This work was funded by the National Science Foundation (CBET 0845754, AHH).

1. Vorbereitung für die Bildung von Alginate Discs <ol><li> Vorbereiten eines 4% (w / v) Alginatlösung in 1x Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline ohne Zusatz von Calciumchlorid oder Magnesiumchlorid und in einem 37 ° C Wasserbad. Konzentrationen der Alginatlösung kann variieren, aber von 1 bis 4% (w / v) Alginatlösungen werden empfohlen. </li><li> Mischen Sie die Alginat - Lösung in einem Verhältnis von 1: 1 mit warmem Zellkulturmedien Base (beispielsweise Dulbeccos modifiziertes Eagle - Medium.) Für den gewünschten Zelltyp. Die Alginat - Konzentration ist jetzt die Hälfte der ursprünglichen Konzentration, dh., 2% (w / v). Sterilisieren Alginat / Media-Lösung steril 0,2 um Nylonspritzenfilter verwenden. </li><li> Bereiten Sie ein Bad aus sterilen 102 mM Calciumchloriddihydrat in sterilem Wasser mit genug Lösung Formen zu versenken (~ 200 bis 300 ml). </li><li> Sammeln Sie die sterile &quot;Gelbildung Form&quot; (6 mm Durchmesser x 3 mm groß zylindrischen Vertiefungen in einer 3 in x 3 in Aluminiumplatte, siehe <strong&gt; Abbildung 1) und Endplatten (Unten: ein 3 in x 3 in Aluminium - Platte, oben: eine 1,5 in x 3 in Aluminiumplatte) und Formen herzustellen , wie folgt: <ol><li> Schneiden dick Filterpapier (blotter Filterpapier) und die Zelle Mikrosieb Membran (10 &amp; mgr; m Porengröße) zu den Größen der oberen und unteren Endplatten und legen Sie sie in das Bad Calciumchlorid bis zur Sättigung, ca. 1 min. Falls gewünscht, sterilisiert die dicke Filterpapier und die Membran über Mikrosieb Autoklaven oder ultraviolettem Licht für 30 min vor der Verwendung. </li><li> Set-up die Hälfte (die untere Hälfte) des Form Konstrukt. <ol><li> Legen Sie die folgenden Elemente übereinander in der folgenden Reihenfolge und glätten einen sterilen Spatel mit: große Endscheibe (3 in x 3 Zoll), dickes Filterpapier, und dann die Mikrosieb Membran. </li><li> Umkehren und drücken Sie die Form auf einen Stapel von Papierhandtüchern Verlust von überschüssigem Calciumchloridlösung zu gewährleisten. </li><li> Legen Sie die &quot;Gel-Bildung Form&quot; mit den zylindrischen Vertiefungen auf der Oberseite des cell Mikrosieb Membran und befestigen Sie sanft die Form zusammen auf zwei Seiten mit Binder Clips auf der linken und rechten Seite. Achten Sie darauf, genügend Platz für die obere Endscheibe (1,5 Zoll x 3 Zoll) zu verlassen, die Vertiefungen vollständig später zu decken. </li></ol></li><li> Set-up in der zweiten Hälfte (die obere Hälfte) des Form Konstrukt. <ol><li> Legen Sie die folgenden Elemente übereinander in der folgenden Reihenfolge und glätten: kleine Endscheibe, dickes Filterpapier, Mikrosieb Membran. </li><li> Umkehren und drücken Sie diese Hälfte der Form auf einen Stapel von Papierhandtüchern Verlust von überschüssigem Calciumchloridlösung zu gewährleisten. mit Binder Clips zu diesem Zeitpunkt nicht über diese Hälfte der Form zu befestigen. </li></ol></li></ol></li><li> Kulturzellen als den Anweisungen des Herstellers empfohlen. Ernten Sie die gewünschten Zellen in den geschichteten Alginat Hydrogele