هذا البحث معتمد من قبل "منظمة هولندا" للعلمية البحثية (جمعية البحث العلمي الهولندية) (يني 016.146.079) وزمالة "أبحاث لومك" على كل من هيئة علماء المسلمين، ومؤسسة بونتيوس لومك (MJG).

كل التجارب مع عينات الأنسجة البشرية أقرتها لجنة الأخلاقيات المركز الطبي بجامعة ليدن، ويتفق مع "إعلان هلسنكي". يتم تنفيذ كافة الخطوات مع المعدات المعقمة في تدفق ثقافة الخليوي مجلس الوزراء.
1-الأعمال التحضيرية
<ol><li>إعداد متوسطة أبدك بخلط دولبيكو للمتوسطة تعديل النسر (دميم منخفضة-الجلوكوز) والمتوسطة 199 (M199) بنسبة 1:1. أضف إبطال الحرارة 10% مصل بقرى الجنين (FBS، الحرارة غير نشط لمدة 25 دقيقة في 56 درجة مئوية) والملحق مع 100 البنسلين يو/مليلتر وستربتوميسين 100 ملغ/مل. قبل الحارة المتوسطة أبدك في حمام مائي 37 درجة مئوية.</li>
	<li>قبل الحارة التربسين 0.25%/EDTA (1:1) في حمام مائي 37 درجة مئوية.</li>
	<li>معطف الآبار مع الجيلاتين. إضافة 0.1% جيلاتين/برنامج تلفزيوني لكل بئر واحتضان لوحات لمدة 15 دقيقة على الأقل في 37 درجة مئوية. ويرد في الجدول 1المبادئ التوجيهية للوحة الثقافة الخلية المطلوبة. بعناية إزالة جميع السوائل قبل طلاء الخلايا.</li>
	<li>إعداد حل أسهم من 10 مم SB431542 (SB)، تضعف في [دمس] (تحذير). جعل 50 ميليلتر مختبرين في أنابيب الطرد المركزي البوليبروبيلين مخروطية الشكل السفلي، مثل أنابيب ايبندورف، وتخزينها في-20 درجة مئوية. لاحظ أنه يمكن أن يكون مذاب مختبرين SB مرة واحدة فقط.</li>
</ol>2-استرجاع وتخزين العينات قلب الكبار والجنين
<ol><li>تخزين اذينات الكبار البشرية مباشرة عند إزالة أثناء عملية جراحية في أنبوب 50 مل مع 15 مل دميم الجلوكوز العالية التي تحتوي على 10% FBS و 100 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين 100 مغ/مل عند 4 درجة مئوية. بشكل عام من 3-5 سم في حجم العينات ويمكن تخزين تصل إلى 48 ساعة بعد التشريح.</li>
	<li>تخزين قلوب الأجنة التي تم الحصول عليها من مواد الإجهاض الاختيارية في المتوسط أبدك عند 4 درجة مئوية تصل إلى 24 ساعة بعد عزلة. لهذا البروتوكول، واستخدام العينات مع عمر الحملي بين 12-22 أسبوعا. علما بأن قلب كله يمكن أن تستخدم لعزل ابيكارديوم.</li>
</ol>3-عزل طبقة ابيكارديال
<ol><li>تدفق الصفحي مجلس الوزراء، تحضير طبق زراعة خلايا 100 ملم مع برنامج تلفزيوني ومكان معالجة تجميعية منفصلة (~ 200 ميليلتر) لبرنامج تلفزيوني في الغطاء. ملء أنبوب 15 مل مع 5 مل المعالجون مسبقاً أبدك المتوسطة.</li>
	<li>وضع الأنسجة في الطبق خلية ثقافة مليئة ببرنامج تلفزيوني. تأكد من أن الأنسجة هو مبلل كثيرا أثناء الإجراء.</li>
	<li>استخدام ستيريوميكروسكوبي، إزالة قدر من طبقة ابيكارديال من عينة الأنسجة قدر الإمكان يسقط استخدام الملقط. ملاحظة: يمكن التعرف ابيكارديوم كطبقة رقيقة جداً وشفافة محكم انضمت إلى خارج القلب (الشكل 1A). في محاولة لتجنب التلوث مع epicardial الأنسجة الدهنية والأوعية الدموية منذ هذا سوف تعوق العزلة.</li>
	<li>جمع قطع من الأنسجة ابيكارديال في الحبرية من برنامج تلفزيوني على الغطاء.</li>
	<li>قطع الأنسجة ابيكارديال إلى قطع صغيرة (0.5 مم3) استخدام مشرط (الشكل 1B)، أو باستخدام نصائح حادة من ملقط صغير. ملاحظة أن القطع يجب أن تكون قادرة على تمرير P1، 000 بيبيت نصيحة (الخطوة 3، 6).</li>
	<li>أضف 1 مل التربسين للأنسجة ابيكارديال وجمع القطع والتربسين مع P1، 000 بيبيت تلميح. نقل الأنسجة في أنبوب 1.5 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي (الشكل 1).</li>
	<li>احتضان الأنبوبة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، بينما تهز ~ 60 لفة في الدقيقة.</li>
	<li>إزالة الأنبوب من حوض ماء، وتنظيف الجزء الخارجي الأنبوب مع الإيثانول 70%.</li>
	<li>تسمح الأنسجة تنزل إلى الجزء السفلي من الأنبوب (الشكل 1) ونقل المادة طافية تحتوي على خلايا ابيكارديال إلى أنبوب 15 مل يحتوي على 5 مل أبدك المتوسطة لإلغاء تنشيط التربسين عناية.</li>
	<li>تجديد الأنسجة المتبقية في الأنبوب الطرد المركزي المخروطية مع التربسين 1 مل، وتخلط بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً.</li>
