نشكر صوفي Gournet للحصول على المساعدة مع الرسوم التوضيحية، جولي شوميه لقراءة المخطوطة، ومرفق حظائر الحيوانات ومنصة التصوير وحدة. وقد لقي هذا العمل الدعم في إطار برنامج «INVESTISSEMENTS دي أفنير» التي أطلقتها الحكومة الفرنسية وتنفيذها من قبل وكالة الاستخبارات الوطنية مع المراجع وكالة الاستخبارات الوطنية-10-LABX-0044 وقانون الأحوال الشخصية وكالة الاستخبارات الوطنية-10-آيدكس-0001-02، وEpiGeneSys FP7 لا. 257082 شبكة التميز لEH، وهي هيئة الإنصاف والمصالحة المتقدم باحث جائزة لا. 250367 والاتحاد الأوروبي FP7 SYBOSS منح لا. 242129 لEH فإن الكتاب أود أن أنوه الخلايا والأنسجة منصة التصوير في قسم البيولوجيا التطورية (UMR3215 / U934) علم الوراثة ومعهد كوري، عضو فرانس Bioimaging (وكالة الاستخبارات الوطنية-10-INSB-04)، للمساعدة في ضوء المجهر.

تم تنفيذ الإجراءات الحيوانية وفقا للرعاية الحيوان المؤسسية المعتمدة واستخدام جنة من معهد كوري (CEEA-IC) البروتوكولات (C 75-05-18). كما تم إجراء العمل بموجب موافقة من وزارة التربية الفرنسية العالي والبحث لاستخدام الكائنات المعدلة وراثيا (عدد اتفاق 5549CA-I). 1. إعداد أقسام ناظم البرد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الأجنة من البيض بشكل طبيعي F1 C57BL / 6 × DBA / 2J الفئران كما هو موضح في شي وآخرون، 12. في يوم 7 من الحمل (E7)، التضحية الماوس 8-12 اسبوع من قبل خلع عنق الرحم. جمع الحمل المستكن كامل أي الساقط 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل conceptuses E7، كما هو موضح في شي وآخرون، 12. وضعها في 60 مم طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد E7 الماوس الحمل المستكن لأقسام ناظم البرد. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تكييفها الألومنيوم الآبار احباط 1CM في الارتفاع ( &#39;محلية الصنع&#39; باستخدام الزجاج باستور نقطةوآخرون). إيداع قطرة من المتوسط ​​تجميد الأنسجة على الجزء السفلي من هذه الحاوية الصغيرة. إيداع الحمل المستكن في الاتجاه الصحيح (أي لالمقاطع الطولية الحمل المستكن يجب الاحتفاظ بها في توجهها الأفقي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء البئر تحتوي على الحمل المستكن مع الأنسجة تجميد المتوسطة. تعليق مع ملقط في البخار فوق السائل N 2 من أجل السماح لتجميد ببطء - ثم تزج كتلة في السائل N 2 لبضعة ثوان حتى تتحول إلى اللون الأبيض. وفي وقت لاحق، ونقل كتلة في قارورة تجميد وتخزين في -80 درجة مئوية (يمكن تخزين لعدة أشهر). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البرد باجتزاء، وضع كتلة المجمدة تحتوي على الحمل المستكن في -20 درجة مئوية في ناظم البرد لمدة 30 دقيقة. أداء cryosections من سمك 8 ميكرون. إيداع 4 أقسام على شريحة لتمكين مرفق كفاءة. مكان أقسام قريبة بما فيه الكفاية لتناسب تحت ساترة 18 × 18 مم 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من جودةأقسام (سليمة وبدون خدوش) والتوجه للجنين (المقاطع الطولية) مع مجهر تشريحي واختيار مقاطع مناسبة لمزيد من التحليل. في أسرع وقت ممكن إيداعها في جرة coplin وتنفيذ RNA FISH (انظر 3.3.2). </li></ol> 2. إعداد TGCs الثانوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الحمل المستكن (انظر 1.1 و 1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح E7 المشيمة الظاهر المخروط (EPC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مجهر تشريحي وأطباق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني العقيمة. تشريح الساقط بالملقط. بيرس العينة وملقط مفتوحة المسيل للدموع الجانبين من الساقط على حدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قذيفة من أصل الجنين. استخدام نصائح من ملقط غرامة مغلقة (دومون رقم 5) في العمل مثل المقص لفصل EPC من الجنين السليم. استخدام الرعاية الخاصة للحصول على عينة نظيفة تماما، فصل من الأنسجة الأمهات وكذلك من المشيمه والكيس المحي. تغسل إإكسبلنتس EPC في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع القليل من ملعقة، ونقل EPC تشريح الفردية إلى 4 أهلا وسهلالوحة ل تحتوي على ساترة العقيمة في المتوسط. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تستمد TGCs من EPCS الثقافات قصيرة الأجل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 4-جيدا لوحات تحتوي على coverslips. تعقيم 12 مم الجولة coverslips الزجاج عن طريق غمر في الإيثانول، يليه الشعلة التجفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 مل EPC المتوسطة إلى كل بئر (EPC المتوسطة: RPMI 1640 تستكمل مع 15٪ FCS، 0.1MM 2-المركابتويثانول والمضادات الحيوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واحدة الودائع، تشريح-EPCS في وسط ساترة في البئر جنبا إلى جنب مع الثقافة المتوسطة. استخدام ملقط غرامة لتطبيق الاتفاقية الأوروبية على ساترة الزجاج. Culturefor 3-5 أيام عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2. يزدرع الفردية يشكل ثمرة الذي ينتشر كما أحادي الطبقة من TGCs بالارض (الشكل 2A). </li></ol></li></ol> 3. الحمض النووي الريبي FISH ملاحظة: تستند البروتوكولات على تلك الموصوفة للخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) في شوميه، وآخرون، 8 و إبهام اليد وهيرد 13. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعدادات المتقدمالتموينية من الحلول المالية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 3M خلات الصوديوم العازلة درجة الحموضة 5.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العازلة التهجين 2X تحتوي على 40٪ (ث / ت) كبريتات الصوديوم ديكستران، 20x وديوان الرقابة المالية، 400 ملي Vanadyl ريبونوكليوزيد مجمع (VRC) في 4X المالحة سترات الصوديوم (SSC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المتوسطة المتزايدة التي تحتوي على 90٪ (ت / ت) الجلسرين، 0.1٪ (ث / ت) ف phenylenediamine، ودرجة الحموضة 9 في برنامج تلفزيوني. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلول الطازجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل تثبيتي تتكون من 3٪ الطازجة بارافورمالدهيد (PFA) في برنامج تلفزيوني. يعد حل permeabilization تحتوي على 0.5٪ تريتون-X-100 في برنامج تلفزيوني تستكمل مع 2 مم VRC. إعداد العازلة يغسل عن طريق خلط 50٪ الفورماميد (FA) و 2x SSC وضبط درجة الحموضة إلى 7،2-7،4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير الحمض النووي حل مكافحة تلطيخ تتكون من 1 ميكروغرام / مل دابي (4، 6 diamidino-2-phenylindole هيدروكلوريد) في 2X SSC. