نحن ممتنون للبروفيسور الفخري جان كلود Perriard وإيفلين Perriard (المعهد الاتحادي السويسري للتكنولوجيا، سويسرا) لإدخال تقنيات في عزلة عن الفئران حديثي الولادة والعضلية الماوس. نود أن نشكر الأستاذ جو تشن والبروفيسور سيلفيا إيفانز (جامعة كاليفورنيا سان دييغو، الولايات المتحدة الأمريكية) لدعمهم. وقد تم تمويل العمل في المختبر من قبل لجنة نهر الميكونج EE الوظيفي مؤسسة غرانت. ويدعم SL قبل K99/R00 الطريق إلى جائزة الاستقلال من المعاهد الوطنية للصحة / NHLBI (HL107744). وأيد TMM بواسطة زمالة ما بعد الدكتوراه من جمعية القلب الأمريكية (11POST7310066).

يصف الإجراء التالي ل16،17 بروتوكول لمدة يومين للعزلة وثقافة العضلية الماوس حديثي الولادة. كل الحلول هي معقمة أو معقمة تصفيتها. يتم تعقيم جميع الأدوات التي كتبها تعقيم السطح مع 75٪ من الإيثانول. باستثناء لاستخراج الأنسجة الأولية، يتم تنفيذ جميع الخطوات في العقيمة خلية تدفق الصفحي هود الثقافة. ويهدف هذا البروتوكول لعزل قلوب الماوس حديثي الولادة 1-2 القمامة (ق) - ما يقرب من 5-14 الجراء، ولكن يمكن تكييفها لأحجام أكبر القمامة والفئران حديثي الولادة العضلية. استخدام الوسائط على نطاق و/ انزيم حسب الاقتضاء. للعمل مع القوارض الولدان، والرجوع إلى المبادئ التوجيهية الجامعة المحلية والقواعد المنصوص عليها من قبل الهيئة التشريعية و / أو برامج رعاية الحيوان، والتمسك بروتوكول حيوانك افق مؤسسيا. وقد وافق كل الأساليب المذكورة في هذا البروتوكول من قبل لجنة جامعة كاليفورنيا في سان دييغو المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC)، والتمسك المدرسيهاللوائح راؤول والدولة. اليوم 1. 1. عزل أنسجة القلب من الفئران حديثي الولادة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 50 مل من برنامج تلفزيوني 1X (دون كا 2 +، والمغنيسيوم 2 +) تستكمل مع 20 ملي BDM 6-8، وتفريق في اثنين من الأطباق البكتيرية العقيمة وضعت على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير 10 مل من العزلة المتوسطة في 50 مل العقيمة المخروطية أنبوب فالكون. إبقاء جميع الحلول على الجليد. تعقيم مقص (واحد المنحني، مستقيم واحد)، وملقط (المنحني، دومون NO.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم شطف الفئران حديثي الولادة 1-3 أيام القديمة بسرعة في 75٪ من محلول الإيثانول في التعقيم السطح. ومقطوعة الرأس الجراء باستخدام مقص العقيمة (على التوالي)، ويتم فتح الصدر على طول عظمة القص للسماح بالوصول إلى تجويف الصدر والقلب (الشكل 1A، فيلم التكميلي S1). تعليق فني: الفئران حديثي الولادة مضى عليها أكثر من 3 أيام يمكن استخدامها، ولكن ينتج في الخلايا أقل قابلة للحياة 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم استخراج قلوب منالجسم مع مقص منحني ونقل على الفور في طبق البكتيرية التي تحتوي على برنامج تلفزيوني 1X (دون كا 2 +، والمغنيسيوم 2 +) مع 20 ملي BDM، على الجليد. يتم تنفيذ كافة الخطوات التالية في العقيمة خلية غطاء الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أنسجة الرئة، سفن أكبر حجما (والأذينين، إذا رغبت في ذلك). قلوب يغسل في برنامج تلفزيوني 1X الحل (دون كا 2 +، والمغنيسيوم 2 +) مع 20 ملي BDM (على الجليد) لإزالة الدم. نقل غسلها القلوب من أول طبق في طبق البكتيرية الثانية تحتوي على برنامج تلفزيوني 