FAC) الفرز لجمع الخلايا إيجابية الصبغة. بعد ذلك، يتم استخراج الحمض النووي الريبي جودة عالية (RNA) من صبغ خلايا إيجابية لتسلسل الجيل القادم. باستخدام هذا الأسلوب الهوائية يتحدد التعبير الجيني العصبية محددة.

باستخدام هذه الطريقة، وصفت الخلايا العصبية الهوائية-التعصيب خلال غرس الأنف سريع الأزرق (الشكل 1A). بعد يومين، تظهر سريعة خلايا الأزرق المسمى في العقد العقيدي (الشكل 1C). هذه الخلايا تشكل 3-5٪ من مجموع السكان الخلايا العصبية من العقد ع?...

Watch this Scientific Journal Video about A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice at JoVE.com

A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.

طريقة لاستهداف وعزل مجرى الهواء-التعصيب الخلايا العصبية الحسية في الفئران

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...

a-method-to-target-isolate-airway-innervating-sensory-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.1K Views.  Yale University. Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.

Video: A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and learning and memory. There are four known families of PKC isoforms in vertebrates: classical PKCs (&alpha;, &beta;I, &beta;II and &gamma;), novel type I PKCs (&#949; and &eta;), novel type II PKCs (&delta; and &theta;), and atypical PKCs (&zeta; and &iota;). The classical PKCs are activated by Ca2+ and diacylclycerol (DAG), while the novel PKCs are activated by DAG, but are Ca2+-independent. The atypical PKCs are activated by neither Ca2+ nor DAG. In Aplysia californica, our model system to study memory formation, there are three nervous system specific PKC isoforms one from each major class, namely the conventional PKC Apl I, the novel type I PKC Apl II and the atypical PKC Apl III. PKCs are lipid-activated kinases and thus activation of classical and novel PKCs in response to extracellular signals has been frequently correlated with PKC translocation from the cytoplasm to the plasma membrane. Therefore, visualizing PKC translocation in real time in live cells has become an invaluable tool for elucidating the signal transduction pathways that lead to PKC activation. For instance, this technique has allowed for us to establish that different isoforms of PKC translocate under different conditions to mediate distinct types of synaptic plasticity and that serotonin (5HT) activation of PKC Apl II requires production of both DAG and phosphatidic acid (PA) for translocation 1-2. Importantly, the ability to visualize the same neuron repeatedly has allowed us, for example, to measure desensitization of the PKC response in exquisite detail 3. In this video, we demonstrate each step of preparing Sf9 cell cultures, cultures of Aplysia sensory neurons have been described in another video article 4, expressing fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells and in Aplysia sensory neurons and live-imaging of PKC translocation in response to different activators using laser-scanning microscopy.

In this video, we demonstrate visualization of PKC translocation in living cells using fluorescently tagged PKCs.

تصوير الحية إزفاء PKC في Sf9 خلايا في الخلايا العصبية والحسية Aplysia

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

الفيروسة البطيئة بوساطة التلاعب الجيني والتخيل من العصبونات الحسية الشمية في الجسم الحي</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

فلاش التحلل الضوئي للمركبات محبوس في سيليا من العصبونات الحسية الشمية

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

عزل الخلايا العصبية الحسية من<em&gt; Aplysia californica</em&gt; للحصول على التسجيلات المشبك التصحيح من التيارات الجلوتاميرجي

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

تسجيل داخل الخلايا، الحسي الميداني رسم الخرائط، والخلايا العصبية التي تم تحديدها في المستنزف، العلقة الطبية</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

كله من جبل Immunolabeling الشم مستقبلات الخلايا العصبية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الهوائي

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

إنتاج وعزل محاور عصبية من الخلايا العصبية الحسية لتحليل الكيمياء الحيوية باستخدام مرشحات المسامية

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

العزلة وثقافة فصل الخلايا العصبية الحسية من الفرخ الأجنة

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

طريقة بسيطة وغير مكلفة لتحديد الباردة الحساسية والتكيف في الفئران

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Dynamic Quantitative Sensory Testing to Characterize Central Pain Processing

Central facilitation and modulation of incoming nociceptive signals play an important role in the perception of pain. Disruption in central pain processing is present in many chronic pain conditions and can influence responses to specific therapies. Thus, the ability to precisely describe the state of central pain processing has profound clinical significance in both prognosis and prediction. Because it is not practical to record neuronal firings directly in the human spinal cord, surrogate behavior tests become an important tool to assess the state of central pain processing. Dynamic QST is one such test, and can probe both the ascending facilitation and descending modulation of incoming nociceptive signals via TS and CPM, respectively. Due to the large between-individual variability in the sensitivity to noxious signals, standardized TS and CPM tests may not yield any meaningful data in up to 50% of the population due to floor or ceiling effects. We present methodologies to individualize TS and CPM so we can capture these measures in a broader range of individuals than previously possible. We have used these methods successfully in several studies at the lab, and data from one ongoing study will be presented to demonstrate feasibility and potential applications of the methods.

By assessing pain in response to repetitive or different types of standardized stimuli, dynamic quantitative sensory testing (QST) can reveal changes in the central processing of pain. We present methods to optimize and individualize two dynamic QST measures: temporal summation (TS) and conditioned pain modulation (CPM).

طريقة لاستهداف وعزل مجرى الهواء-التعصيب الخلايا العصبية الحسية في الفئران

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

تصوير الحية إزفاء PKC في Sf9 خلايا في الخلايا العصبية والحسية Aplysia

الفيروسة البطيئة بوساطة التلاعب الجيني والتخيل من العصبونات الحسية الشمية في الجسم الحي

فلاش التحلل الضوئي للمركبات محبوس في سيليا من العصبونات الحسية الشمية

عزل الخلايا العصبية الحسية من

تسجيل داخل الخلايا، الحسي الميداني رسم الخرائط، والخلايا العصبية التي تم تحديدها في المستنزف، العلقة الطبية

كله من جبل Immunolabeling الشم مستقبلات الخلايا العصبية في

إنتاج وعزل محاور عصبية من الخلايا العصبية الحسية لتحليل الكيمياء الحيوية باستخدام مرشحات المسامية

العزلة وثقافة فصل الخلايا العصبية الحسية من الفرخ الأجنة

طريقة بسيطة وغير مكلفة لتحديد الباردة الحساسية والتكيف في الفئران

ديناميكية الكمية الحسية اختبار لوصف المعالجة المركزية الألم