Name: in vitro culture of epicardial cells from mouse embryonic heart
Uploaded: 2016-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart at JoVE.com

وأيد هذا العمل من جانب صناديق من دوق-جامعة سنغافورة الوطنية العليا الطبي مدرسة سنغافورة، ومؤسسة جوه وسنغافورة جبهة الخلاص الوطني الزمالة (جبهة الخلاص الوطني، NRFF2016-01) إلى Manvendra ك سينغ.

تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام ديوك-جامعة سنغافورة الوطنية كلية الدراسات العليا الطبية. 1. استرداد الجنينية البطينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضحية الماوس حاملا توقيت في المرحلة الجنينية المطلوب (E11.5 أو E12.5) باستخدام غرفة القتل الرحيم مع امدادات الغاز ثاني أكسيد الكربون أو أسلوب آخر القتل الرحيم المعتمدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس على ظهرها على طاولة تشريح. تطهير البطن من الأنثى مع الايثانول 70٪. رفع الجلد فوق البطن وإجراء شق صغير (1-2 سم) مع شفرة، ثم اضغط على الجلد بكلتا يديه وسحب بعيدا لفضح جدار البطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن قطع جدار البطن لفضح قرن الرحم. استخدام ملقط معقم لرفع قرن الرحم وقطع بعناية بعيدا أنسجة الدهون والأوعية الدموية التي تعلق على قرن الرحم. قطع في عنق الرحم لاسترداد الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع قرن الرحم في طبق بتري تحتوي على العقيمة الباردة 1X الفوسفات بوف<html> الدو المالحة (PBS) وشطف بلطف. وضع طبق بتري على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المقص لقطع طريق خط الوسط من قرن الرحم (مقابل إلى الموقع حيث يقع المشيمة) لفضح الأجنة التي لا تزال داخل الكيس المحي وتعلق على جدار الرحم عن طريق المشيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط معقم، وقطع فتح الكيس المحي الجنينية لتحرير الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجنين في طبق بتري جديدة تحتوي على العقيمة الباردة برنامج تلفزيوني 1X. قطع رأس الجنين ووضعه على ظهرها. قطع مفتوحة في جدار الصدر للكشف عن القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط معقم لرفع القلب وقطع الأوعية حوله لتحرير القلب من جدار الصدر. إيلاء اهتمام خاص على عدم الإضرار النخاب من القلب مع الأدوات الجراحية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم قبالة المسالك تدفق وكل من الأذينين. نقل البطين إلى طبق آخر مع 1X PBS الباردة. وضع الطبق على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 1،6-1،9 حتى يتم استرداد جميع البطينين. </li></ol>لو &quot;&gt; 2. النخابية يزدرع الثقافة ملاحظة: ثقافة هذه إإكسبلنتس النخابية إما على الشرائح غرفة زجاجية أو في جل الكولاجين لتطبيقات المصب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زجاج غرفة الشرائح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد وسائل الإعلام والثقافة، وإضافة 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين و2 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية المؤتلف 2 (FGF2) إلى متوسطة تعديل النسر Dulbecco وفي (DMEM). تنفيذ كافة الخطوات في غطاء تدفق الصفحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة وسائط الثقافة 500 ميكرولتر إلى كل بئر من غرفة 8-جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كل البطين رفعه في وسط البئر. توجيه البطين للحفاظ على الجانب تشريح أسفل على السطح السفلي من البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع بلطف لوحة في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 ثقافة الخلية الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الثقافة مع الحد الأدنى من اضطراب للسماح للإإكسبلنتس على الانضمام. تشكيل أحادي الطبقة النخابية يمكن ملاحظتها بعد 48-72 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتمايز epicardخلايا الاتحاد العالمي للتعليم في خلايا العضلات الملساء والثقافة الخلايا أحادي الطبقة النخابية في وسائل الإعلام التمايز لمدة 6 أيام أخرى. لإعداد وسائل الإعلام التمايز، وإضافة 10٪ FBS، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين و 50 نانوغرام / مل المؤتلف عامل النمو التحويلي بيتا 1 (TGF-β1) لDMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير ثقافة وسائل الإعلام يوما بعد يوم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكولاجين جل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير هلام الكولاجين في لوحة 96-جيدا باستخدام مجموعة 3D الكولاجين الثقافة التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد حجم المطلوب من هلام الكولاجين، وخلط كمية مناسبة من محلول الكولاجين مع 5X من DMEM وماصة صعودا وهبوطا. الحل يجب أن تتحول الصفراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم المقابلة من حل المعادلة وتخلط جيدا فورا من قبل pipetting صعودا وهبوطا. فإن الحل بدوره الوردي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 100 ميكرولتر من هذا الخليط في كل بئر من لوحة 96-جيدا. وضع لوحة في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 30-60 دقيقة إلى alانخفاض هلام لتتبلمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة المذكورة أعلاه إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كل البطين رفعه في وسط البئر. الشرق البطين للحفاظ على الجانب تشريح أسفل على جل الكولاجين (قمة البطين يجب مواجهة مجرب). وضع بلطف لوحة مرة أخرى في حاضنة الثقافة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 3 أيام، وإزالة البطينين. وضع لوحة العودة إلى الحاضنة زراعة الخلايا لمدة 2 ايام اخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير ثقافة وسائل الإعلام يوما بعد يوم. </li></ol></li></ol> 3. التثبيت والتخيل ملاحظة: يمكن تصور خلايا النخابية على أي من الشرائح الزجاجية غرفة أو هلام الكولاجين. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح من وسائل الإعلام والثقافة، وإضافة حجم مساو من العقيمة برنامج تلفزيوني 1X لغسل الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ما يكفي 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لتغطية الخلايا. إصلاح الخلايا لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PFA وتغسل إإكسبلنتس مع 1X PBST (برنامج تلفزيوني 1X مع0.1٪ X-100 تريتون) لpermeabilize الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunostain مع الأجسام المضادة المطلوبة (مثل اليكسا فلور 488 phalloidin، ZO-1، α-تويولين وα السلس الأكتين العضلات) 7. </li></ol>