	<li>كرر الخطوة 3، 3، 7 إلى 10 مرتين. في الخطوة الأخيرة، بعد ما مجموعة 30 دقيقة من حضانة التربسين، نقل المادة طافية والأنسجة ابيكارديال المتبقية في أنبوب يحتوي على أبدك المتوسطة.</li>
	<li>عندما يتم جمع كافة الخلايا في المتوسط أبدك، بلطف تمرير التعليق عن طريق حقنه 10 مل بإبرة قياس 19 في أنبوب 15 مل جديدة أن تنأى ميكانيكيا بالخلايا (الشكل 1E). ملاحظة: تأكد من مجانسة التعليق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً قبل تمرير الحل عن طريق الإبرة لمنع الإبرة الحصول على إعاقة.</li>
	<li>للمزيد ننأى بالخلايا، كرر الخطوة 3.12 بإبرة قياس 21.</li>
	<li>ضع مصفاة خلية 100 ميكرومتر على رأس أنبوب 50 مل ونقل متوسطة تحتوي على خلايا ابيكارديال على مصفاة استخدام ماصة 10 مل لإزالة كافة كتل المتبقية (الشكل 1F).</li>
	<li>أغسل مصفاة لجمع الخلايا المتبقية من بيبيتينج 5 مل أبدك المتوسطة إلى المصفاة.</li>
	<li>بيبيت تعليق خلية من أنبوب 50 مل في أنبوب 15 مل. منذ بالوعة الخلايا إلى الجزء السفلي من الأنبوب، اهتز الحل بلطف قبل بيبيتينج. ملاحظة: في حين أن هذه الخطوة ليست ضرورية، أنبوب أصغر الإيدز التصور بيليه بعد الطرد المركزي.</li>
	<li>الطرد المركزي في 200 غ س لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (الشكل 1).</li>
	<li>إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية (الشكل 1 ح) في وحدة التخزين المطلوب من أبدك المتوسطة (الجدول 1). ملاحظة: للجنين ابدكس، مباشرة استخدام أبدك المتوسطة التي تحتوي على 10 ميكرون من مثبط كيناز ALK5 (أبدك + س). يمكن مطلي خلايا البالغين دون SB أثناء مرور أول.</li>
	<li>لوحة تعليق خلية على لوحات الثقافة الجيلاتين المغلفة (1I الشكل). يعتمد حجم البئر على حجم العينة الأنسجة ابيكارديال (الجدول 1). علما أن كونفلوينسي المنخفضة سوف تحفز حدوث EMT.</li>
	<li>وضع الخلايا في الحاضنة لمالا يقل عن 48 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 للسماح للخلايا لإرفاق لوحة الثقافة.</li>
</ol>4-ثقافة ابدكس
<ol><li>تجديد المتوسطة أبدك + SB على الأقل كل 3 أيام.</li>
	<li>فحص الخلايا على الأقل كل 3 أيام باستخدام المجهر. عندما تصل الخلايا إلى كونفلوينسي، أيعند لوحة الثقافة مغطى تماما بالخلايا، وممر الخلايا بنسبة 1:2 سطحية. ملاحظة يمكن أن يستغرق التوصل إلى كونفلوينسي ~ 5-10 أيام.<ol>
<li>نضح المتوسطة استخدام نظام الشفط أو بيبيت مع، مثلاً، بيبيت زجاج.</li>
		<li>غسل الخلايا بعناية عن طريق إضافة برنامج تلفزيوني للخلايا. بلطف دوامة اللوحة ونضح برنامج تلفزيوني.</li>
		<li>إضافة التربسين اللوحة. تدوير بلطف لوحة لتغطية كافة الخلايا مع التربسين واحتضان لوحة لمدة 1 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ملاحظة: استخدم التربسين قليلاً قدر الإمكان (إشارة: لوحة 200 ميليلتر الواحدة من 6 جيدا جيدا)</li>
		<li>انقر فوق لوحة ميكانيكيا فصل الخلايا من الجزء السفلي من اللوحة. استخدام المجهر للتحقق بصريا إذا فصل الخلايا. إذا لم يكن الأمر كذلك، احتضان لوحة الثقافة الخلية دقيقة إضافية.</li>
		<li>إضافة وحدة التخزين المطلوبة من أبدك + SB المتوسطة للخلايا وريسوسبيند من بيبيتينج صعودا وهبوطاً، ونقل تعليق خلية لوح جيلاتين مغلفة ثقافة جديدة. ملاحظة: بشكل عام، الخلايا يمكن أن يوضع في مورفولوجيا حصاة كبيرة تصل إلى مرور 8.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5-تحريض EMT في ابدكس
<ol><li>للحث على EMT، ننأى بالخلايا مع التربسين ونقل الخلايا إلى الجيلاتين جديدة مغلفة بابار في نسبة 1:2 سطحية في المتوسط أبدك + بينالي الشارقة، كما هو موضح في 4، واحتضان لمالا يقل عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5% CO2.</li>
	<li>الاختيار إذا كونفلوينسي من 50-70%، وإذا ابدكس مورفولوجيا حصاة كبيرة. ملاحظة: كونفلوينسي يؤثر على قدرة ابدكس على الخضوع EMT.</li>
	<li>نضح المتوسطة من الخلايا، وتغسل الخلايا بعناية مع برنامج تلفزيوني (راجع الخطوة 4.2.1-4-2-2).</li>
	<li>تنشيط الخلايا مع 1 نانوغرام/مل TGFβ3 في المتوسط أبدك ووضعها في حاضنة في 37 درجة مئوية، 5% CO2 لمدة 5 أيام. علما بأن خلال التحفيز، وليس لديه المتوسطة أبدك التي تحتوي على TGFβ3 أن تتجدد.</li>