1X (دون كا 2 +، والمغنيسيوم 2 +) مع 20 ملي BDM (على الجليد) باستخدام ملقط أو ملعقة مثقوبة (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تنظيفها / تغسل قلوب إلى قطرة من العزلة المتوسطة (حوالي 250 ميكرولتر؛ الشكل 1C) في طبق البكتيرية الثالث (على الجليد) واستخدام مقص منحني لتخطر على القلوب الى قطع صغيرة (حوالي 0.5-1 مم 3، أو أصغر؛ الرقم 1D، 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل القلوب المفروم إلى المخروطيةأنبوب تحتوي على 10 مل من المتوسط ​​العزلة (على الجليد)، واحتضان مع الإثارة لطيف في 4 درجات مئوية خلال الليل. </li></ol> اليوم 2. 2. الأنسجة الأنزيمية الهضم وتصفيح خلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وزن 15 ملغ من خليط كولاجيناز / dispase (روش)، وحل مزيج الانزيم في 10 مل L15 المتوسطة 5 تستكمل مع 20 ملي BDM (متوسطة الهضم). تصفية العقيمة المتوسطة الهضم في هود زراعة الخلايا في العقيمة 50 مل أنبوب فالكون الجديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير 30 مل L-15 متوسطة تستكمل مع 20 ملي BDM، وتصفيح المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات معطف خلية الثقافة مع الحل الكولاجين (سيغما C-8919) مدة لا تقل عن 1 ساعة. إزالة حل الكولاجين (يمكن إعادة استخدامها) والكولاجين المغلفة أطباق خلية ثقافة جافة معقمة في تدفق الصفحي خلية غطاء الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أنبوب مخروطي يحتوي على قلوب مهضوم من 4 درجات مئوية. وينبغي تجميع شظايا الأنسجة (الشكل 1G). السماح للشظايا الأنسجة تغرق لالجزء السفلي من الأنبوب وإزالة طاف (تأكد من عدم تفقد أي شظايا الأنسجة؛ عادة، قد تبقى تقريبا 1 مل من المتوسط ​​العزلة في الأنبوب). إضافة 5 مل من الهضم المتوسطة و 5 مل من L-15 تستكمل مع 20 ملي BDM إلى شظايا الأنسجة وتعليق الأوكسجين باستخدام الأكسجين أو الهواء لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل أنبوب مخروطي مختومة تحتوي على شظايا أنسجة القلب في الهضم المتوسط ​​إلى 37 درجة مئوية حمام الماء لمدة 2 دقيقة لضبط درجة الحرارة من الحل الهضم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان شظايا أنسجة القلب عند 37 درجة مئوية مع الإثارة لطيف لمدة 20-30 دقيقة (على سبيل المثال شاكر عند 37 درجة مئوية، لتعيين ما لا يزيد عن 60rpm). قد تعتمد إلى حد كبير على الهضم مرات خليط انزيم والكثير عدد تحذير: فترات حضانة أطول أو تركيزات أعلى الانزيم قد يقلل من بقاء الخلية. </li></ol> تعليق فني: نوصي استخدام خليط كولاجيناز / dispase من روش (رقم الكاتالوج: 10269638001) الذي يحتوي على القليل جدا تقلب الكثير إلى الكثير. الانزيم الكلاسيكية لعزل العضلية الماوس التربسين و / أو نوع كولاجيناز الثاني 3،16-20 المتاحة من رثينجتون (القط لا CLS-2). ومع ذلك، أداء كولاجيناز الثاني قد تختلف جوهريا عن الكثير إلى الكثير. ورثينجتون يسمح عادة لاختبار الكثير عدة مرات كولاجيناز لتحسين الهضم وانزيم الاستخدام. بدلا من ذلك، ورثينجتون تبيع العزلة عدة cardiomyocyte مع خليط الانزيم اختبار مسبق شملت التي يمكن تكييفها لعزل العضلية الماوس 17 (القط رقم: NCIS). <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العقيمة خلية مصفاة (40-100 ميكرون شبكة النايلون) في جديدة معقمة 50 مل المخروطية أنبوب الصقر. مصفاة الخلية قبل الرطب مع 5 مل L-15 تستكمل مع 20 ملي BDM. شظايا الأنسجة يسحن بلطف باستخدام المبللة قبل 10 مل خلية ثقافة ماصة لحوالي 10-20 مرة. يجب شظايا الأنسجة تفريق معظمها خلال هذه الخطوة، والإفراج عن الخلايا في suspensioن (الشكل 1H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح شظايا الأنسجة أكبر الرواسب ونقل طاف تحتوي الخلايا علقت في أنبوب مخروطي جديدة من خلال خلية مصفاة (الشكل 1I). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق شظايا الأنسجة غير مهضوم في 5 مل الهضم المتوسطة واحتضان ل5-10 دقيقة إضافية عند 37 درجة مئوية مع الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الهضم المستمر لتبقى شظايا الأنسجة، يسحن بلطف الأنسجة لمدة 10-20 مرات، وإضافة إلى أنبوب مخروطي يحتوي على خلايا من أول هضم من خلال مصفاة الخلية. شطف الخلايا مصفاة مع 5 مل L-15 تستكمل مع 20 ملي BDM للسماح بمرور جميع خلايا هضمها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنبوب مخروطي يحتوي نباذة العضلية وقف التنفيذ لمدة 5 دقائق في 300 دورة في الدقيقة (حوالي 50-100 x ج). إزالة طاف (يحتوي معظمها الخلايا الليفية والخلايا البطانية) وإعادة تعليق بيليه خلية في 10 مل تصفيح المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا في خلية 10 سم صحن الثقافة (الشكل 2A)، واحتضان لمدة 1-3 ساعة في الثقافة الخلية الحاضنة. هذه الخطوة ما قبل الطلاء يزيل الخلايا الليفية والخلايا البطانية (الشكل 2B)، والذي ستلتزم طبق خلية ثقافة غير المصقول (الشكل 2C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة، وغسل العضلية غير ملتصقة من 10 سم الطبق الثقافة (اعادة تعليق الخلايا بواسطة pipetting مرارا المتوسطة الطلاء على طبق)، ونقل خلايا معلق إلى العقيمة المخروطية أنبوب فالكون الطرد المركزي (15 مل أو 50 مل). اختياري: كرر الخطوة قبل الطلاء لإزالة الخلايا الليفية إضافية من خلايا تعليق. إذا رغبت في ذلك، يمكن أن الخلايا الليفية والبطانية تمسكا يكون أبعد مثقف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا (على سبيل المثال باستخدام عدادة الكريات نويباور، التريبان الأزرق الاستبعاد تلطيخ 21). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا في الكولاجين المغلفة أطباق زراعة الخلايا مع كثافة حوالي 1.5 × 10 5 خلايا لكل سم 2 (الشكل 2D، وانظر أيضا التعليقات الواردة في الجدول 1 على الطلاءوالطلاء). وضع الأطباق في الثقافة الخلية الحاضنة وتترك لمدة 12-18 ساعة دون عائق للسماح لالتزام ونشر العضلية. </li></ol> اليوم 3 - ثقافة العضلية حديثي الولادة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المتوسطة الصيانة وprewarm في 37 ° C حمام الماء. الرجوع إلى الجدول رقم 1 لإضافة مثبطات انتشار أو وكلاء ميقاتية، أو إجراء ترنسفكأيشن الليبوسومال من العضلية الماوس حديثي الولادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد يوم واحد والطلاء، ويجب العضلية انضمت إلى الطبق الثقافة الخلية وتبدأ على النحو الأمثل تلقائيا إلى التعاقد (الشكل 2E، 2F؛ التكميلي فيلم S2؛ الرجوع إلى الجدول رقم 2 للمشاكل المشتركة أثناء إجراء العزل / الثقافة). استبدال الطلاء المتوسطة مع المتوسطة والصيانة، والثقافة لمدة 1-5 أيام إضافية. تغيير المتوسطة حسب الضرورة. </li></ol>