einbetten. Die empfohlene Zelldichte von 1 bis 2 x 10 6 Zellen / ml, dies kann jedoch je nach gewünschter Experimenten variiert werden. Hinweis: Bei Verwendung dieser Methodefür Schichten mit unterschiedlichen Zelltypen zu machen, machen die Kultur zwei Zelltypen parallel sicher für die Schichtung. Mesenchymale Stammzellen (MSCs) in einer Zelldichte von 1 x 10 6 Zellen / ml wird als ein Beispiel für das folgende Protokoll verwendet werden. Die Zellzahl und Disc-Nummer kann für Experimente skaliert werden nach Bedarf. <ol><li> Ein bis zwei Wochen vor dem Einbetten, seed mesenchymalen Stammzellen in einer Zelldichte von 3000 - 5000 Zellen / cm 2 in 10 ml basale Wachstumsmedien (Dulbeccos Modified Eagle Medium, das 10% fötales Rinderserum, 2% L-Glutamin, 1 % nicht-essentielle Aminosäuren, 1% Penicillin / Streptomycin) in T-75-Flaschen. </li><li> Entfernen Sie verbrauchte Medien alle 2 - 3 Tage und ersetzen mit 10 ml basale Wachstumsmedium, bis die Zellen 80 sind - konfluenten 90%. </li><li> Ernten Zellen, verbrauchtes Medium zu entfernen, und die Pipette 3 ml 1x Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline ohne Zusatz von Calciumchlorid oder Magnesiumchlorid zu spülen Zellen. Entfernen Sie diese Lösung, Pipette 3 ml 0,25% VersuchenPSIN-EDTA auf Zellen in T-75-Kolben wachsen, und bei 37 ° C für 5 min inkubiert. Nachdem die Zellen von der Haftfläche angehoben haben, fügen Sie 6 - 9 ml basale Wachstumsmedien. </li><li> Zentrifuge MSCs bei 600 xg für 5 min bei Raumtemperatur, saugt den Überstand und resuspendiere in 1 bis 5 ml der basalen Wachstumsmedien. Zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Zählkammer Gerät Anweisungen. </li><li> Entfernen Sie 1 x 10 6 Zellen aus der gesamten Zelle Aufwirbelung, Zentrifuge die gleichen Bedingungen verwendet, und den Überstand aspirieren. </li></ol></li></ol> 2. Bildung von Zell Gesetzt Alginate Discs <ol><li> Resuspendieren des Zellpellets mit 1 ml der sterilen Alginat / Medien - Lösung mit einer Zelldichte von 1 x 10 6 Zellen / ml zu erreichen. Das Zell-Alginat-Gemisch wird in Aussehen homogen trübe sein, wenn die Zellen in geeigneter Weise gemischt werden. </li><li> Pipette 130 ul der Zell-Alginat-Mischung in sechs 6 mm Durchmesser x 3 mm tall Vertiefungen in der unteren Hälfte der FormKonstrukt tropft, um keine Luftblasen zu erzeugen. Ein leicht konvexer Meniskus sollte über dem Rand jeder Vertiefung sichtbar. </li><li> Sorgfältig glätten sie über die obere Hälfte der Form Konstrukt, das eine sterile Spachtel und drehen, so dass die Zelle Mikrosieb Membran auf der Oberseite der Brunnen ist. Legen Sie die Form auf der Oberseite der Brunnen bauen, um sicherzustellen, die Vertiefungen, die die Zelle und Alginat-Gemisch vollständig zu bedecken. </li><li> Heben Sie die beschickte Form Konstrukt und unten drücken und fest auf der Mitte, Heftklammer, die verbleibenden zwei Seiten (oben und unten), um die oberen und unteren Hälften der Form Konstrukt zu befestigen. Die Zell-Alginat-Lösungen sollten sicher in den Vertiefungen zu diesem Zeitpunkt eingebettet werden. </li><li> Tauchen Sie die befestigte Form Konstrukt in der 102 mM Calciumchlorid-Bad, um