هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح بمعالجة مستهدفة محددة الوقت لمشيمة الفئران باستخدام كريسبر. سيسمح هذا للباحثين بتوضيح وظائف جينية محددة خلال منتصف إلى أواخر الحمل. التلاعب الجيني الذي يسبب الإفراط في التعبير داخل مشيمة الفأر غير شائع للغاية.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بمجموعة من تغييرات التعبير الجيني داخل المشيمة. لا تثبط عزيمتك إذا كانت الشروط الأولية لهذه التقنية غير ناجحة. نظرا لأن هذه التقنية تمثل تحديا ، فإنها تتطلب قدرا كبيرا من الوقت للتدرب على إتقانها.
للبدء ، ضع السد المخدر مستلقا مع مخروط الأنف للحفاظ على التخدير في منطقة التحضير. حلق بطن السد جيدا. لمنع جفاف القرنية ، ضع الجل المسيل للدموع الاصطناعي على كلتا عيني السد.
ثم استخدم أدوات تطبيق قطنية معقمة لتطهير موقع الجراحة بثلاث جولات متناوبة على الأقل من محلول البوفيدون واليود ، متبوعا ب 70٪ إيثانول مع طبقة نهائية من محلول البوفيدون واليود. بعد التحضير ، انقل السد باستخدام مخروط الأنف المخدر إلى منطقة الجراحة المخصصة. بالنسبة لبضع البطن الرحمي ، ضع السد مستلقيا على طاولة العمليات وقم بتثبيت مخروط الأنف في مكانه بشريط.
ضع وسادة تدفئة أسفل وسادة ماصة مضبوطة على 45 درجة مئوية. بعد التأكد من عمق التخدير عن طريق عدم وجود ارتجاع قرصة إصبع القدم ، استخدم الملقط والمقص لعمل شق خط الوسط بطول سنتيمترين تقريبا عبر جلد الخيام. ثم قم بعمل شق عمودي عبر الصفاق باستخدام ملقط معقم ، يتم خيمته برفق بعيدا عن قرون الرحم.
تدليك كلا قرني الرحم عن طريق الضغط على جانبي البطن بالأصابع لتوجيههم. ضعي الرحم المكشوف فوق الستائر الجراحية المعقمة الموضوعة على أسفل البطن وحافظي على رطوبته بقطرات من محلول ملحي معقم دافئ حسب الضرورة. بمجرد تعرض الرحم ، حدد ثلاثة أزواج من المشيمة للتلاعب.
تسجيل موقع التلاعب المشيمة وتنظيم الأجنة داخل قرون الرحم. لحقن المشيمة من بلازميد التحكم ، قم بتحميل كمية كافية من بلازميد التحكم المناسب لثلاث حقن باستخدام ماصة دقيقة معايرة. قم بإجراء جميع الحقن بين decidua ومنطقة الوصلات على عمق حوالي 0.5 ملم أفقيا في المشيمة.
بعد الحقن ولكن قبل التثقيب الكهربائي مباشرة ، قم بتغطية أماكن التلامس بمحلول ملحي معقم ، مع تطبيق المحلول الملحي بدقة على المواقع الثلاثة على جدار الرحم والمجاديف بقطارة أو حقنة. في غضون دقيقتين من الحقن ، قم بإجراء التثقيب الكهربائي باستخدام زوج من المجاذيف بثلاثة ملليمترات متصلة بجهاز التثقيب الكهربائي. لضمان كفاءة دمج كريسبر وصلاحية الأجنة ، اضبط الإعدادات على 30 فولت ، ونبضة 30 مللي ثانية ، ونبضتين ، ونبضة 970 مللي ثانية ، وأحادية القطب.
اضغطي برفق على مجاذيف التثقيب الكهربائي فوق جدران الرحم على الجوانب الجانبية للمشيمة. ضع مجداف الأنود فوق موقع الحقن والكاثود المقابل مباشرة. اضغط على النبض الموجود على آلة التثقيب الكهربائي وانتظر حتى تكتمل النبضتان قبل إزالة مجاذيف التثقيب الكهربائي.