	<li>رصد الخلايا يوميا. بعد 5 أيام، يتم التعرف على الخلايا التي خضع EMT بالتشكل على شكل محور الدوران (الشكل 2A).</li>
	<li>الثقافة على شكل شوكي ابدكس وفقا للطريقة الموضحة في 4 دون SB أو TGFβ بالإضافة إلى المتوسطة أبدك. لاحظ أنه بشكل عام، يمكن مثقف ابدكس على شكل المغزل حتى مرور 20.</li>
	<li>التحقق من صحة وقوع EMT مع تلطيخ إيمونوفلوريسسينت باستخدام أجسام مضادة ضد αSMA علامات الوسيطة أو فيمنتين أو فالويدين للكشف عن تشكيل ألياف الأكتين و الإجهاد (الشكل 2)، أو باستخدام qRT PCR EMT-المتعلقة الجينات ( مثل، WT1، بيريوستين، Col1A1، αSMA، N-كادهيرين، MMP3، الحلزون، سبيكة) (الشكل 2 و الجدول 2).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epicardium+as+a+source+of+multipotent+adult+cardiac+progenitor+cells:+Their+origin,+role+and+fate.">The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate.</a> Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).</li><li>Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+human+embryonic+and+foetal+epicardium+during+heart+development.">Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development.</a> Development. 142 (21), 3630-3636 (2015).</li><li>Zhou, B., Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+progenitors+contribute+to+the+cardiomyocyte+lineage+in+the+developing+heart.">Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart.</a> Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).</li><li>Smits, A., Riley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium-Derived+Heart+Repair.">Epicardium-Derived Heart Repair.</a> Journal of Developmental Biology. 2 (2), 84-100 (2014).</li><li>Chen, T. H. P., Chang, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+Induction+of+Fetal+Cardiomyocyte+Proliferation+via+a+Retinoic+Acid-Inducible+Trophic+Factor.">Epicardial Induction of Fetal Cardiomyocyte Proliferation via a Retinoic Acid-Inducible Trophic Factor.</a> Developmental Biology. 250 (1), 198-207 (2002).</li><li>Pennisi, D. J., Ballard, V. L. T., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium+is+required+for+the+full+rate+of+myocyte+proliferation+and+levels+of+expression+of+myocyte+mitogenic+factors+FGF2+and+its+receptor,+FGFR-1,+but+not+for+transmural+myocardial+patterning+in+the+embryonic+chick+heart.">Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart.</a> Developmental Dynamics. 228 (2), 161-172 (2003).</li><li>Lavine, K. J., Yu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+and+epicardial+derived+FGF+signals+regulate+myocardial+proliferation+and+differentiation+in+vivo.">Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo.</a> Developmental Cell. 8 (1), 85-95 (2005).</li><li>Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+and+retinoic+acid,+secreted+from+the+epicardium,+are+required+for+cardiac+myocyte+proliferation.">Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation.</a> Developmental biology. 255 (2), 334-349 (2003).</li><li>M&#228;nner, J., Schlueter, J., Brand, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+analyses+of+the+function+of+the+proepicardium+using+a+new+microsurgical+procedure+to+induce+loss-of-proepicardial-function+in+chick+embryos.">Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos.</a> Developmental Dynamics. 233 (4), 1454-1463 (2005).</li><li>Weeke-Klimp, A., Bax, N. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium-derived+cells+enhance+proliferation,+cellular+maturation+and+alignment+of+cardiomyocytes.">Epicardium-derived cells enhance proliferation, cellular maturation and alignment of cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (4), 606-616 (2010).