sicherzustellen, dass das gesamte Konstrukt eingetaucht ist. Inkubieren der Zellkultur Haube bei Raumtemperatur für 90 min. </li><li> Am Ende der 90 Minuten, entfernen Sie das Form Konstrukt aus dem 102 mM CalciumchloridBad und auf einen Stapel von Papierhandtüchern in der Zellkultur Kapuze. Entfernen Sie alle vier Binder Clips und trennen die beiden Hälften der Form Konstrukt. Hydrogele in den Vertiefungen gebildet werden, sollten keine Blasen haben und die Vertiefungen vollständig ausfüllen sollte. </li><li> Mit einem Spatel, Spuren sorgfältig den Rand der Vertiefungen der Hydrogele enthaltend die Hydrogele sorgfältig lösen und Keil aus. Nachdem die Hydrogele aus der Form Konstrukts Entfernen Drop die Hydrogele direkt in ein Bad aus 1x Dulbecco Phosphat-gepufferte Saline mit Calciumchlorid und Magnesiumchlorid. Decken Sie die Gele vollständig abzuwaschen das überschüssige Calciumchloridlösung für 1 - 5 min. </li><li> Übertragen Sie die Hydrogele in basalen Nährmedien Lösung in gewünschte Schale (z. B. 6 - Well - Platten) , die vollständig der Hydrogele abdeckt. Mindestens 1 Stunde in der Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2 für vor zur Schichtungsschritt fort. Anmerkung: Hydrogele Zellen enthält, kann gehalten werden indie Zellkultur-Inkubator auf unbestimmte Zeit zu dieser Zeit, bis der Gele mit einem anderen Zellpopulation Schichtung gewünscht wird, vorausgesetzt, dass Medienwechsel alle 2 abgeschlossen sind - 3 Tage. </li></ol> 3. Layering von Alginate Discs <ol><li> Während der letzten halben Stunde der 1-stündigen Inkubation sammeln und bereiten sterile Formen und Lösung für die Gele Glühen. <ol><li> Bereiten Sie die &quot;Stanzform&quot; durch eine Form Befestigung, die Vertiefungen der Hälfte der Höhe der &quot;Gelbildung Form&quot; (6 mm Durchmesser x 1,5 mm groß Brunnen in einem 3 in x 3 in Aluminiumplatte) zu einer Endscheibe (3 in x hat 3 in Aluminiumplatte) -Bindemittel Clips auf der linken und rechten Seite verwendet wird. </li><li> Bereiten Sie die &quot;annealing mold&quot; durch eine Formbefestigungs, die 3 mm im Durchmesser größer als der &quot;Gelbildung mold&quot; (9 mm Durchmesser x 3 mm tall Vertiefungen in einer 3 in x 3 in Aluminiumplatte) zu einer Endplatte (3 in x 3 in Aluminiumplatte) -Bindemittel Clips auf der linken und rechten Seite verwendet wird. </li><li> Eine Lösung aus100 mM Natriumcitrat / 30 mM EDTA (Natriumcitrat-Dihydrat, dihydrat Ethylendiamintetraessigsäure-Tetranatriumsalz) in sterilem Wasser. </li></ol></li><li> Entfernen Sie Gele der gewünschten Zellpopulationen (in diesem Beispiel zwei Scheiben mit hMSCs) von den Medien in der Schale, und legen Sie in die &quot;Stanzform&quot; Brunnen. Jedes Gel sollte eng anliegen in die Vertiefungen mit der Hälfte des Gels über der Form vorsteht. </li><li> Mit einem Skalpell schneiden, das Gel auf der Oberfläche der Form (dies wird das Hydrogel in Hälften geschnitten). Drehen Sie die obere Hälfte des Gels und legen Sie sie in eine offene Form gut. Die Hälfte des Gels sollte auch eng in die Form passt gut, aber jetzt beide Halb Gele sollte die Höhe der Form mit dem ausgeschnittenen Innenfläche