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت وPermeabilization في التحضير للFISH <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لخلايا coverslips على، وغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 مفي. إصلاح خلايا coverslips على، أو أقسام الجنينية على الشرائح، لمدة 10 دقيقة في تثبيتي (3٪ PFA) حل في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف خلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X. Permeabilize الخلايا لمدة 5 دقائق في الجليد الباردة حل permeabilization على الجليد. غسل خلايا ثلاث مرات مع 70٪ من الإيثانول. متجر coverslips في لوحات 4 بشكل جيد والشرائح في مربع نقل 4-شريحة في الايثانول 70٪ عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. ملاحظة: Coverslips والشرائح يمكن تخزينها لعدة أشهر في -20 درجة مئوية. لوحات وصناديق تحتوي عليها يجب أن تكون مختومة مع بارافيلم لتجنب الإيثانول التبخر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحمض النووي التحقيق وصفها <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية تحقيقات الحمض النووي عن طريق الترجمة نيك باستخدام النيوكليوتيدات الفلورسنت. اتبع إرشادات الشركة المصنعة (انظر الجدول 1) 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمزيج رد فعل 50 ميكرولتر، إضافة 1-2 ميكروغرام البلازميد، الكروموسومات البكتيرية الاصطناعية (BAC) أو التضخيم التهجير المتعدد (MDA) (لتضخيم الحمض النووي، وانظر 3.4.4) الحمض النووي إلى 17.5 المياه ميكرولتر و 2.5 ميكرولتر 0.2 ملمSR-، SG-، Cy5-dUTP، 10 ميكرولتر 10 ملي كل مزيج dNTP (dGTP، dATP، dCTP)، 5 ميكرولتر 10 ملي dTTP، 5 ميكرولتر العازلة 10X الترجمة نيك و 8 ميكرولتر نيك انزيم الترجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 16 ساعة على 15 درجة مئوية في الظلام. تعطيل رد الفعل من خلال تجميد في -20 درجة مئوية. متجر تحقيقات لعدة أشهر في -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منطقة معان التنموية ملاحظة: للحصول على الحمض النووي BAC، وكمية من الحمض النووي التي تم الحصول عليها بعد إعداد الكلاسيكية منخفضة، وبالتالي يمكن للمرء أن استخدام خطوة من التضخيم الحمض النووي قبل وضع العلامات باستخدام MDA. استخدام عدة التجارية واتباع تعليمات الشركة الصانعة (انظر الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 0.5 ميكرولتر BAC الحمض النووي مع 9.5 عينة العازلة ميكرولتر. الحرارة 3 دقائق عند درجة حرارة 95 درجة مئوية. إخماد على الفور على الجليد. ترك على الجليد 10 دقيقة. تحضير مزيج رد فعل العازلة / الانزيم: (9.5 ميكرولتر + 0.5 مزيج انزيم ميكرولتر) والحفاظ على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 10 مزيج الحمض النووي ميكرولتر + 10 ميكرولتر مزيج رد فعل عازلة / الانزيم. احتضان عند 30 درجة مئوية لا تقل عن 20 ساعة. تعطيل انزيم عينة التدفئة 10 دقيقة في 65 &amp; #176؛ ج. عينة باردة إلى 4 درجات مئوية قبل تخزينها في -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق نجمة داود الحمراء عن طريق الهضم. إضافة 1 ميكرولتر نجمة داود الحمراء، 2 ميكرولتر العازلة 10X، 2 ميكرولتر هند الثالث و 15 ميكرولتر H 2 O. احتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل. تشغيل ببطء على هلام الاغاروز 0،8-1٪ لتأكيد دقة تضخيم الحمض النووي. ينبغي مراعاة شظايا الحمض النووي واضحة عالية الوزن الجزيئي على هلام. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد التحقيق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 0.1 أو 1 ميكروغرام التحقيق في ساترة أو الشرائح. ملاحظة: إضافة 2-5 ميكروغرام من المهد-1 الحمض النووي إذا كنت بحاجة المنافسة على سبيل المثال، فإن معظم تحقيقات لأنها يمكن أن تحتوي على تكرار تسلسل الذي عبر على خلاف ذلك هجن وزيادة الخلفية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لهطول الأمطار، إضافة 5 ميكروغرام السلمون الحمض النووي الحيوانات المنوية، 1/10 حجم 3 M الصوديوم خلات درجة الحموضة 5.2 و 3 مجلدات الإيثانول. تدور في 16000 x ج و 4 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة. غسل الكريات مع 70٪ من الإيثانول وتدور أسفل مرة أخرى لمدة 5 دقائق. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الجافة لمدة 2 دقيقة في بطالة المكثف / سرعة. resuspend في شكل 100٪أميد في نصف الكمية المطلوبة لتهجين (على سبيل المثال، 2.5 ميكرولتر للساترة أو 7 ميكرولتر لأقسام الجنينية على الشريحة). وضع 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز في thermomixer. تفسد لمدة 7 دقائق عند 75 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرواء على الجليد، أو إذا كان مطلوبا وضع المنافسة مباشرة عند 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة. مزيج الحل التحقيق مع حجم مساو من 2X حل التهجين. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التهجين ويغسل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى. coverslips في الآبار، والشرائح في جرة Coplin، عن طريق الغسيل متسلسل في 1X 80٪، 1X 95٪ و 2x الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق لكل منهما. coverslips الجافة والشرائح تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتهجين، تطبيق 5 ميكرولتر مزيج التحقيق التهجين (انظر 3.5) على شريحة وخفض ساترة، مع الخلايا التي تواجه في مزيج التهجين. لأقسام على الشريحة، وتطبيق 14 ميكرولتر مزيج التحقيق التهجين (انظر 3.5)، وتغطي مع ساترة 18 × 18 مم 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الشرائح في غرفة رطبة (المناديل الورقية غارقة في50٪ FA / 2X SSC) واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل، في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل بعد التهجين: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من 50٪ FA / 2X محكمة أمن الدولة على ساترة على الشريحة لتخفيف ذلك. إزالة ساترة بعناية من الشريحة (مع الحرص على عدم كشط الخلايا) ووضعه على جانب خلية يصل الى لوحة 4-جيدا تحتوي على 50٪ FA / 2X محكمة أمن الدولة. لأقسام على الشريحة، إزالة ساترة بطريقة مماثلة، ووضع الشريحة في جرة Coplin يحتوي على 50٪ FA / 2X محكمة أمن الدولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء 3 يغسل، كل لمدة 7 دقائق مع درجة حرارة ما قبل 50٪ FA / 2X محكمة أمن الدولة في 42 درجة مئوية أو 44 درجة مئوية لمدة ساترة أو الشريحة، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء 3 يغسل مع ما قبل تحسنت 2X SSC لمدة 5 دقائق كل في درجة حرارة 42 درجة مئوية أو 44 درجة مئوية لمدة ساترة أو الشريحة، على التوالي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباين نوى عن طريق الغسيل في 2X SSC مع 1 ميكروغرام / مل دابي لمدة 3 دقائق على RT. شطف مرتين مع 2X SSC. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيب Coverslips والشرائح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لساترة صغيرة من مثقف TGCs، تطبيق 5 &amp; #181؛ ل تصاعد المتوسطة على شريحة. ضع ساترة الجانب الخلية أسفل على أعلى من الانخفاض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالشرائح مع أقسام، وتطبيق 15 ميكرولتر المتوسطة على الشريحة المتزايدة. وضع 22 ​​× 22 مم 2 ساترة على أعلى من الانخفاض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجنب الفقاعات. تمحو حل تصاعد الزائد. ختم ساترة مع كمية صغيرة من طلاء الأظافر. إذا كان ذلك ممكنا، صورة الشرائح مباشرة أو تخزينها لمدة تصل إلى عدة أشهر عند -20 درجة مئوية. </li></ol></li></ol> 4. المجهري والتحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول 3D متتابعة الصور ض محور في 0.3 ميكرون باستخدام مجهر مضان (الهدف 63X)، وإجراء تحليل للمداخن صورة 3D باستخدام برنامج ImageJ 14. </li></ol>