لا شيء.

أصبح استخدام نماذج حيوانية لدراسة أمراض القلب القياسية في مجال البحوث القلب والأوعية الدموية. توصيف البيوكيميائية أقرب من هذه النماذج (أي دراسة الاستجابات المباشرة للخلايا القلب للمؤثرات الكيميائية الحيوية أو النشاط الحيوي) وعادة ما يتطلب عزل أنسجة القلب أو العضلية. دراسات التحقيق الاستجابات الفسيولوجية للقلب خارج الجسم (على سبيل المثال إلى 40 أستيل، أو في سيناريوهات نقص التروية، ضخه 41) الاستفادة عموما-perfused langendorff القلوب كلها 42،43، بينما الثقافات ازدراع 44،45 من شظايا الأنسجة القلبية تسمح للتحقيقات العضلية في بيئة الأنسجة ثلاثي الأبعاد. ومع ذلك، زراعة الأنسجة ازدراع قد تعيق انتشار المواد الغذائية، مما قد يولد مجموعة نخرية داخل نواة من الأنسجة. علاوة على ذلك، غير قادرة على الحركة العضلية داخل الأنسجة، وبالتالي هجرة الخلايا من إإكسبلنتس هو obse فقطrved لغير العضلية، مثل الخلايا الليفية أو الخلايا الاصلية القلب المفترضة 44. التحقيق في وسلوك الخلايا البيولوجية، والكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية التنموية العضلية المطلوبة وبالتالي إنشاء العزلة والإجراءات زراعة. بروتوكولات المبكر للعزلة وثقافة العضلية الثدييات استخدام الفئران حديثي الولادة 1،2. ومع ذلك، فإن صعود الماوس كنظام نموذج للدراسات الجينية (أي المعدلة وراثيا أو الضربة القاضية في الفئران خروج المغلوب) استلزم التكيف من العزلة الراسخة ومنهجيات زراعة. للأسف، وعزل العضلية الماوس حديثي الولادة هو تحديا من نوع خاص مقارنة مع تلك الفئران من العضلية حديثي الولادة تستخدم أكثر تقليديا. يصف بروتوكول المعروضة طريقة موثوقة وقوية الأمثل للعزلة وثقافة العضلية الماوس حديثي الولادة. نحن تصف الخطوات اللازمة لاستخراج الأنسجة الأولية، لتفارق والثانية تنقية الخلايا الليفية العضلية من القلب والخلايا البطانية، والطلاء والثقافة الشروط. في حين أن البروتوكول يوفر النهج الأساسي إلى العزلة وثقافة العضلية الماوس حديثي الولادة في الظروف القياسية، ويمكن تكييفها بسهولة للعزلة وثقافة العضلية الفئران حديثي الولادة، وكذلك لأنواع محددة مقايسة لاحقة: مثل ثقافة الخلايا المعزولة على الأغشية المرنة (مثل لوحات Bioflex الثقافة) للتحقيق في خصائص النشاط الحيوي والثقافة في أطباق زجاجية القاع (ماتيك) لتصوير الخلايا الحية، أو ثقافة العضلية في xCELLigence لوحات ه القلب (ACEA، روش، Cat.-No.: 06417051001) لدراسة آثار المخدرات على وظائف مقلص. وعلاوة على ذلك، ونحن نقدم خيارات لتعظيم الاستفادة من العزلة والإجراءات والثقافة، ومناقشة مصادر المشاكل المحتملة وإيجاد الحلول لها. وبالتالي، يجب أن هذا البروتوكول مساعدة الباحثين على دراسة ما يصل إلى التاريخ، وتكرار للغايةطريقة معقولة لإعداد الأطفال حديثي الولادة الثقافات الماوس cardiomyocyte.