<ol>
	<li>Mikawa, T., Fischman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+analysis+of+cardiac+morphogenesis:+discontinuous+formation+of+coronary+vessels.">Retroviral analysis of cardiac morphogenesis: discontinuous formation of coronary vessels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9504-9508 (1992).</li><li>Mikawa, T., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericardial+mesoderm+generates+a+population+of+coronary+smooth+muscle+cells+migrating+into+the+heart+along+with+ingrowth+of+the+epicardial+organ.">Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ.</a> Dev Biol. 174, 221-232 (1996).</li><li>Manner, J., Perez-Pomares, J. M., Macias, D., Munoz-Chapuli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+formation+and+developmental+significance+of+the+epicardium:+a+review.">The origin, formation and developmental significance of the epicardium: a review.</a> Cells Tissues Organs. 169, 89-103 (2001).</li><li>Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium-derived+cells+contribute+a+novel+population+to+the+myocardial+wall+and+the+atrioventricular+cushions.">Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions.</a> Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).</li><li>von Gise, A., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+and+epicardial+epithelial+to+mesenchymal+transitions+in+heart+development+and+disease.">Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease.</a> Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).</li><li>Katz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+compartments+of+the+proepicardial+organ+give+rise+to+coronary+vascular+endothelial+cells.">Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells.</a> Dev Cell. 22, 639-650 (2012).</li><li>Singh, M. K., Lu, M. M., Massera, D., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-processing+enzyme+Dicer+is+required+in+epicardium+for+coronary+vasculature+development.">MicroRNA-processing enzyme Dicer is required in epicardium for coronary vasculature development.</a> J Biol Chem. 286, 41036-41045 (2011).</li><li>Degenhardt, K., Singh, M. K., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+under+development:+cardiovascular+embryology+applied+to+heart+disease.">New approaches under development: cardiovascular embryology applied to heart disease.</a> J Clin Invest. 123, 71-74 (2013).</li><li>Singh, M. K., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium-derived+cardiac+mesenchymal+stem+cells:+expanding+the+outer+limit+of+heart+repair.">Epicardium-derived cardiac mesenchymal stem cells: expanding the outer limit of heart repair.</a> Circ Res. 110, 904-906 (2012).</li><li>Manner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+study+on+the+formation+of+the+epicardium+in+chick+embryos.">Experimental study on the formation of the epicardium in chick embryos.</a> Anat Embryol (Berl). 187, 281-289 (1993).</li><li>Manner, J., Schlueter, J., Brand, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+analyses+of+the+function+of+the+proepicardium+using+a+new+microsurgical+procedure+to+induce+loss-of-proepicardial-function+in+chick+embryos.">Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos.</a> Dev Dyn. 233, 1454-1463 (2005).</li><li>Pennisi, D. J., Ballard, V. L., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium+is+required+for+the+full+rate+of+myocyte+proliferation+and+levels+of+expression+of+myocyte+mitogenic+factors+FGF2+and+its+receptor,+FGFR-1,+but+not+for+transmural+myocardial+patterning+in+the+embryonic+chick+heart.">Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart.</a> Dev Dyn. 228, 161-172 (2003).</li><li>Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Bergwerff, M., Mentink, M. M., Poelmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+outgrowth+inhibition+leads+to+compensatory+mesothelial+outflow+tract+collar+and+abnormal+cardiac+septation+and+coronary+formation.">Epicardial outgrowth inhibition leads to compensatory mesothelial outflow tract collar and abnormal cardiac septation and coronary formation.</a> Circ Res. 87, 969-971 (2000).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+and+epicardial+derived+FGF+signals+regulate+myocardial+proliferation+and+differentiation+in+vivo.">Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo.</a> Dev Cell. 8, 85-95 (2005).</li><li>Merki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+retinoid+X+receptor+alpha+is+required+for+myocardial+growth+and+coronary+artery+formation.">Epicardial retinoid X receptor alpha is required for myocardial growth and coronary artery formation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18455-18460 (2005).</li><li>Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+and+retinoic+acid,+secreted+from+the+epicardium,+are+required+for+cardiac+myocyte+proliferation.">Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation.</a> Dev Biol. 255, 334-349 (2003).</li><li>Huang, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBP+transcription+factors+mediate+epicardial+activation+during+heart+development+and+injury.">C/EBP transcription factors mediate epicardial activation during heart development and injury.</a> Science. 338, 1599-1603 (2012).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+epicardium+modulates+myocardial+injury+by+secreting+paracrine+factors.">Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors.</a> J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).</li><li>Christoffels, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx18+and+the+fate+of+epicardial+progenitors.">Tbx18 and the fate of epicardial progenitors.</a> Nature. 458, 8-9 (2009).</li><li>Rudat, C., Kispert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wt1+and+epicardial+fate+mapping.">Wt1 and epicardial fate mapping.</a> Circ Res. 111, 165-169 (2012).</li><li>Duim, S. N., Kurakula, K., Goumans, M. J., Kruithof, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+endothelial+cells+express+Wilms'+tumor-1:+Wt1+expression+in+the+developing,+adult+and+infarcted+heart.">Cardiac endothelial cells express Wilms' tumor-1: Wt1 expression in the developing, adult and infarcted heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 81, 127-135 (2015).</li><li>Iyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+derivation+of+epicardium+and+its+differentiated+smooth+muscle+cell+progeny+from+human+pluripotent+stem+cells.">Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells.</a> Development. 142, 1528-1541 (2015).</li><li>Witty, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+the+epicardial+lineage+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 32, 1026-1035 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