sichtbar sein. Wiederholen Sie mit dem zweiten Gel. Hinweis: Achtung: Es werden nur die inneren Schnittflächen werden geschichteten Scheiben bilden. die Außenflächen Verwendung in der Hälften Trenn führen. Es ist diese Textur aus der Mikrosieb Membran auf die Geloberfläche übertragen Verdacht verhindernDer Erfolg des Wärmebehandlungsprozesses. </li><li> Legen Sie ein Stück Trockenzelle Mikrosieb Membran auf der Oberseite der Vertiefungen, um sicherzustellen, dass die Mikrosieb Membran in Kontakt mit allen der Gel-Hälften werden geglüht und bedeckt sie vollständig. Legen Sie dickes Filterpapier auf der Oberseite der Mikrosieb Membran, um sicherzustellen, die Gele vollständig zu bedecken. </li><li> Pipettieren einer Lösung von 100 mM Natriumcitrat / 30 mM EDTA (Natriumcitratdihydrat, dihydrat Ethylendiamintetraessigsäure -tetranatriumsalz) auf den dicken Filterpapier, bis er gesättigt ist. Ungefähr 750 &amp; mgr; l ist für vier Brunnen ausreichend. </li><li> Inkubieren der Gele für 1 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie dann die Zelle Mikrosieb Membran und dicke Filterpapier und entsorgen Sie sie. Entfernen Sie die Binder Clips und öffnen Sie die Form. </li><li> Für jede geglüht Gel, Transfer ein Natriumcitrat / EDTA-behandelten Hälfte des Hydrogels auf die vorbereitete &quot;Glühen Form&quot; mit der Schnittfläche nach oben. Dies wird eine Hälfte des geglüht const seinein- em. </li><li> Mit einem Spatel, Lift und legen Sie eine zweite Natriumcitrat / EDTA-behandelten Halb Gel (eine andere Zelltyp enthalten kann) auf das Gel bereits in der &quot;Glühen Form&quot;, diese zweite Halb Gel Spiegeln, so dass die Schnittfläche in ist Kontakt mit der Schnittfläche des Gels bereits in der &quot;Glühen Form&quot;. </li><li> Drücken Sie vorsichtig auf die beiden Gele mit einem Spatel keine Blasen zwischen den beiden Gele zu entfernen verwenden. Auch neu positionieren die Gele nach Bedarf, um sicherzustellen, dass sie direkt auf voneinander. </li><li> Heben Sie die &quot;Glühen mould&quot; und es in der 102 mM Calciumchlorid-Bad für 30 Minuten untertauchen. Sie nicht die Brunnen mit einer Endscheibe decken. </li><li> Nach der 30 Minuten Inkubation, entfernen Sie das &quot;Glühen mould&quot; und es auf Papiertücher legen. Entfernen Sie die Binder Clips und trennen Sie die Form von der Endscheibe. </li><li> Mit einem Spatel, sammeln die geglüht Gele und sie in einer phosphatgepufferten Salz des 1x Dulbecco mit Calciumchlorid und magnesium Chlorid-Bad die Gele zu waschen. Anschließend übertragen geglüht Hydrogele Zellkulturmedien in einer gewünschten Schale (z. B. 6-well - Platte) für die Kultur. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Bildung von geschichteten Alginat Hydrogelscheiben zur Untersuchung Kokulturen von mehreren Zellpopulationen, wie sie in physiologisch geschichteten Geweben, beispielsweise Knorpel. Schichtstrukturen, wie beispielsweise die Kulturplattform beschrieben, kann das Zusammenspiel zwischen zwei verschiedenen Zellpopulationen zu derselben Kulturumgebung oder unter Belastung zu untersuchen, verwendet werden. Alginate ein anionisches lineares Polysaccha...