أقرب تقارير عن التفكك ناجحة وثقافة خلايا القلب القوارض يعود تاريخها الى عام 1،2 في عام 1960. حتى ذلك الحين، لاحظت Harary وفارلي أن العضلية مثقف &quot;قد توفر نظاما فريدا لدراسة متطلبات انقباض الدوري [ويجوز] توفير وسيلة لتحديد مساهمة مختلف المسارات الأيضية لل[الضرب] العملية&quot;. على الرغم من Harary وفارلي العضلية معزولة ومثقف من صغار الفئران، والبروتوكول الأصلي قد تم تكييفها وتعديلها من قبل العديد من العلماء على مر السنين، لم يتغير كثيرا من العزلة وزراعة الإجراء العام. ومع ذلك، والانزيمات أفضل 3 حلول موحدة 4،5، وإضافة قناة عكسها والميوسين أتباز المانع BDM لحماية الخلايا أثناء إجراء العزل 6-9 قد تحسنت بشكل ملحوظ الخلوي العائد والجدوى. الكبار مقابل cardiomyo حديثي الولادةcytes العضلية معزولة ومثقف من الفئران او الجرذان حديثي الولادة لديها العديد من المزايا ثقافات العضلية الكبار. قبل كل شيء، وإجراء العزل لحديثي الولادة الماوس أو الفئران القلوب هو أسهل وأقل تكلفة، إذا ما قورنت إلى عزل العضلية من الماوس الكبار أو الفئران 10. حديثي الولادة العضلية هي أقل حساسية بكثير لإعادة إلى المتوسطة التي تحتوي على الكالسيوم بعد التفكك، وزيادة كبيرة الخلوي العائد. ميزة كبيرة أخرى هي أن العضلية الماوس حديثي الولادة الخضوع لفقد التمايز أسرع - دورة عودة التمايز الذي ينتج عادة في ضرب الخلايا عفويا 20 ساعة بعد الطلاء، في حين تتطلب العضلية الكبار عادة للحث على سرعة الانكماش. العضلية حديثي الولادة هي أيضا أكثر بسهولة transfectable مع أساليب الليبوسومال ترنسفكأيشن، في حين العضلية الكبار تتطلب النواقل الفيروسية للتسليم ناجحة من الحمض النووي المعدل وراثيا. وعلى النقيض من cardiomyocyte حديثي الولادةق، ثقافة العضلية القوارض الكبار 11-13 يسمح للتحقيقات من تدهور myofibrillar وإعادة في نهاية المطاف من جهاز مقلص. هذه التغييرات شكلية متميزة في العضلية الكبار تحدث على مدى فترات من 1-2 أسابيع. ويرافق عودة التمايز من خلال دورة reexpression من البرنامج الجيني الجنين، وبالتالي محاكاة التغيرات المرضية التي لوحظت في الإنسان بعضلة القلب 14 - وفقد التمايز. ميزة أخرى من الفئران العضلية الكبار على ثقافة العضلية حديثي الولادة هو القدرة على ثقافة هذه الخلايا لفترات طويلة من الزمن. الفئران مقابل العضلية الماوس العزلة وثقافة العضلية الفئران حديثي الولادة لديها بعض الفوائد من خلال تلك الماوس العضلية حديثي الولادة، بما في ذلك عائدات أعلى من خلايا قابلة للحياة وزيادة معدلات ترنسفكأيشن. ومع ذلك، فإن استخدام واسعة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا لعلاج أمراض القلب (على سبيل المثال &lt;م /&gt; وليم العضلات بروتين بالضربة القاضية الماوس كنموذج للتمدد عضلة القلب 15) قد أدى إلى التكيف من إجراء العزل لالعضلية المستمدة من الفئران حديثي الولادة. على الرغم من أن البروتوكولات المستخدمة لعزل الجرذان والفئران حديثي الولادة العضلية هي متطابقة تقريبا، يجب توخي الحذر أكبر في اختيار مزيج انزيم المناسبة لهذا الأخير. في الواقع، العضلية الماوس حديثي الولادة عادة ما تكون أكثر عرضة للoverdigestion، مما أدى إلى انخفاض العائد الخلية وقدرتها على البقاء. علاوة على ذلك، ينبغي تعديل كثافة الطلاء، لأن العضلية المستمدة من الفئران حديثي الولادة هي أصغر نوعا ما مقارنة مع الخلايا المشتقة من قلوب الفئران حديثي الولادة. مع العديد من الاستخدامات للتحقيق في، الكهربية، والكيمياء الحيوية، المعلمات الخلية البيولوجية والمورفولوجية النشاط الحيوي وكذلك لعملية myofibrillogenesis، أصبحت العضلية الولدان مثقف واحد من أكثر الأنظمة تنوعا لدراسةوظائف الخلية القلبية في المختبر. الخطوة الأولى لمقايسة ناجحة ومع ذلك، يعتمد على منهجية سهلة وموثوقة لعزل العضلية الماوس حديثي الولادة. بروتوكول لدينا توجه منهجيته من مصادر عديدة، وكان الأمثل لاستنساخ ومتانة. نناقش العوامل التي تؤثر cardiomyocyte الغلة وقدرتها على البقاء، وتوفير مجموعة متنوعة من الخيارات لتحقيق أقصى استفادة ممكنة من العزلة والثقافة الشروط.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-0753</td>
			<td>prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 &deg;C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td>can be substituted with collagenase type II from Worthington</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II3</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>CLS-2</td>
			<td>substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x trypsin solution (0.25%) with EDTA</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>e,g, cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (Hank's balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-199</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-060-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>cell-culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horse serum</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>35-030-CV</td>
			<td>cell-culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz L-155</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-045-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-6645</td>
			<td>proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylephrine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-6126</td>
			<td>chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C or -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoproterenol hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-6501</td>
			<td>chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C or -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% collagen solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8919</td>
			<td>extracellular matrix for coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mg/ml collagen type 1 solution</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005-B</td>
			<td>alternative to Sigma collagen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>22363548</td>
			<td>appropriate filter size:40 &mu;m-100 &mu;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter 0.2 &mu;m</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>09-719C</td>
			<td>for sterile filtration of digestion medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight scissors</td>
			<td>e.g. Fine Sciences Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved scissors</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>91461-11</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 7 forceps</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perforated spoon</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>10370-19</td>
			<td>optional, for transfer of heart tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>e.g. Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>live cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemocytometer</td>
			<td>e.g. Prosource Scientific</td>
			<td>3500</td>
			<td>alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tubes</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>14-432-23</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Falcon tubes</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>05-527-90</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringe</td>
			<td>e.g. BD Medical</td>
			<td>14-820-19</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml serological pipette</td>
			<td>e.g. Falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm cell culture dish</td>
			<td>e.g. Nunc</td>
			<td>153066</td>
			<td>for standard culture of cardiomyocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm cell culture dish, glass bottom</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>for live cell imaging with inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dish</td>
			<td>e.g. Nunc</td>
			<td>172958</td>
			<td>for preplating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escort III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3037</td>
			<td>for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>52887</td>
			<td>substitute for Escort III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffers and media: 
			<ul>
				<li>Isolation medium (filter sterilize) 
				20 mM BDM 
				0.0125% trypsin 
				in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+)</li>
				<li>Digestion medium (filter sterilize) 
				20 mM BDM 
				1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix 
				in L15 medium</li>
				<li>Plating medium 
				65% DMEM high glucose 
				19% M-199 
				10% horse serum 
				5% fetal calf serum 
				1% penicillin/streptomycin</li>
				<li>Maintenance medium 
				78% DMEM high glucose 
				17% M-199 
				4% horse serum 
				1% penicillin/streptomycin 
				optional: 
				1 &mu;M AraC 
				1 &mu;M isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine</li>
			</ul>
			The plating and maintenance medium can be stored at 4 &deg;C for up to 6 months.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes

لطالما استخدمت العضلية الولدان مثقف لدراسة myofibrillogenesis وظائف myofibrillar. العضلية مثقف تسمح للتحقيق سهلة والتلاعب من المسارات البيوكيميائية، وتأثيرها على خصائص النشاط الحيوي للضرب عفويا العضلية. يصف بروتوكول 2 يوما بعد العزلة وثقافة العضلية الماوس حديثي الولادة. وتبين لنا كيفية تشريح بسهولة قلوب من حديثي الولادة، فصل الأنسجة العضلية القلبية وإثراء من القلب خلية السكان. نناقش استخدام انزيم يمزج مختلفة لخلية التفكك، وآثارها على الخلية قدرتها على البقاء. والعضلية معزولة يمكن استخدامها في وقت لاحق لمجموعة متنوعة من المورفولوجية، الكهربية، والكيمياء الحيوية، المقايسات خلية بيولوجية أو النشاط الحيوي. نحن الأمثل لبروتوكول لمتانة والتكاثر، باستخدام الحلول الوحيدة المتاحة تجاريا والتي تختلط انزيم SHآه القليل الكثير إلى الكثير تقلب. نحن أيضا معالجة المشاكل المشتركة المرتبطة العزلة وثقافة العضلية، وتوفر مجموعة متنوعة من الخيارات لتحقيق أقصى استفادة ممكنة من العزلة والثقافة الشروط.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