<ol>
	<li>Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+insights+into+trophoblast+differentiation+and+placental+morphogenesis.">Genetic insights into trophoblast differentiation and placental morphogenesis.</a> Sem. Cell Dev. Biol. 11, 105-113 (2000).</li><li>Zybina, E. V., Zybina, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polytene+chromosomes+in+mammalian+cells.">Polytene chromosomes in mammalian cells.</a> Int. Rev. Cytol. 165, 53-119 (1996).</li><li>Corbel, C., Diabangouaya, P., Gendrel, A. -. V., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+chromatin+status+and+organization+of+the+inactive+X+chromosome+in+murine+trophoblast+giant+cells.">Unusual chromatin status and organization of the inactive X chromosome in murine trophoblast giant cells.</a> Development. 140, 861-887 (2013).</li><li>Rossant, J., Tamura-Lis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+culture+conditions+on+diploid+to+giant-cell+transformation+in+postimplantation+mouse+trophoblast.">Effect of culture conditions on diploid to giant-cell transformation in postimplantation mouse trophoblast.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 62, 217-227 (1981).</li><li>El-Hashash, A. H., Kimber, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophoblast+differentiation+in+vitro:+establishment+and+characterization+of+a+serum-free+culture+model+for+murine+secondary+trophoblast+giant+cells.">Trophoblast differentiation in vitro: establishment and characterization of a serum-free culture model for murine secondary trophoblast giant cells.</a> Reproduction. 128, 53-71 (2004).</li><li>Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+inactivation+and+the+complexities+of+silencing+a+sex+chromosome.">X inactivation and the complexities of silencing a sex chromosome.</a> Curr Opin Cell Biol. 3, 359-366 (2009).</li><li>Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+in+mouse+embryonic+stem+cells:+analysis+of+histone+modifications+and+transcriptional+activity+using+immunofluorescence+and+FISH.">X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH.</a> Methods Enzymol. 376, 405-419 (2004).</li><li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunofluorescence,+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization,+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes,+transcriptional+activity,+nuclear+organization,+and+X-chromosome+inactivation.">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).</li><li>Okamoto, I., Otto, A. P., Allis, C. D., Reinberg, D., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+dynamics+of+imprinted+XCI+during+early+mouse+development.">Epigenetic dynamics of imprinted XCI during early mouse development.</a> Science. 303, 644-664 (2004).</li><li>Okamoto, I., Arnaud, D., Le Baccon, P., Otte, A. P., Disteche, C. M., Avner, P., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+de+novo+imprinted+X-chromosome+inactivation+independent+of+meiotic+inactivation+in+mice.">Evidence for de novo imprinted X-chromosome inactivation independent of meiotic inactivation in mice.</a> Nature. 438, 369-373 (2005).</li><li>Patrat, C., Okamoto, I., Diabangouaya, P., Vialon, V., Le Baccon, P., Chow, J., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+paternal+X-chromosome+activity+during+imprinted+X-chromosome+inactivation+in+mice.">Dynamic changes in paternal X-chromosome activity during imprinted X-chromosome inactivation in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 5198-5203 (2009).</li><li>Geijsen Shea, K., N, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos.">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> J. Vis. Exp. (2), e160 (2007).</li><li>Pollex, T., Piolot, T., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+combined+with+immunofluorescence,+RNA,+or+DNA+FISH+to+study+the+nuclear+dynamics+and+expression+of+the+X-inactivation+center.">Live-cell imaging combined with immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to study the nuclear dynamics and expression of the X-inactivation center.</a> Methods Mol. Biol. 1042, 13-31 (2013).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Hemberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFPA+award+in+placentology+lecture+-+characteristics+and+significance+of+trophoblast+giant+cells.">IFPA award in placentology lecture - characteristics and significance of trophoblast giant cells.</a> Placenta. 29, 4-9 (2008).</li><li>Carney, E. W., Prideaux, V., Lye, S. J., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+expression+of+trophoblast-specific+genes+during+formation+of+mouse+trophoblast+giant+cells+in+vitro.">Progressive expression of trophoblast-specific genes during formation of mouse trophoblast giant cells in vitro.</a> Mol. Reprod. Dev. 34, 357-368 (1993).</li><li>Shin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Rnf12/RLIM+is+required+for+imprinted+X-chromosome+inactivation+in+mice.">Maternal Rnf12/RLIM is required for imprinted X-chromosome inactivation in mice.</a> Nature. 467, 977-981 (2010).</li><li>Capodieci, P., Donovan, M., Buchinsky, H., Jeffers, Y., Cordon-Cardo, C., Gerald, W., Edelson, J., Shenoy, S. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+in+single+cells+within+tissue.">Gene expression profiling in single cells within tissue.</a> Nat Methods. 9, 663-665 (2005).</li><li>Beliveau, B. J., Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Yilmaz, F., Fonseka, C. Y., McCole, R. B., Chang, Y., Li, J. B., Senaratne, T. N., Williams, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+design+and+synthesis+platform+for+visualizing+genomes+with+Oligopaint+FISH+probes.">Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 21301-21306 (2012).</li><li>Kenny, D., Shen, L., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+viral+infection+and+gene+expression+in+clinical+tissue+specimens+using+branched+DNA+(bDNA)+in+situ+hybridization.">Detection of viral infection and gene expression in clinical tissue specimens using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 1219-1227 (2002).</li><li>Cross, J. C., Baczyk, D., Hemberger, M., Hugues, M., Simmons, D. G., Yamamoto, H., Kingdom, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes,+development+and+evolution+of+the+placenta.">Genes, development and evolution of the placenta.</a> Placenta. 24, 123-130 (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