ومن محوريا لتطوير التقنيات التي تسهل دراسة النخاب لتلبية الأهمية المتزايدة للالنخاب في التنمية القلب والتجدد. نظام الثقافة النخابية يطرح مزايا هامة للبحث النخابية. وسيلة بديلة لعزل الخلايا النخابية هو استخدام مضان تنشيط الفرز ...

وقد أوضح ثروة من البيانات التجريبية أن النخاب يؤثر خطوات حاسمة في تطوير القلب. خلال التنمية، والمستعرض الحاجز يؤدي إلى كتلة من الخلايا الظهارية المعروفة باسم proepicardium 1-4. خلايا من proepicardium ثم تهاجر ومغلف عضلة القلب تشكيل النخاب. وفي أعقاب ذلك، مجموعة فرعية من الخلايا النخابية الخضوع EMT مما أدى إلى هجرة السكان من الخلايا المشتقة النخاب (EPDCs) التي تغزو في وقت لاحق عضلة القلب. وقد أظهرت النسب الوراثي وكذلك فيروسات تتبع التجارب التي EPDCs تفرق في مختلف الأنساب بما في ذلك خلايا العضلات الملساء، الخلايا الليفية، الخلايا البطانية والعضلية (إن وجدت). لذلك EPDCs تساهم بشكل كبير في تطوير الأوعية الدموية التاجية والهندسة المعمارية عضلة القلب 1،2،4-9. وعلاوة على ذلك، فإن النخاب أمر ضروري لتطوير طبقة المدمجة البطين 10-12. لهأظهرت xample Gittenberger دي غروت آخرون أن تثبيط آل إليه proepicardium يؤدي إلى مجموعة من العيوب مثل عضلة القلب رقيقة، حلقات ناقصة من القلب وغير طبيعي تشكيل حاجز بين البطينين، ونتيجة لذلك، الفتك الجنينية 13. عوامل نظير الصماوي يفرز من النخاب الجنينية تعدل انتشار cardiomyocyte والتمايز. واتساقا مع ذلك، أدى الحذف النخاب معين من مسارات الإشارات مثل حمض الريتينويك (RA)، وعوامل نمو الخلايا الليفية (عوامل النمو FGFs) وWNT / β-كاتينين في نمو عضلة القلب المعيبة والفتك الجنينية 14-16. على الرغم من أنه يعتقد بأن النخاب أن تكون هادئة في قلوب الكبار، وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن يتم إعادة تنشيط البرنامج التنموي في النخاب التالية إصابة القلب 17،18. عند التنشيط، والخلايا تخضع انتشار السريع وEMT التي تؤدي إلى تشكيل EPDC. هذه الخلايا تحدث نفس capacitذ أن تفرق في الخلايا الليفية وخلايا العضلات الملساء ولكن ليس العضلية أو الخلايا البطانية 18. بالإضافة إلى ذلك، EPDCs تفرز عوامل proangiogenic التي تساعد في الأوعية الدموية في المنطقة المصابة، وبالتالي تسهل تحسين وظيفة القلب عن طريق تقليل حجم احتشاء. ونظرا لهذه النتائج، اكتسبت النخاب الفائدة في دراسة التطور القلب والأوعية الدموية والأمراض والتجدد. التكنولوجيا المعدلة وراثيا قد أحدثت ثورة الأبحاث الطبية في القرن ال21. مع المعونة من التكنولوجيا المعدلة وراثيا، ونماذج الماوس المريضة محاكاة حالة الإنسان عملية الأيض وpathophysiologically وقد وضعت بنجاح. ومع ذلك، فقد تم دراسة سلوك الخلية النخابية في هذه المسوخ تحديا ويرجع ذلك أساسا إلى الفتك الجنينية المبكرة. وبالنظر إلى الدور الهام الذي النخاب يلعب في التنمية القلب والتجديد، وأنشأنا نظام الثقافة في المختبر لعلاية الفؤاد الماوسخلايا لتر. وتسمح هذه الطريقة للثقافة على المدى الطويل من الخلايا النخابية ويسهل دراسة مفصلة لاثنين من الخصائص الهامة للالنخاب: قدرته على الهجرة والتمييز. يمكن زرع البطينين المستأصل من الماوس على المواد الهلامية الكولاجين والتي