الأولية الثقافات الماوس cardiomyocyte هي واحدة من الأدوات المحورية للتحقيق في منظمة myofibrillar وظيفة. يصف بروتوكول التالية العزلة وثقافة العضلية الأولية من قلوب الماوس حديثي الولادة. ويمكن استخدام الثقافات cardiomyocyte الناتجة لاحقا لمجموعة متنوعة من النشاط الحيوي، فحوصات البيوكيميائية وخلايا البيولوجية.

العزلة وثقافة الأطفال حديثي الولادة ماوس العضلية

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

isolation-and-culture-of-neonatal-mouse-cardiomyocytes

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

62.2K Views.  King’s College London.  الأولية الثقافات الماوس cardiomyocyte هي واحدة من الأدوات المحورية للتحقيق في منظمة myofibrillar وظيفة. يصف بروتوكول التالية العزلة وثقافة العضلية الأولية من قلوب الماوس حديثي الولادة. ويمكن استخدام الثقافات cardiomyocyte الناتجة لاحقا لمجموعة متنوعة من ا...

Video: Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

العزلة وتسجيلات قناة كيلو فولت في الفئران Cardiomyocytes الأذيني البطيني و

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

العزلة والثقافة، وتوصيف وظيفي من الكبار ماوس Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

العزلة والثقافة من الماوس الأساسي خلايا البنكرياس عنيبية

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

العزلة والفسيولوجية تحليل ماوس العضلية

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

العزلة وثقافة الكبار ماوس العضلية للاشارة الخليوي و<em&gt; في المختبر</em&gt; تضخم القلب

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

عزل الأطفال حديثي الولادة خارج الكبد Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

العزلة والثقافة وتنبيغ الخلايا العضلية ماوس الكبار

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

عزل وثقافة الكرياتينية الماوس الرئيسية من حديثي الولادة والفأر الكبار الجلد

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

عزل الخلايا الكيراتينية البشرة الماوس وثقافتهم في المختبر Clonogenic

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...