Auflast Lager Gewebe wie Gelenkknorpel oder Bandscheiben bestehen aus heterogenen Gewebebereiche, die sowohl für biomechanische Funktion und geeignete mechano-Übertragung im Gewebe entscheidend sind. Nicht nur zelluläre Organisation und Funktion verschieden in den verschiedenen Regionen, aber die extrazellulären Matrizes (ECM) sind ebenfalls in der Zusammensetzung und Organisation variieren. Zum Beispiel besteht Gelenkknorpel von drei primären Zonen mit unterschiedlichen Zellmorphologie, mechanische Funktion und ECM. Die Unterschiede in ihren ECM führen tragende Verantwortung Differential; die oberflächliche Schicht wird in Zugwirkung zu laden, während die mittleren und tiefen Zonen sind in erster Linie verantwortlich für die Reaktion auf Kompression 1 in erster Linie beteiligt. Ebenso in der Bandscheibe, eine gelartige Nucleus pulposus durch eine lamellar Annulus fibrosis und die Zellen in diesen zwei unterschiedlichen Bereichen erfahren verschiedene Arten von Stimuli biophysikalischen umgeben2. In dieser Art von Gewebe, Zellen und der extrazellulären Matrix innerhalb der Gewebeschichten miteinander interagieren , wenn das Gewebe unterzogen wird und reagiert auf mechanische Kräfte. Rekapitulation eines solchen heterogenen Gewebestrukturen bleibt eine Herausforderung im Tissue Engineering und der regenerativen Medizin und unser Verständnis für ihre biologische Bedeutung ist begrenzt. Es besteht ein Bedarf für die Kultivierung von Plattformen für die geschichtete Gewebe sowie Co-Kulturen von verschiedenen Populationen von Zellen innerhalb eines Konstrukts analysiert. Im Gelenkknorpel Tissue Engineering , gerüstlosen Schichtaufbauten wurden durch die Nutzung der Fähigkeit der zonalen Chondrozyten zu deponieren variiert ECM zu imitieren , die verschiedenen Schichten dieses Gewebes 3,4 aufgebaut. Jedoch liefern geschichtete Hydrogels Konstrukten eine Möglichkeit für das Zusammenspiel von verschiedenen Arten von Zellpopulationen untersucht, der die Fähigkeit fehlt, unabhängig eine robuste Gewebe zu bilden. Zum Beispiel können verschiedene Populations von mesenchymalen Stammzellen können in Schichtkonstrukten co-kultiviert werden. Solche Schicht Gerüste wurden mit beiden Chondrozyten und Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen für eine verbesserte Tissue Engineering 5 verwendet. Nicht nur können unterschiedliche Zellpopulationen in ähnlicher Hydrogelschichten co-kultiviert werden, aber ein Zelltyp kann auch innerhalb der Schichten gezüchtet werden , die manipuliert wurden variierende Steifheit oder biochemische Gehalt zu haben , um verschiedene Antworten von Zellen 6,7 hervorzurufen. Viele verschiedene Biomaterial Hydrogele wurden 7-9 zu Schicht Zellpopulationen für die Knorpelgewebetechnik , wie sie unter Verwendung von Polyethylenglykol oder Polyvinylalkohol Basen verwendet. Jedoch Alginat-Hydrogele sind eine der einfachsten Biomaterialien, aus denen für die Untersuchung heterogene Zellpopulationen in Kokultur geschichtete Gerüste zu schaffen. Während Agarose Hydrogele auch leicht gebildet werden, weisen Alginat-Hydrogele den zusätzlichen Vorteil, dass einfach ist,polation von Zellen aus dem 3-D - Konstrukt für die Analyse von einzelnen Zellen , wie bereits zuvor beschrieben 10. In früheren Studien wurden zweischichtige Alginat - Hydrogele wurden in dünnen Blechen gebildet und aus diesen Folien wurden die Schnitte geschnitten (z. B. eine Biopsie Stanze verwendet wird ) für bestimmte Anwendungen , wie beispielsweise für die Analyse von biochemischen Inhalte oder Grenzflächenschereigenschaften 11,12. Ein anderes Verfahren zur Bildung dünner Blätter Alginat wurde mit dem Potential für Schichtung in mehreren Schichten beschrieben, aber dennoch würde Veränderung des Hydrogels für die Verwendung in mechanischen Prüfung 13 erfordern. Hier stellen wir ein Verfahren zur zweischichtigen Alginat Hydrogelscheiben zur Verwendung in Co-Kultivierung von verschiedenen Populationen von Zellen reproduzierbar zu schaffen. Diese Alginat-Disc-Plattform besitzt mehrere Vorteile. In erster Linie die reproduzierbare Form und die geringe Größe ist für die mechanische Stimulation der eingebetteten Zellen förderlich, ohne eine Biopsie pu erfordernnch oder andere physikalische Veränderung des Hydrogels für viele Anwendungen. Darüber hinaus bleibt die Lebensfähigkeit der Zellen während des Beschichtungsprozesses hoch, und nach der Gelbildung eine klare Trennung der beiden Zellpopulationen innerhalb des Gels ist sichtbar ohne anfängliche Überlappungsbereich.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="808">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Alginic Acid sodium salt</td>
			<td style="width:180px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1112</td>
			<td style="width:295px;">Solution made in wt% using DPBS (-/-)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">1x Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (-/-)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">1x Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (+/+)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11965</td>
			<td>Example. Use desired medium type</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Syringe Filters (0.02um Nylon)</td>
			<td style="width:180px;">FisherBrand</td>
			<td style="width:119px;">0979C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">BP510</td>
			<td>Prepare solution in sterile water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Criterion Blotter Filter Paper</td>
			<td style="width:180px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1704085</td>
			<td>Cut to size of endplates for mold formation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Cell Microsieve Membrane (10um pore size)</td>
			<td style="width:180px;">Biodesign Inc of New York</td>
			<td style="width:119px;">N10R</td>
			<td>Cut to size of endplates for mold formation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">0.25% Trypsin-EDTA (1x), phenol red</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td>Thaw in 37&#7506;C water bath</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium citrate dihydrate</td>
			<td style="width:180px;">FisherScience</td>
			<td style="width:119px;">S93364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td style="width:180px;">FisherBioreagent</td>
			<td style="width:119px;">BP121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">26140</td>
			<td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Penicilin/Streptomycin (10000 U/ml)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">15140</td>
			<td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">L-Glutamine (200mM)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Non-essential Amino Acids (100x)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11140050</td>
			<td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