يمكن استخدامها لإجراء فحوصات الهجرة. يتم تربيتها في مصفوفة 3D أن يعيد مصفوفة الكولاجين الغنية خارج الخلية في الطبقة تحت التأمور يلخص في الجسم الحي خلية علم وظائف الأعضاء بشكل أفضل. وبدلا من ذلك يمكن تربيتها على الشرائح غرفة من أجل إنشاء أحادي الطبقة النخابية التي يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التطبيقات المصب. هذا أحادي الطبقة يمكن أن تستخدم لصبغ للبروتينات تقاطع الضيقة التي ستوفر رؤى حول قدرة النخاب الخضوع EMT وهو أمر حاسم للهجرة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن يتم التجارب التمايز الخروج على هذه الخلايا. وعلاوة على ذلك، يمكن تحليل الجينات الشخصية التعبير عن طريق استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا وأداء الكمي تفاعل البلمرة المتسلسل (QPCR). وأخيرا، يمكن أيضا التعامل مع الطبقات الوحيدة مع وكلاء تليها التحليل الجزيئي لاختبار العلاجات المحتملة. وضعت معا، وهذا النظام الثقافة النخابية يوفر لنا الفرصة لتصور وجمع البيانات الجزيئية التي تعزز فهمنا حول تطوير النخابية. ميزة أخرى مرغوبة من هذا الأسلوب هو أنه واضح وصريح وليس هناك حاجة الإعداد مزيدا من التفاصيل. باختصار، يتم حصاد الأجنة في E11.5 أو E12.5 يلي الذي رفعه القلب. البطينين ثم يتم تربيتها على أي هلام الكولاجين أو الشرائح غرفة. وفي وقت لاحق، وهذه الخلايا يمكن استخدامها لإجراء التجارب المصب.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium (DMEM)</td><td>Life tech invitrogen&amp;nbsp;</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin solution</td><td>Life tech invitrogen&amp;nbsp;</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)&amp;nbsp;</td><td>Life tech invitrogen&amp;nbsp;</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2)</td><td>PeproTech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-&amp;beta;1)</td><td>PeproTech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 antibody</td><td>Life tech invitrogen&amp;nbsp;</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Tubulin antibody</td><td>Sigma</td><td>T 6074</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-smooth muscle actin (SMA) antibody</td><td>Sigma</td><td>A 2547</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin antibody</td><td>Life tech invitrogen&amp;nbsp;</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>3D Collagen Culture kit&amp;nbsp;</td><td>Millipore&amp;nbsp;</td><td>ECM 675</td><td></td></tr><tr><td>8-well chamber slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>NNU 154534-PK</td><td></td></tr><tr><td>Trizol reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 Real-Time PCR System</td><td>Life Technologies</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>Superscript First Strand Synthesis kit</td><td>Life Technologies</td><td>11904-018</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro culture of epicardial cells from mouse embryonic heart