يمثل الوليدة RNA الأسماك وسيلة سهلة وحساس بالنسبة للتحليل خلية واحدة من النشاط النسخي في الأنسجة الجنينية في مراحل النمو المختلفة. قوة هذا النهج هو القدرة على تحديد الأنساب الجنينية مختلفة في أي مرحلة معينة وفقا لمعايير شكلية. ولكن هذا يتطلب أيضا أن الحد الأدنى من مضان الخلفية الحالي. أي من هذه الخلفية يجعل تحديد المناطق الجنينية المختلفة وأنواع الخلايا التحدي. لضمان الحد الأدنى من الخلفية، هناك نوعان من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول. الأول هو جودة cryosection والثاني هو الكفاءة (إشارة إلى نسبة الضوضاء) من الحمض النووي الريبي FISH، والذي يعتمد على مستوى التعبير الجيني ونوعية التحقيق. لهذا الأخير، وبالتالي اختبار تحقيقات دائما على الخلايا المستزرعة coverslips على (الخلايا الجذعية الجنينية أو الخلايا الجسدية) قبل استخدامها على الأبواب. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم عشر<html> تقنيات الإلكترونية اللازمة لإجراء تحليل الحمض النووي الريبي FISH على TGCs من نوعين مختلفين من إعداد العينات (أقسام ناظم البرد والثقافات الأولية من إإكسبلنتس الجنينية). يتيح هذا التحليل خلية واحدة التغيرات الديناميكية في التعبير الجيني في مختلف مراحل ما بعد الزرع على أن يقسم. واستخدمت أساليب وصفنا لتوليد TGCs الثانوي (في E7-7.5 مراحل ما بعد الزرع) في المختبر لدراسة أنماط الكروموسوم X تعطيل من النسب خارج الجنينية التي تتألف من TGCs في مراحل ما بعد الزرع. تطوير خارج الجنينية في الفئران تعتمد على التفريق بين TGCs. في الواقع، TGCs ضرورية لالمشيمة والتنمية وبالتالي الجنينية. عيوب في TGC التمايز تسبب الفتك الجنينية (للمراجعة أنظر المرجع 15). النشاط النسخي من TGCs باستخدام الحمض النووي الريبي FISH سمح لنا لإثبات وجود كروموسوم X حالة تعطيل غير عادية من هذا نوع من الخلايا خلال تطوير الماوس 3. SS = &quot;jove_content&quot;&gt; الأساليب المقدمة هنا للحصول على ودراسة TGCs الثانوي يمكن تطبيقها على دراسة المسارات الجزيئية في تطوير أنسجة مهمة خارج الجنينية أنهم جزء من، سواء في الفئران العادية ومتحولة. ويمكن تكييف هذه الطرق لتحقيق تنمية TGC في الثدييات الأخرى. تشارك تحليلنا استخدام الأجنة نوع الماوس البرية مما يسمح لنا لتقييم النشاط النسخي من الجينات المختلفة في الجسم الحي في TGCs وفي المختبر TGCs المستمدة من يزدرع EPC. ويمكن تمديد هذه الطريقة لتحليل الفئران المعدلة وراثيا و / أو من خلال إضافة جزيئات المانع في مستنبت. لقد استخدمت بنجاح هذه الطريقة من الحمض النووي الريبي FISH على نوع آخر من TGCs، مثل TGCs الأساسي التي تظهر في مرحلة مبكرة من تطوير الماوس، blastocyts E3.0، التي يمكن أن تكون تربيتها بشكل فردي لمدة 4-5 أيام خلالها المتقدمة ثمرة، و ICM التي تحيط بها TGCs الرئيسي الكبير 16،17. محاضر الوليدة لمختلفالجينات وكذلك Xist يمكن تصور وكميا باستخدام نهج FISH نفس الحمض النووي الريبي 3. المناعي جنبا إلى جنب والحمض النووي الريبي FISH يمكن أيضا أن يؤديها على أقسام ناظم البرد وكذلك في المختبر TGCs مثقف 3. هذا يدل على أن الأسلوب هو قوي جدا، إلى النصوص الأساسية هي عرضة للتدهور وهناك شرطا مطلقا من المركبات المجانية ريبونوكلياز. IF / RNA FISH يوفر معلومات إضافية حول مستويات النسخ، وتوطين الخلوية والتعبير البروتين، في وقت واحد في خلية معينة. وعلى الرغم من أقسام الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين قد سبق استخدامها للكشف عن الحمض النووي الريبي الوليدة في الأورام الإنسان مع الحفاظ على التشكل الأنسجة 18، في أيدينا، أقسام ناظم البرد أكثر ملاءمة للحفاظ على كل من الحمض النووي الريبي الوليدة والحواتم اللازمة للكشف عن الأجسام المضادة التي خلال المناعي . بالإضافة إلى RNA FISH، بعد ايمmunofluorescence، الكروموسومات الحمض النووي FISH يمكن أيضا أن يؤديها على TGCs الثانوي باستخدام تحقيقات المسمى مع fluorochromes، مماثلة لتلك المستخدمة في الحمض النووي الريبي FISH 3. يمكن تحقيقات الفلورسنت تكون إما البلازميدات / fosmids أو البكالوريا، وصفت مع dUTPs الفلورية المستخدمة هنا، ووصف في شوميه، وآخرون.، 8. بدلا من ذلك، [أليغنوكليوتيد fluorescently المسمى يمكن استخدام 19. منذ الحمض النووي FISH لا يتطلب حبلا خصوصية، تحقيقات قليل النوكليوتيد يمكن أن تكون مصممة لاستهداف أي من اثنين من فروع متكاملة في المنطقة المستهدفة. ويمكن أيضا تشعبت تحقيقات الحمض النووي، حيث يتحقق تضخيم إشارة من جولتين متتابعة من تحقيقات محددة ومكبر للصوت أن تستخدم لتعزيز نسبة الإشارة إلى الضوضاء من الإشارات FISH 20. بدلا من ذلك، تحقيقات RNA مثل riboprobes يمكن استخدامها على الرغم من أن في منطقتنا تحقيقات المعتمدة على الحمض النووي يضمن المقايضة أفضل بين جودة الإشارة، والنوعية وسهولة الاستخدام. وأخيرا، 3D صورة acquisitiعلى الضروري من أجل الحصول على المعلومات المكانية اللازمة في هذه الخلايا الكبيرة، ويمكن القيام بها باستخدام مجموعة متنوعة من المجاهر مضان، مثل المجهر Apotome، أو المجاهر epifluorescence مع deconvolution مثل Deltavision (GEH)، أو المجاهر أخرى مناسبة لأقسام الأنسجة التصوير، وكبيرة (&gt; 20 ميكرون) TGCs. وتجدر الإشارة إلى أن لواحد مواضع نسخة الحمض النووي، وإشارة منقط الكشف عنها بواسطة FISH RNA الوليدة أو FISH الحمض النووي قد لا يتم الكشف بسهولة عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر. في الختام، يجب على أساليب وصفنا هنا تكون مفيدة سواء بالنسبة للتحليل مفصل لTGS في سياق تنموي، ولكن أيضا في حالات أمراض أخرى. هي الحفاظ العديد من الجينات التي تشارك في تطوير TGC وظيفة في القوارض بين القوارض والبشر، مثل عوامل النسخ، البروتياز وجزيئات التصاق الخلية 21. الماوس TGCs هي نموذج خلية لدراسة الجينات التي تنظم المشيمة تطورولد تعطي نظرة ثاقبة أمراض المشيمة البشرية. وعلاوة على ذلك، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن هذه الخلايا endoreplicating ومنذ بعض الخلايا السرطانية الانخراط برامج endocycle، بالإضافة إلى عمليات التضخيم الجينات، وأساليب وصفنا يجب أن تكون مفيدة أيضا في التحقيقات خلية واحدة اللازمة لاستكشاف الآليات المؤدية إلى الجينوم عدم الاستقرار في الخلايا السرطانية .