layered alginate constructs: a platform for co-culture of heterogeneous cell populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

1 zeigt die Bildung und die Schichtung der Alginat - Hydrogele. Abgeschlossen zweischichtigen Gele zeigen eine vollständige anfängliche Trennung von Zellpopulationen , wie in 2 gezeigt. Die Lebensfähigkeit der Zellen von humanen mesenchymalen Stammzellen) eingebettet in diesen Hydrogelen und geschichtete bleibt hoch und vergleichbar mit den bulk Hydrogele wie in Figur 3 gezeigt ist . Die Lebensfähigkeit wurde bewertet nach dem Temper...

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Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

Layered Alginate Konstrukten: Eine Plattform für Co-Kultur von heterogenen Zellpopulationen

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.8K Aufrufe.  University of Maryland. Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct. 

Serie: Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Alginat-Mikrokapseln als 3D-Plattform für die Vermehrung und Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) auf verschiedenen Linien

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Forschung

Biotechnik

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Zelle Co-Kultur Strukturierung mit wässrigen Zwei-Phasen-Systeme

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

Eine vielseitige automatisierte Plattform für Mikro-Skala Handy Stimulation Experimente

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Zellzusammendrücken als Robust, Mikrofluidik Intrazelluläre Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Tissue Engineering: Aufbau eines Multizelluläre 3D Gerüst für die Lieferung von Layered Zellschichten

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have contributed dramatically to the understanding of basic mechanobiology. These techniques have been extensively used to demonstrate how the onset and progression of various diseases are heavily influenced by mechanical cues. This article presents a multi-functional biaxial stretching (BAXS) platform that can either mechanically stimulate single cells or quantify the mechanical stiffness of tissues. The BAXS platform consists of four voice coil motors that can be controlled independently. Single cells can be cultured on a flexible substrate that can be attached to the motors allowing one to expose the cells to complex, dynamic, and spatially varying strain fields. Conversely, by incorporating a force load cell, one can also quantify the mechanical properties of primary tissues as they are exposed to deformation cycles. In both cases, a proper set of clamps must be designed and mounted to the BAXS platform motors in order to firmly hold the flexible substrate or the tissue of interest. The BAXS platform can be mounted on an inverted microscope to perform simultaneous transmitted light and/or fluorescence imaging to examine the structural or biochemical response of the sample during stretching experiments. This article provides experimental details of the design and usage of the BAXS platform and presents results for single cell and whole tissue studies. The BAXS platform was used to measure the deformation of nuclei in single mouse myoblast cells in response to substrate strain and to measure the stiffness of isolated mouse aortas. The BAXS platform is a versatile tool that can be combined with various optical microscopies in order to provide novel mechanobiological insights at the sub-cellular, cellular and whole tissue levels.

We present in this article a novel stretching platform that can be used to investigate single cell responses to complex anisotropic biaxial mechanical deformation and quantify the mechanical properties of biological tissues.

A Novel Stretching-Plattform für Anwendungen in der Zell-und Gewebe Mechanobiologie

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

Lebensfähigkeit Bioprinted Cellular Konstrukte unter Verwendung einer Drei Dispenser kartesischen Drucker

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

We describe a set of protocols that together provide a tissue-mimicking hydrogel bioink with which functional and viable 3-D tissue constructs can be bioprinted for use in in vitro screening applications.

Bioprinting cellularized Konstruiert unter Verwendung eines gewebespezifischen Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet encapsulation has been studied extensively as a means to increase islet survival in allogeneic or xenogeneic transplants. Alginate encapsulation is commonly achieved by nozzle extrusion and external gelation. Using this method, cell-containing alginate droplets formed at the tip of nozzles fall into a solution containing divalent cations that cause ionotropic alginate gelation as they diffuse into the droplets. The requirement for droplet formation at the nozzle tip limits the volumetric throughput and alginate concentration that can be achieved. This video describes a scalable emulsification method to encapsulate mammalian cells in 0.5% to 10% alginate with 70% to 90% cell survival. By this alternative method, alginate droplets containing cells and calcium carbonate are emulsified in mineral oil, followed by a decrease in pH leading to internal calcium release and ionotropic alginate gelation. The current method allows the production of alginate beads within 20 min of emulsification. The equipment required for the encapsulation step consists in simple stirred vessels available to most laboratories.

This video and manuscript describe an emulsion-based method to encapsulate mammalian cells in 0.5% to 10% alginate beads which can be produced in large batches using a simple stirred vessel. The encapsulated cells can be cultured in vitro or transplanted for cellular therapy applications.