</li><li>Eralp, I., Lie-Venema, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+Artery+and+Orifice+Development+Is+Associated+With+Proper+Timing+of+Epicardial+Outgrowth+and+Correlated+Fas+Ligand+Associated+Apoptosis+Patterns.">Coronary Artery and Orifice Development Is Associated With Proper Timing of Epicardial Outgrowth and Correlated Fas Ligand Associated Apoptosis Patterns.</a> Circulation Research. 96 (5), (2005).</li><li>Kelder, T. P., Duim, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epicardium+as+modulator+of+the+cardiac+autonomic+response+during+early+development.">The epicardium as modulator of the cardiac autonomic response during early development.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 251-259 (2015).</li><li>van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., van den Hoff, M. J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration+from+activated+epicardium.">Cardiac regeneration from activated epicardium.</a> PloS one. 7 (9), e44692 (2012).</li><li>Zhou, B., Honor, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+epicardium+modulates+myocardial+injury+by+secreting+paracrine+factors.">Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors.</a> The Journal of clinical investigation. 121 (5), 1894-1904 (2011).</li><li>Smart, N., Bollini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+cardiomyocytes+from+within+the+activated+adult+heart+after+injury.">De novo cardiomyocytes from within the activated adult heart after injury.</a> Nature. 474 (7353), 640-644 (2011).</li><li>Zangi, L., Lui, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+mRNA+directs+the+fate+of+heart+progenitor+cells+and+induces+vascular+regeneration+after+myocardial+infarction.">Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction.</a> Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).</li><li>Moerkamp, A. T., Lodder, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fetal+and+adult+epicardial-derived+cells:+a+novel+model+to+study+their+activation.">Human fetal and adult epicardial-derived cells: a novel model to study their activation.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 7 (1), 1-12 (2016).</li><li>Clunie-O'Connor, C., Smits, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Derivation+of+Primary+Human+Epicardium-Derived+Cells.">The Derivation of Primary Human Epicardium-Derived Cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 35, 2C.5.1-2C.5.12 (2015).</li><li>Van Tuyn, J., Atsma, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+Cells+of+Human+Adults+Can+Undergo+an+Epithelial-to-+Mesenchymal+Transition+and+Obtain+Characteristics+of+Smooth+Muscle+Cells+In+Vitro.">Epicardial Cells of Human Adults Can Undergo an Epithelial-to- Mesenchymal Transition and Obtain Characteristics of Smooth Muscle Cells In Vitro.</a> Stem Cells. 25 (2), 271-278 (2007).</li><li>Bax, N. A. M., van Oorschot, A. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+epithelial-to-mesenchymal+transformation+in+human+adult+epicardial+cells+is+regulated+by+TGF&#946;-signaling+and+WT1.">In vitro epithelial-to-mesenchymal transformation in human adult epicardial cells is regulated by TGF&#946;-signaling and WT1.</a> Basic research in cardiology. 106 (5), 829-847 (2011).</li><li>Chechi, K., Richard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermogenic+potential+and+physiological+relevance+of+human+epicardial+adipose+tissue.">Thermogenic potential and physiological relevance of human epicardial adipose tissue.</a> International Journal of Obesity Supplements. 5 (Suppl 1), S28-S34 (2015).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