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-&#946;1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.

باستخدام هذا البروتوكول الثقافة، والخلايا النخابية الأولية يمكن أن تكون معزولة مع نقاء عالية للتطبيقات المصب. الخلايا المستنبتة هي قادرة على الخضوع EMT، الهجرة وتفرق تماما كما تفعل الخلايا النخابية في الجسم الحي. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-pag...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart at JoVE.com

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

في المختبر ثقافة خلايا النخابية من الفأر الجنينية القلب

The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium ...

in-vitro-culture-of-epicardial-cells-from-mouse-embryonic-heart

Research

JoVE Journal

Engineering

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

7.3K Views.  Duke-NUS Graduate Medical School. The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells. 

Video: In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing cardiovascular progenitors during development and disease. While a number of factors have been implicated in epicardium-derived cell (EPDC) mobilization, the mechanisms governing their subsequent migration and differentiation are poorly understood. Here, we present in vitro and ex vivo strategies to study EPDC motility and differentiation. First, we describe a method of obtaining primary epicardial cells by outgrowth culture from the embryonic mouse heart. We also introduce a detailed protocol to assess three-dimensional migration of labeled EPDC in an organ culture system. We provide evidence using these techniques that genetic deletion of myocardin-related transcription factors in the epicardium attenuates EPDC migration. This approach serves as a platform to evaluate candidate modifiers of EPDC biology and could be used to develop genetic or chemical screens to identify novel regulators of EPDC mobilization that might be useful for cardiac repair.