ثم انتقل إلى حقن المشيمة من البلازميد التجريبي كما هو موضح سابقا. إجراء التثقيب الكهربائي لجميع المشيمة التجريبية الثلاثة المحقونة في غضون دقيقتين من الحقن كما هو الحال بالنسبة للمجموعة الضابطة. بمجرد اكتمال معالجة المشيمة ، قم بتدليك قرون الرحم برفق داخل تجويف البطن باستخدام الأصابع فقط لمعالجة قرون الرحم مباشرة.
قم بإجراء خيوط متقطعة على طبقة الصفاق باستخدام خيوط قابلة للذوبان مطلية ومضفرة بطول 45 سم مع سبيكة إبرة دائرية 13 ملم وثلاثة أثمان. بعد خياطة طبقة الصفاق ، قم بخياطة الجلد بخيوط قابلة للذوبان باستخدام نفس النوع من الغرز القابلة للذوبان المستخدمة في الصفاق. بمجرد اكتمال الخياطة ، ضع لاصقا منسجيا على الغرز على الجلد.
عندما يجف لاصق الأنسجة ، قم بإيقاف تشغيل المرذاذ ونقل السد من منطقة الجراحة إلى قفص داعم على ظهره. تم حقن المشيمة ببلازميد تحكم عام CRISPR Cas9 وبلازميد CRISPR للتحكم في التنشيط أو بلازميد تنشيط IGF-1 SAM. لم تظهر الصور التمثيلية بعد التشريح أي ضرر ملحوظ أو تغيير في المظهر الظاهري في أي مجموعات علاجية.
انخفض معدل بقاء الأجنة غير المعالجة في الفضلات التي تم التلاعب بها إلى متوسط 79.05٪ بينما كان هناك انخفاض كبير في بقاء الأجنة التي تم التلاعب بها بمتوسط 55.56٪ لم يكن هناك فرق كبير في وزن المشيمة لأي مجموعة. لم يكن هناك فرق كبير في زيادة وزن الأم مباشرة بعد الجراحة مقارنة بالعمليات الجراحية الوهمية. أظهرت العديد من السدود الحوامل انخفاضا طفيفا أو لم يحدث أي تغيير في الوزن في اليوم التالي للإجراء ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى تعطل تناول الطعام أثناء الجراحة وبعدها لفترة وجيزة.
أظهرت معظم السدود زيادة في الوزن على E14.5 ولكن في بعض الأحيان كان لا يزال يلاحظ انخفاض في الوزن. أظهر qPCR زيادة كبيرة في تعبير IGF-1 في المشيمة المفرطة التعبير IGF-1 مقابل المشيمة الضابطة. أظهر تقييم ELIZA للمشيمة E14.5 زيادة كبيرة في مستويات بروتين IGF-1 في المشيمة المفرطة التعبير IGF-1 مقابل المشيمة الضابطة.
أظهر التألق الذاتي الأخضر المناطق الفرعية لواجهة الجنين الأم المشيمة مع وضع علامات Cas9 الحمراء في المشيمة المفرطة التعبير IGF-1 فقط ، مما يشير إلى نجاح دمج كريسبر في جميع المناطق الفرعية الثلاث من المشيمة. أكد الفلورسنت في وسم التهجين C2 دمج بلازميد تنشيط IGF-1 مع عدم وجود هجرة إلى المشيمة غير المعالجة. يمكن تحديد المنطقة العشرية والمتاهة المحيطة بمنطقة التقاطع الحمراء المميزة بتلطيخ Prl8a8.
تذكر أن تسجل نوع التلاعب وموقع المشيمة والأجنة المقابلة. يوصى بشدة بتسجيل موقع عنق الرحم والأجنة داخل قرون الرحم. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء تحليل للمشيمة والجنين والسد.
سيسمح ذلك بفهم أكبر للأدوار المحددة للجينات المشيمة في الحمل ووظيفة المشيمة والتطور الجنيني.