هنا يصف لنا البروتوكول مفصلاً لعزل وثقافة الخلايا epicardial الأولية المستمدة من قلوب الكبار والأجنة البشرية. وقد وصف واسع النطاق لهذه الخلايا المنشورة سابقا17. وقد أظهرنا أنه يمكن الحفاظ على كل أنواع الخلايا كالخلايا الظهارية مثل حصاة كبيرة عند مثقف مع مثبط كيناز ALK5 SB431542. EMT جزء ل?...

ابيكارديوم، طبقة طلائي خلية واحدة أن مغلفات القلب، وذات أهمية حيوية للتنمية القلب وإصلاح (إعادة النظر في سميتس et al. 1)-تنمويا، ابيكارديوم تنشأ من الجهاز بروبيكارديال، هيكل صغير يقع في قاعدة القلب النامية. حول التنموية يوم E9.5 في الماوس، والحمل بعد 4 أسابيع في الإنسان، تبدأ الخلايا ترحيل من هذا الهيكل قرنبيط ويغطي عضلة القلب النامية2. حالما يتم تشكيل طبقة واحدة من خلايا الظهارية، يخضع جزء من الخلايا epicardial الظهارية الانتقالية الوسيطة (EMT). خلال EMT، خلايا تفقد خصائصها الظهارية، مثل الالتصاقات خلية خلية، والحصول النمط الظاهري الوسيطة التي يعطيها القدرة على ترحيل في عضلة القلب النامية. شكلت الخلايا المشتقة ابيكارديال (ابدكس) يمكن أن تفرق في العديد من أنواع خلايا القلب بما في ذلك الخلايا الليفية وخلايا العضلات الملساء، ويحتمل أن تكون كارديوميوسيتيس وخلايا بطانية3، رغم التمايز الأخير اثنين الخلية السكان لا يزال خاضعا للمناقشة (استعرض في سميتس et al. 4). وعلاوة على ذلك، يوفر ابيكارديوم إشارات paracrine مفيدة لعضلة القلب لتنظيم النمو والأوعية الدموية5،6،،من78. وقد أثبتت الدراسات المتعددة أن تشكيل epicardial البصر يؤدي إلى عيوب التنموية في عضلة القلب9،10والمفرج11والتوصيل نظام12، إذ تؤكد الأساسية مساهمة ابيكارديوم إلى تشكيل القلب.
على الرغم من أن في قلب الكبار موجودة ابيكارديوم كطبقة نائمة، فإنه يصبح تنشيط عند الاسكيمية13. ويجمل تنشيط epicardial بعد إصابة العديد من العمليات الموصوفة للتنمية القلب، بما في ذلك انتشار و EMT14، أن كان أقل كفاءة. من المثير للاهتمام، على الرغم من أن الآلية الدقيقة ليست مفهومة تماما، ابيكارديال المساهمة في إصلاح يمكن تحسينه من خلال العلاج مع، مثلاً، β4 ثيموسين15 أو تعديل مرناً VEGF-أ16، أسفر عن القلب يحسن وظيفة بعد احتشاء عضلة القلب. ولذلك يعتبر ابيكارديوم مصدر خلية مثيرة لاهتمام لتعزيز إصلاح الذاتية للقلب المصاب.
وكثيراً ما يرد موجز لها آليات التنمية القلب أثناء الإصابة، على الرغم من أن بطريقة أقل كفاءة. بحثاً عن المنشطات ابيكارديال، فمن بالغ الأهمية أن نتمكن من تحديد ومقارنة القدرات الكاملة ابيكارديوم الجنين والكبار. وعلاوة على ذلك، من المهم من وجهة نظر علاجية، أنه، بالإضافة إلى التجارب على الحيوانات، نتقدم بالمعرفة فيما يتعلق برد ابيكارديوم البشرية. هنا، يمكننا وصف طريقة لعزل وثقافة الكبار والجنين epicardial المشتقة الخلايا البشرية (ابدكس) في مورفولوجيا مثل الخلايا الظهارية وحمل EMT. مع هذا النموذج، ونحن نهدف إلى استكشاف ومقارنة سلوك الخلية epicardial الكبار والجنين.
والميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو استخدام المواد ابيكارديال البشرية، التي لم تدرس جيدا. الأهم من ذلك، ينص البروتوكول ثقافة العزلة وخلية وصف أسلوب موحد واحد لاشتقاق كلا ابدكس cobble الأجنة والبالغين، مما يتيح إجراء مقارنة مباشرة بين هذه المصادر الخلية اثنين. بالإضافة إلى ذلك، منذ ابيكارديوم يتم عزل استناداً إلى موقعها، تكفل أن الخلايا هي فعلا ابيكارديالي المشتقة17.
في حين تم إنشاء أساليب العزلة أبدك البشرية سابقا، هذه تعتمد في الغالب على بروتوكولات ثمرة حيث يتم مطلي قطعة من أنسجة القلب أو ابيكارديال على خلية ثقافة طبق18،19. وبالتالي يحدد هذا النهج على وجه التحديد للخلايا التي تفقد جزئيا على النمط الظاهري الظهارية من أجل ترحيل، والتي أكثر عرضه للخضوع EMT عفوية. في البروتوكول الحالي، تتم معالجتها في ابيكارديوم أولاً إلى حل وحيد خلية الذي يسمح ابدكس معزولة للحفاظ على دولته الظهارية. ولذلك يوفر هذا الأسلوب نموذجا صلبا في المختبر لدراسة epicardial EMT.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31150-022</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0.25%</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G sodium salt</td><td>Roth</td><td>HP48</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin sulphate</td><td>Roth</td><td>HP66</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 1:250 from bovine pancreas</td><td>Serva</td><td>37289</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from porcine skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Culture plates 6 well</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Culture plates 12 well</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Culture plates 24 well</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Merck</td><td>102931</td><td></td></tr><tr><td>100-1000&amp;micro;L Filtered Pipet Tips</td><td>Corning</td><td>4809</td><td></td></tr><tr><td>10-ml pipet</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>5-ml pipet</td><td>Greiner bio-one</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dish 100/20 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010056</td><td>Or home-made and sterilized</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>15-ml centrifuge tubes</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50-ml centrifuge tubes</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>305959</td><td></td></tr><tr><td>Needles 19 Gauge</td><td>Becton Dickinson</td><td>301700</td><td></td></tr><tr><td>Needles 21 Gauge</td><td>Becton Dickinson</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>EASYstrainer Cell Sieves, 100 &amp;micro;m</td><td>Greiner bio-one</td><td>542000</td><td></td></tr><tr><td>TGF&amp;beta;3&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>243-B3</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-Actin, &amp;alpha;-Smooth Muscle</td><td>Sigma</td><td>A2547&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A31570</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Pipet P1,000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Pipet controller</td><td>Integra</td><td>155 015</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Light Microscope</td><td>Olympus</td><td>CK2</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>GFL</td><td>1083</td><td></td></tr></tbody></table>