الخلايا العملاقة الأرومة الغاذية الثدييات (TGCs) تشكل حاجزا بين أنسجة الأم والجنين. أنها توسط غرس وغزو الحمل المستكن في الرحم ولعب أدوارا حاسمة في تطور لتشكيل المشيمة. وهي تنتج عوامل عدة النمو (السيتوكينات) والهرمونات الأسرة البرولاكتين / المشيمة محفز الإلبان والمنشطات، اللازمة لنمو الجنين والبقاء على قيد الحياة. TGCs هي خلايا كبيرة، mononucleated والمتعددة الصبغيات مع دورة الخلية، وendocycle، الذي يتكون من بالتناوب S و G مراحل. في الواقع، TGCs وendoreplicating الخلايا، وقادرة على الخضوع لجولات متعددة من الحمض النووي من دون أي تقسيم 2. من أجل التحقيق في الوضع النسخي من الجينات في الجسم الحي، في TGCs بالمقارنة مع أنواع الخلايا الجنينية وخارج الجنين أخرى، الناشئ RNA FISH لا يمكن أن يؤديها في الجسم الحي على أقسام ناظم البرد 3 في مراحل معينة في مرحلة ما بعد الزرع. TGCs يمكن التعرف بسهولة على أبواب بسبب theiص الحجم الكبير ونشاطهم جينات النسخي يمكن تسجيلها ولكن عددها في أوائل مراحل ما بعد الزرع منخفض. ندرة TGCs على أقسام الجنينية E7، قادنا لأداء الثقافات على المدى القصير من الأنسجة الجنينية trophectodermal للحصول TGCs متباينة من أجل دراسة تنظيم التعبير الجيني خلال تطوير الأديم الظاهر الغاذي. وعلاوة على ذلك، من أجل البقاء كما الفسيولوجية ممكن، أنشئت خطوط الخلايا أي الأديم الظاهر الغاذي الخلايا الجذعية (TS) ليست مناسبة دائما للتحقيق في الجيل آليات التنموي للTGCs الثانوي توفر أداة قيمة لدراسة حالات الحمل المرضية المرتبطة عيوب في TGCs بسبب الجين غير طبيعي التنظيم في الفئران. خلايا الأرومة الغاذية من مخروط المشيمة الظاهر (EPC) هي السلائف من TGCs الثانوية 4. وقد سبق أن ذكرت التمايز عفوية من EPCS مثقف لTGCs الثانوي 5. ومع ذلك، وعلى النقيض من TGCs الأساسي، ودراسات عن مختلفا TGC الثانويظلت tiation محدود، presumablydue لصعوبات عزل إإكسبلنتس EPC خالية من أي أنسجة الأم أو الجنين. نحن تكييف هذه الأساليب، من أجل أداء RNA FISH على TGCs الثانوية المشتقة من الأجنة الفردية في E7، وهي مرحلة ما بعد الزرع التنموية حيث TGCs عدد قليل جدا ولكن يمكن أن تتولد من السلائف EPC. لم يكن يحدث من الحمض النووي الريبي FISH لتحليل النصوص الأساسية النووية على مستوى مستوى خلية واحدة على TGCs الثانوي. وهذا يسمح تحليل دقيق من النسخ، وكان يستخدم لإظهار عدم الاستقرار جينية من TGCs في مراحل ما بعد زرع 3. والمثال الكلاسيكي لعلم التخلق في الثدييات، ودرس تعطيل كروموسوم اكس (XCI) في المختبر هيرد 6. في هذه العملية واحدة من الصبغي X 2 في الأنثى هو المعطل. وغير الترميز Xist نسخة المعاطف كروموسوم X الذي يتم التعبير عن ذلك في الخلايا الأنثوية ويطلق إسكات معظم الجينات. باستخدام الحمض النووي الريبي FISH،ويمكن تحقيق النصوص الوليدة من الجينات المرتبطة X كما يمكن تراكم Xist RNA على الكروموزوم (اكس) غير نشط (شي). نحن هنا وصف الإجراء لأداء RNA FISH على أجزاء من الأجنة في مرحلة ما بعد الزرع وعلى الثقافات المدى القصير EPC. مقتبس من تلك التي تم استخدامها لدراسة XCI في تمييز الخلايا الجذعية الجنينية الإناث والأجنة سابق للانغراس 7-11 هذا البروتوكول. نحن نقدم أمثلة على XCI في الأجنة الإناث في الجسم الحي، وكذلك في المختبر TGCs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="738">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:80px;">SMZ 1500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:195px;">Zeiss</td>
			<td style="width:80px;">Stemi SV6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors Pascheff-Wolff</td>
			<td style="width:195px;">Moria</td>
			<td style="width:80px;">MC19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 forceps</td>
			<td style="width:195px;">Roth</td>
			<td style="width:80px;">PK78.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-well tissue culture dishes&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Nunc</td>
			<td style="width:80px;">176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm Petri dishes Falcon</td>
			<td style="width:195px;">Dutsher, France</td>
			<td style="width:80px;">353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm Petri dishes Falcon</td>
			<td style="width:195px;">Dutsher, France</td>
			<td style="width:80px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslips 18x18&#160;</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:80px;">631-1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslips 22x22</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:80px;">631-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 mm glass round coverslips&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Harvard apparatus</td>
			<td style="width:80px;">64-0712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slides Superfrost plus</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:80px;">631-9483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-slide Transport&#160; box&#160; Lockmailer</td>
			<td>Dutsher, France</td>
			<td>40684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryotubes 1.8 ml Corning&#160;</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>10418571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Coplin staining jars</td>
			<td style="width:195px;">Fischer Scientific</td>
			<td>W1561L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TissueTek O.C.T compound</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">61870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1408</td>
			<td>10x&#160; is used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Panreac Quimica, Spain</td>
			<td style="width:80px;">141451</td>
			<td>3% in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton-X-100&#160;&#160;</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td style="width:80px;">&#160;2000-A</td>
			<td>0.5% final</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)&#160;</td>
			<td>New England Biolabs, USA</td>
			<td>S1402S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium dextran sulfate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin&#160; (BSA)</td>
			<td>New England Biolabs, USA</td>
			<td>B9001S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47671-1L-F</td>
			<td>&#160;aliquots kept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Illustra TempliPhi&#160; Kit Construct (Kit MDA)</td>
			<td>Dutsher, France</td>
			<td>25-6400-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nick translation kit</td>
			<td style="width:195px;">Abbott, USA</td>
			<td>07J00-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20x SSC buffer concentrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S6639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrum green dUTP&#160;</td>
			<td>Abbott, USA</td>
			<td>02N32-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrum red dUTP&#160;</td>
			<td>Abbott, USA</td>
			<td>02N34-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy-5 dUTP&#160;</td>
			<td>Dutsher, France</td>
			<td>PA55022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Cot-1 DNA&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18440016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">DNA, MB grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Roche</td>
			<td>DNA from fish sperm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p-phenylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge 5417R</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td>molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf concentrator plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Thermomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquiport Liquid pump</td>
			<td colspan="2">KNF Neuberger, Trenton, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shake&#39;N&#39;Bake Hybridization oven</td>
			<td>Boekel Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Cryostat&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:80px;">CM3050</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcriptional analysis by nascent rna fish of in vivo trophoblast giant cells or in vitro short-term cultures of ectoplacental cone explants