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

النخابية ثمرة ثقافة الفحص و<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; تقييم هجرة الخلايا المشتقة النخابية-

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Developmental Biology

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

بالعزلة وثقافة الخلايا Epicardial الأولية المستمدة من عينات من قلب الكبار والأجنة البشرية

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in developmental cardiology have led to generating cardiac cells from pluripotent stem cells, it is unclear if the two cardiac fields - the first and second heart fields (FHF and SHF) &#8212; are induced in pluripotent stem cells systems. To address this, we generated a protocol for in vitro specification and isolation of heart field-specific cardiac progenitor cells. We used embryonic stem cells lines carrying Hcn4-GFP and Tbx1-Cre; Rosa-RFP reporters of the FHF and the SHF, respectively, and live cell immunostaining of the cell membrane protein Cxcr4, a SHF marker. With this approach, we generated progenitor cells which recapitulate the functional properties and transcriptome of their in vivo counterparts. Our protocol can be utilized to study early specification and segregation of the two heart fields and to generate chamber-specific cardiac cells for heart disease modelling. Since this is an in vitro organoid system, it may not provide precise anatomical information. However, this system overcomes the poor accessibility of gastrulation-stage embryos and can be upscaled for high-throughput screens.

The purpose of this method is to generate heart field-specific cardiac progenitor cells in vitro in order to study the progenitor cell specification and functional properties, and to generate chamber specific cardiac cells for heart disease modelling.

في المختبر جيل من خلايا القلب القلب حقل محدد

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

التحوير القائم على التثقيب الكهربائي لخلايا القلب في قلوب الفئران

An Efficient Transgenesis Approach for Gene Delivery in the Mouse Embryonic Heart

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, and fate of these progenitors are vital for the proper development of this organ. The molecular mechanisms that govern the morphogenesis of the heart are essential for understanding the pathogenesis of congenital heart diseases and embryonic cardiac regeneration. Classical approaches to investigate these mechanisms employed the generation of transgenic mice to assess the function of specific genes during cardiac development. However, mouse transgenesis is a complex, time-consuming process that often cannot be performed to assess the role of specific genes during heart development. To address this, we have developed a protocol for efficient electroporation and culture of mouse embryonic hearts, enabling transient transgenesis to rapidly assess the effect of gain- or loss-of-function of genes involved in cardiac development. Using this methodology, we successfully overexpressed Meis1 in the embryonic heart, with a preference for epicardial cell transfection, demonstrating the capabilities of the technique.

تسليط الضوء على المؤلف: تحويل خلايا القلب لفحص الجينات السريع

This protocol presents a detailed methodological framework for electroporation-based transgenesis of cardiac cells in developing mouse hearts. The video assets provided here will facilitate learning of this versatile technique.

نهج فعال للجينات المعدلة لتوصيل الجينات في القلب الجنيني للفأر

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, ...

Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial arrhythmia triggers in mice. To investigate the electrical and biological properties of cardiac melanocytes we developed a procedure to isolate them from mouse hearts that we derived from those designed to isolate neonatal murine cardiomyocytes. In order to obtain healthier cardiac melanocytes suitable for more extensive patch clamp or biochemical studies, we developed a refined procedure for isolating and plating cardiac melanocytes based on those originally designed to isolate cutaneous melanocytes. The refined procedure is demonstrated in this review and produces larger numbers of healthy melanocyte-like cells that can be plated as a pure population or with cardiomyocytes.

In this protocol, we identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial arrhythmia triggers in mice.&#160;

عزل الخلايا الصباغية تشبه الأولية من القلب ماوس

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial ...

Biology

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

العزلة وثقافة الأطفال حديثي الولادة ماوس العضلية

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

رواية<em&gt; خارج الحي</em&gt; الطريقة الثقافة لالجنينية القلب

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

عزلة الجنينية البطيني الخلايا البطانية

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

في المختبر ثقافة خلايا النخابية من الفأر الجنينية القلب

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

النخابية ثمرة ثقافة الفحص و

بالعزلة وثقافة الخلايا Epicardial الأولية المستمدة من عينات من قلب الكبار والأجنة البشرية

في المختبر جيل من خلايا القلب القلب حقل محدد

نهج فعال للجينات المعدلة لتوصيل الجينات في القلب الجنيني للفأر

نهج فعال للجينات المعدلة لتوصيل الجينات في القلب الجنيني للفأر

نهج فعال للجينات المعدلة لتوصيل الجينات في القلب الجنيني للفأر

عزل الخلايا الصباغية تشبه الأولية من القلب ماوس

العزلة وثقافة الأطفال حديثي الولادة ماوس العضلية

رواية

عزلة الجنينية البطيني الخلايا البطانية