the isolation and culture of primary epicardial cells derived from human adult and fetal heart specimens

ابيكارديوم، طبقة خلايا الظهارية تغطي عضلة القلب، له دور أساسي أثناء تطوير القلب، وكذلك في الاستجابة إصلاح القلب بعد الإصابة الدماغية. عند تنشيط، خلايا epicardial الخضوع لعملية تعرف باسم الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT) لتوفير خلايا عضلة القلب تجديد. وعلاوة على ذلك، يساهم ابيكارديوم عن طريق إفراز العوامل الأساسية باراكريني. نقدر تماما إمكانات التجدد ابيكارديوم، مطلوب نموذج خلية بشرية. هنا أننا مخطط نموذج ثقافة رواية خلية استخلاص الخلايا الأولية المشتقة ابيكارديال (ابدكس) من أنسجة القلب الكبار والأجنة البشرية. لعزل ابدكس، ابيكارديوم تشريح من خارج العينة القلب ومعالجتها في تعليق خلية مفردة. المقبل، مطلي ابدكس ومثقف في أبدك المتوسطة التي تحتوي على مثبطات 5-كيناز كيه SB431542 للحفاظ على النمط الظاهري الظهارية بهم. EMT هو فعل التحفيز مع TGFβ. هذا الأسلوب يتيح، للمرة الأولى، دراسة عملية EMT epicardial البشرية في إعداد التي تسيطر عليها، وتيسر الحصول على مزيد من التبصر في سيكريتومي ابدكس التي يمكن أن تساعد في إنعاش القلب. وعلاوة على ذلك، يتيح هذا النهج الموحد للمقارنة المباشرة للسلوك ابيكارديال الكبار والجنين البشري.