المشيمة مستمد من إحدى النسب خارج الجنينية، الأديم الظاهر الغاذي. في شبه زرع الكيسة الفئران وخلايا الأديم الظاهر الغاذي الجدارية تفرق في الخلايا العملاقة الأرومة الغاذية الابتدائية (TGCs)، بينما تستمر الأديم الظاهر الغاذي قطبي تغمر كتلة الخلايا الداخلية لتتكاثر التفريق في وقت لاحق إلى TGCs الثانوي. TGCs تلعب دورا رئيسيا في تطور المشيمة وضرورية لنجاح الحمل. التحقيق في التنظيم النسخي من جينات معينة خلال التنمية بعد الزرع يمكن أن تعطي نظرة ثاقبة تنمية TGCs. خلايا المخروط المشيمة الظاهر (EPC) من الأجنة في 7-7،5 أيام من الحمل (E7-7.5)، والمستمدة من الأديم الظاهر الغاذي القطبي، تفرق في TGCs الثانوي 1. TGCs يمكن دراستها في الموقع، على أبواب ناظم البرد الأجنة في E7 على الرغم من أن عدد من TGCs منخفض جدا في هذه المرحلة. وسيلة بديلة لتحليل TGCs الثانوي هو استخدام الثقافات على المدى القصير من EPCS الفردية من E7 الجنينالصورة. نقترح تقنية للتحقيق في وضع النسخي من الجينات ذات الاهتمام سواء في المجراة في المختبر على مستوى خلية واحدة باستخدام الفلورية في الموقع التهجين (RNA FISH) لتصور النصوص الوليدة. توفر هذه التقنية قراءات مباشرة في التعبير الجيني وتمكن تقييم حالة الكروموسومات من TGCs، وهي الخلايا endoreplicating كبيرة. في الواقع، سمة أساسية من سمات التمايز النهائي من TGCs هي أنها الخروج من دورة الخلية والخضوع لجولات متعددة من نهج endoreplication.This يمكن تطبيقها للكشف عن التعبير عن أي الجينات وأعرب عن الجسمية و / أو الكروموسومات الجنسية ويمكن أن توفر معلومات هامة إلى التنموية آليات وكذلك أمراض المشيمة.