هنا، فإننا مخطط بروتوكولا مباشرة عزل ابدكس من الكبار والجنين القلب الأنسجة البشرية (الشكل 1). هذا البروتوكول يستفيد من موقع يمكن الوصول بسهولة ابيكارديوم في خارج القلب (الشكل 1A). تلوين لصوان القلب بعد تشريح يوضح أنه يتم إزالة ابيكارديوم WT1 +...

Watch this Scientific Journal Video about The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens at JoVE.com

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

ابيكارديوم يلعب دوراً حاسما في التنمية وإصلاح القلب بتوفير عوامل النمو على الجدار احتشاء عضلة القلب وخلايا. هنا، يمكننا وصف أسلوب للثقافة البشرية خلايا epicardial الأساسية التي تمكن من دراسة ومقارنة الخصائص الإنمائية والكبار ل.

بالعزلة وثقافة الخلايا Epicardial الأولية المستمدة من عينات من قلب الكبار والأجنة البشرية

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

the-isolation-culture-primary-epicardial-cells-derived-from-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.7K Views.  Leiden University Medical Center. ابيكارديوم يلعب دوراً حاسما في التنمية وإصلاح القلب بتوفير عوامل النمو على الجدار احتشاء عضلة القلب وخلايا. هنا، يمكننا وصف أسلوب للثقافة البشرية خلايا epicardial الأساسية التي تمكن من دراسة ومقارنة الخصائص الإنمائية والكبار ل.

Video: The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing cardiovascular progenitors during development and disease. While a number of factors have been implicated in epicardium-derived cell (EPDC) mobilization, the mechanisms governing their subsequent migration and differentiation are poorly understood. Here, we present in vitro and ex vivo strategies to study EPDC motility and differentiation. First, we describe a method of obtaining primary epicardial cells by outgrowth culture from the embryonic mouse heart. We also introduce a detailed protocol to assess three-dimensional migration of labeled EPDC in an organ culture system. We provide evidence using these techniques that genetic deletion of myocardin-related transcription factors in the epicardium attenuates EPDC migration. This approach serves as a platform to evaluate candidate modifiers of EPDC biology and could be used to develop genetic or chemical screens to identify novel regulators of EPDC mobilization that might be useful for cardiac repair.

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

النخابية ثمرة ثقافة الفحص و<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; تقييم هجرة الخلايا المشتقة النخابية-

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34- pericytes and vascular CD34+CD146- adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Human cardiac tissue harbours multipotent perivascular precursor cell populations that may be suitable for myocardial regeneration. The technique described here allows for the simultaneous isolation and purification of two multipotent stromal cell populations associated with native blood vessels, i.e. CD146+CD34- pericytes and CD34+CD146- adventitial cells, from the human myocardium.

عزل بالسكان خلية حول الأوعية متعددة القدرات السلائف من قلب الإنسان الأنسجة

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-&#946;1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.

في المختبر ثقافة خلايا النخابية من الفأر الجنينية القلب

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium ...

Engineering

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

عزل وتوصيف وظيفي من الإنسان البطيني العضلية من العينات الجراحية الطازجة

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Medicine

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. Consequently, these two cell populations play unique roles in cardiac diseases. Current studies involving isolated endothelial cells investigate cell populations consisting of both EECs and CECs. This protocol outlines a method to independently isolate these two cell populations for cell-specific characterization. Following the collection of the left and right ventricular free wall, endothelial cells from the outer surface and inner surface are separately liberated using a digestion buffer solution. The sequential digestion of the outer surface and the inner endocardial layer retained separation of the two endothelial cell populations. The separate isolation of EECs and CECs is further verified through the identification of markers specific to each population. Based on previously published single cell RNA profiling in the mouse heart, the Npr3, Hapln1, and Cdh11 gene expression is unique to EECs; while Fabp4, Mgll, and Cd36 gene expression is unique to CECs. qPCR data revealed enriched expression of these characteristic markers in their respective samples, indicating successful EEC and CEC isolation, as well as maintenance of cell phenotype, enabling further cell-specific functional analysis.

We present a protocol for the isolation of endocardial and coronary endothelial cells from rat hearts through sequential tissue digestion in a digestion buffer, cell collection from recurrent centrifuge cycles, and cell purification using anti-rat CD31 microbeads.

عزل الخلايا الإندوكاريال والشريان التاجي من الجدار الحر البطيني للقلب الجرذ

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial arrhythmia triggers in mice. To investigate the electrical and biological properties of cardiac melanocytes we developed a procedure to isolate them from mouse hearts that we derived from those designed to isolate neonatal murine cardiomyocytes. In order to obtain healthier cardiac melanocytes suitable for more extensive patch clamp or biochemical studies, we developed a refined procedure for isolating and plating cardiac melanocytes based on those originally designed to isolate cutaneous melanocytes. The refined procedure is demonstrated in this review and produces larger numbers of healthy melanocyte-like cells that can be plated as a pure population or with cardiomyocytes.

In this protocol, we identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial arrhythmia triggers in mice.&#160;

عزل الخلايا الصباغية تشبه الأولية من القلب ماوس

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial ...

Biology

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

عزلة الجنينية البطيني الخلايا البطانية

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Cardiomyocytes from Fixed Hearts for Immunocytochemistry and Ploidy Analysis

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably identify nuclei of cardiomyocytes on histological sections, many groups rely on isolating viable cardiomyocytes prior to fixation to perform immunostaining. However, these live cardiomyocyte isolation techniques require optimization to maximize the yield, viability and quality of the samples, with inherent fluctuations from sample to sample despite maximum optimization. Here, we report a reproducible protocol, involving fixation prior to enzymatic digestion of the heart, which leads to maximum yield while preserving the in vivo morphology of individual cardiomyocytes. We further developed an automated analysis platform to determine the number of nuclei and DNA content per nucleus for individual cardiomyocytes. After exposing the chest cavity, the heart was arrested in diastole by perfusion with 60 mM KCl in PBS. Next, the heart was fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) solution, and then digested with 60 mg/mL collagenase solution. After digestions, cells were singularized by trituration, and the cardiomyocyte fraction was enriched via differential centrifugation. Isolated cardiomyocytes were stained for Troponin T and &#945;-actinin to assess purity of the obtained population. Furthermore, we developed an image analysis platform to determine cardiomyocyte nucleation and ploidy status following DAPI staining. Image based ploidy assessments led to consistent and reproducible results. Thus, with this protocol, it is possible to preserve native morphology of individual cardiomyocytes to allow immunocytochemistry and DNA content analysis while achieving maximum yield.

The goal of this work is to develop a method to reproducibly isolate cardiomyocytes from the adult heart and measure DNA content and nucleation.

عزل القلب من القلب الثابتة للكيمياء المناعية وتحليل بلودي

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly isolated by coronary perfusion with digestive enzymes. However, isolating human cardiomyocytes is challenging because human myocardial specimens usually do not allow for coronary perfusion, and alternative isolation protocols result in poor yields of viable cells. In addition, human myocardial specimens are rare and only regularly available at institutions with on-site cardiac surgery. This hampers the translation of findings from animal to human cardiomyocytes. Described here is a reliable protocol that enables efficient isolation of ventricular myocytes from human and animal myocardium. To increase the surface-to-volume ratio while minimizing cell damage, myocardial tissue slices 300 &#181;m thick are generated from myocardial specimens with a vibratome. Tissue slices are then digested with protease and collagenase. Rat myocardium was used to establish the protocol and quantify yields of viable, calcium-tolerant myocytes by flow-cytometric cell counting. Comparison with the commonly used tissue-chunk method showed significantly higher yields of rod-shaped cardiomyocytes (41.5 &#177; 11.9 vs. 7.89 &#177; 3.6%, p &#60; 0.05). The protocol was translated to failing and non-failing human myocardium, where yields were similar as in rat myocardium and, again, markedly higher than with the tissue-chunk method (45.0 &#177; 15.0 vs. 6.87 &#177; 5.23 cells/mg, p &#60; 0.05). Notably, with the protocol presented it is possible to isolate reasonable numbers of viable human cardiomyocytes (9&#8211;200 cells/mg) from minimal amounts of tissue (&#60;50 mg). Thus, the method is applicable to healthy and failing myocardium from both human and animal hearts. Furthermore, it is possible to isolate excitable and contractile myocytes from human tissue specimens stored for up to 36 h in cold cardioplegic solution, rendering the method particularly useful for laboratories at institutions without on-site cardiac surgery.

Presented is a protocol for the isolation of human and animal ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices. High yields of calcium-tolerant cells (up to 200 cells/mg) can be obtained from small amounts of tissue (&#60;50 mg). The protocol is applicable to myocardium exposed to cold ischemia for up to 36 h.

عزل القلب البطيني البشري من شرائح عضلة القلب المقطّع بالهزاز

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

العزلة المتزامنة وثقافة Myocytes الأذينية، myocytes البطينية، وغير Myocytes من قلب فأرة البالغين

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...