ويمكن تحديد TGCs على أقسام E7 على تلطيخ دابي بسبب التعريب في الحمل المستكن وحجمها الكبير. ويتضح هذا في الشكل 1A على المقطع الطولي. تم إجراء الحمض النووي الريبي FISH على هذه المقاطع الجنينية من أجل دراسة الكروموزوم (اكس) تعطيل في هذه النسب خارج الجنينية. عدة شرائح أو coverslips يمكن معالجتها في نفس الوقت. باستخدام الأصباغ المختلفة لتسمية RNA من جينات مختلفة، يمكن للمرء اكتشاف النصوص الأساسية مختلفة في نفس النواة. 2 ما لا يقل عن تحقيقات يمكن أن تكون مختلطة معا، على سبيل المثال Xist بالإضافة إلى SG (إشارة خضراء) وAtrx بالإضافة إلى ريال (إشارة حمراء). ويرد مثال على TGC الإناث في الشكل 1B حيث يتم تمثيل 2 الأنساب الأخرى، الجنين السليم (E) والأديم الباطن الحشوي (VE). ويرد نواة TGC مع Xist RNA تغطي X معدن الكرومosome التي المعطل (شي) في حين أن الكروموزوم (اكس) الأخرى التي تنشط (شى) يعرض بضعة يبرز. يتم التعبير عن الجينات Atrx النصوص الأساسية المرتبطة X من الكروموزوم (اكس) نشط (ليس زينت بها Xist) في عدة نسخ بسبب endoreplication. وهذا يوضح monoallelic التعبير على سبيل المثال، تثبيط Atrx على واحدة الكروموزوم (اكس). منذ TGCs غير متجانسة من حيث الحجم كما هو موضح في الشكل 2B، وتسجل فقط أكبرها. يمكن استخدام ثلاثة تحقيقات أيضا كما هو موضح في الشكل 2C لTGCs الثانوي. في هذه الحالة، Xist -SG (الأخضر)، واثنين من الجينات المرتبطة X: G6PD -SR (الحمراء)، وHuwe1 -Cy (أرجواني) تم تحليلها في نفس الوقت في نفس النواة. في حين أعرب G6PD monoallelically كما هو موضح هنا (وسابقا هو مبين في TGCs ثانوية 3) يتم التعبير عن Huwe1 biallelically يدل العلاقات العامة لoperty للهروب XCI. Endoreplication، مع عدة يبرز، أي، محاضر الوليدة نسخة، هو واضح أيضا. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54386/54386fig1.jpg" /> الرقم التعبير 1. نسخة الابتدائي في TGCs من E7 قسم الجنينية الإناث. (A) المقطع الطولي من الحمل المستكن E7 ملطخة دابي. ويحيط الجنين والأنسجة خارج الجنينية من الأنسجة الأم، والساقط. ويتم توطين الأنساب مختلفة على تلطيخ دابي مع الهدف 5X. يتم تحديد TGCs بسبب حجمها الكبير. الفصل، المشيمه، E، جنين، EPC، مخروط المشيمة الظاهر، VE، الأديم الحشوية، TGC، والخلايا العملاقة الأرومة الغاذية. شريط مقياس = 100 ميكرون. وتصور (ب) التكبير العالي في المنطقة محاصر في في ألف (الهدف 63X) RNA FISH. Atrx النسخة الأولية في الحمراء وXist الحمض النووي الريبي في الأخضر على 3 الأنساب = E، VE، TGC. الشوريشريط مزر = 10 ميكرون. مثال TGC في الجسم الحي حيث يتم التعبير عن Atrx monoallelically (شى، رأس السهم) وسكت عن Xist المغلفة الكروموزوم (اكس) (شي)؛ العديد من الإشارات Atrx ينظر إليه على شى ومن المقرر أن endoreplication. Atrx = BAC استنساخ RP23-260I15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54386/54386fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54386/54386fig2.jpg" /> الرقم التعبير 2. نسخة الابتدائي في TGCs الثانوي المستمدة من EPC (أ) منظر عام لزراعة TGCs الثانوي (الهدف X5). شريط مقياس = 100 ميكرون. (ب) النجمة تشير إلى مثال TGCs وفقا لحجم (الهدف 10X) الخاصة بهم. شريط النطاق = 60 ميكرون. (C) مثال على الأنثى الثانوية TGC RNA FISH باستخدام 3 المسابير (Xist دومةفي باللون الأخضر، والتي تغطي المعطل الكروموزوم (اكس): شي) تظهر endoreplication من G6PD وHuwe1 النصوص الأولية (عدة يبرز، باللون الأحمر والبنفسجي). في حين أعرب G6PD monoallelically، Huwe1 التعبير biallelic في هذه النواة Huwe1 = BAC استنساخ RP24-157H12؛ G6PD = BAC استنساخ RP23-13D21. شي = السهم. XA = رأس السهم (الهدف 63X). شريط النطاق = 10 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54386/54386fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants at JoVE.com

Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.

تحليل النسخي التي كتبها الوليدة RNA FISH من<em&gt; في فيفو</em&gt; خلايا الأرومة الغاذية العملاق أو<em&gt; في المختبر</em&gt; الثقافات قصير الأجل من المشيمة الظاهر المخروط إإكسبلنتس

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

transcriptional-analysis-nascent-rna-fish-vivo-trophoblast-giant

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

7.8K Views.  Institut Curie, PSL Research University, CNRS UMR 3215, INSERM U934. Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones. 

Video: Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the cardiac transcriptome from being masked by the global embryonic transcriptome, it is necessary to collect sufficient numbers of hearts for further analyses. Furthermore, as zebrafish cardiac development proceeds rapidly, heart collection and RNA extraction methods need to be quick in order to ensure homogeneity of the samples. Here, we present a rapid manual dissection protocol for collecting functional/beating hearts from zebrafish embryos. This is an essential prerequisite for subsequent cardiac-specific RNA extraction to determine cardiac-specific gene expression levels by transcriptome analyses, such as quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The method is based on differential adhesive properties of the zebrafish embryonic heart compared with other tissues; this allows for the rapid physical separation of cardiac from extracardiac tissue by a combination of fluidic shear force disruption, stepwise filtration and manual collection of transgenic fluorescently labeled hearts.

To analyse cardiac gene expression profiles during zebrafish heart development, total RNA has to be extracted from isolated hearts. Here, we present a protocol for collecting functional/beating hearts by rapid manual dissection from zebrafish embryos to obtain cardiac-specific mRNA.

على نطاق واسع اسماك الزرد الجنينية القلب تشريح لتحليل الترانسكربتي

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

الخلايا الجذعية مثل<em&gt; القيطم</em&gt; الجنينية إإكسبلنتس إلى الدراسة في وقت مبكر العصبية التنموية الميزات<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.

This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.

تقييم الأم الأوعية الدموية إعادة عرض أثناء الحمل في الرحم ماوس

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

تحليل المكاني والزماني لأحدث إرك في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; الخط الجرثومي

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

علاج المخدرات و<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير من خلية بناء العظم، تآكل العظام Osteoclast التفاعلات في نموذج الميداكا السمك هشاشة العظام

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

وجه التفريق بين فروعه المكونة للدم البدائي والنهائي من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

في المختبر تمايز متعددة القدرات البشرية الخلايا الجذعية إلى خلايا الأرومة الغاذية

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

في المختبر نمو بصيلات بريانترال الماوس تحت ظروف محاكاة الجاذبية الصغرية

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...