The authors thank Drs. Jeffrey Bloomquist and Daniel Swale for their technical comments and suggestions. This project was partially funded by the Department of Entomology and the College of Agriculture and Life Sciences at Virginia Tech.

1. جمع وإعداد الموضوعات اختبار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع العدد المناسب من النحل من مستعمرة. ملاحظة: إن العدد المطلوب يعتمد على ليس فقط حجم ونطاق التجربة، ولكن أيضا مهارة المحقق. على سبيل المثال، إذا كان هناك 2 مجموعات العلاج مع حجم العينة المطلوبة من 10 النحل في كل مجموعة، قد محقق المهرة معقول جمع لا يقل عن 30 النحل لحساب تشريح فاشلة وينتهي مع 20 شريط فيديو مفيدة للتسجيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليل كمية الوقت الذي يمر بين جمع وتشريح. ملاحظة: على الرغم من أن النحل يمكن أن يضم في المختبر لعدة أيام قبل تشريح، ونسبة نجاح تشريح (أي احتمال من الحفاظ على معدل ضربات القلب مستقر في سفينة الظهرية تشريح) وقد لوحظ أن ينخفض نسبة إلى مقدار الوقت الذي ويعيش النحل بعيدا عن مستعمرة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توفير النحل مع مصدر المياه والغذاء في حين يضم في المختبر. لإكساءmple، كحد أدنى، وتوفير الوصول إلى 50٪ (ث / ت) حل السكروز في الماء (وهذا يكفي لفترات أقل من 6 ساعات). لفترات أطول، وتوفير النحل الوصول إلى العسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النحل منزل في ليلة وضحاها المختبر عند درجة حرارة حوالي 32 درجة مئوية والرطوبة النسبية 60-80٪ للحد من التوتر وتجنب الجفاف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل التشريح، وتخدير النحل لفترة وجيزة للمساعدة في التعامل معها. ملاحظة: هذا يمكن أن تقلل من نسبة نجاح تشريح وتقليل الإنتاجية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هدئ النحل إما عن طريق وضعها على الجليد أو في الثلاجة لفترة طويلة بما يكفي للحد من حركة من أجل مساعدة في التعامل معها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك، كشف لفترة وجيزة النحل إلى CO 2 وذلك للمساعدة في التعامل معها. ملاحظة: التعرض للبرد الموسع يمكن أن تقلل من نسبة نجاح التشريح. تمديد أو التعرض المتكرر للCO 2 يمكن أيضا أن يقلل من نسبة نجاح التشريح. </li></ol></li></ol> 2. تشريحفي ظهري جدار البطن ملاحظة: يجب أن يكون النحل على قيد الحياة في وقت تشريح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط و / أو مقص تسليخ مجهري، إزالة الأرجل والأجنحة لتسهيل تشريح البطن. الحفاظ على كوب صغير أو حاوية مماثلة مملوءة بالماء المقطر قريب لغرض الشطف الصكوك بين التشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما يقيد النحل مع ملقط، واستخدام مقص تسليخ مجهري لقطع أفقيا على طول جدار البطن الظهري بين tergites الأولى والثانية (انظر الشكل 1). </li></ol><img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55029/55029fig1.jpg" /> الشكل 1: عرض الظهرية من البطن النحل. وينبغي أن يتم شق الأولي بين tergites الأولى والثانية، والرمز بواسطة الخط الأحمر. شريط مقياس = 1 مم. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55029/55029fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط عليها</a>البريد لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين تجتاح بخفة الحافة الخلفية للtergite الثاني مع ملقط، قطع طولي على طول كل جانب من النحل من شق الأولي إلى الحشرة (انظر الشكل 2). توخي الحذر عند قطع لتجنب ثقب الجهاز الهضمي. </li></ol><img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55029/55029fig2.jpg" /> الشكل 2: عرض جانبي من بطن النحل. ينبغي الشقوق الثانية والثالثة على طول جانبي البطن، والرمز بواسطة الخط الأحمر. شريط مقياس = 1 مم. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55029/55029fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبادل مقص لمجموعة ثانية من ملقط غرامة والاستفادة منها لفصل بعناية ظهري جدار البطن عن بقية سو البطن. إزالة بلطف الحشرة وأي جزء من الجهاز الهضمي التي لا تزال تعلق على جدار البطن الظهري. تجنب تمزق الأمعاء، كما محتويات يمكن معطف جدار البطن ويعيق التصور السفينة الظهرية. </li></ol><img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/55029/55029fig3.jpg" /> الشكل (3): مشاهدة السفينة الظهرية. مرة واحدة وقد تم إزالة الأمعاء والواخزة، السفينة الظهرية مرئيا على طول خط الوسط من جدار البطن الظهرية تشريح. شريط مقياس = 1 مم. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55029/55029fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترتيب جدار البطن الظهري في الاتجاه المطلوب تحت الكاميرا بحيث السفينة الظهرية مرئية (انظر الشكل 3). استخدام مقص لتقليم تسليخ مجهري بعيدا أي أب الزائدجدار dominal أن يعوق التصور السفينة الظهرية. شكل جدار البطن الظهري يجب أن تشبه كوب الضحلة أو وعاء عندما تقع بشكل صحيح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منذ سفينة الظهرية لا تمتد إلى قطاع البطن أخير للنحل، وإزالة tergite النهائي من أجل تحسين التصور للسفينة الظهرية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستفادة من micropipette حجم قابل للتعديل، وتغطي السفينة الظهرية مع 10 ميكرولتر من محلول متساوي التوتر للحفاظ على الظروف الفسيولوجية وتسهيل ضربات القلب ثابت. ملاحظة: الحل المقترح هو قوة الربع حل رينغر (0.120 غرام كلوريد / L الكالسيوم، 0.105 غرام / لتر كلوريد البوتاسيوم، 0.050 غرام / لتر بيكربونات الصوديوم، و2.250 غرام / لتر كلوريد الصوديوم)، والتي تم العثور عليها لتسهيل مستقرة، ضربات القلب المستمر. </li></ol> 3. مراقبة والتحوير من معدل ضربات القلب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للسفينة الظهرية للجلوس دون عائق حتى يتم التوصل إلى مستقر، ضربات القلب المستمر(عادة في غضون 300 ثانية). ملاحظة: يتم تصور نبضات كما الانقباضات الإيقاعية للسفينة الظهرية. في البداية، قد يبدو أن هناك أي ضربات القلب، وخاصة إذا كان تخدير والنحل، ولكن القلب عادة استئناف الضرب بعد يستريح في محلول متساوي التوتر لعدة دقائق، ويمكن أن يستمر الضرب لساعات، شريطة أن يبقى استحم في حل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس معدل ضربات القلب من حيث عدد نبضة في الدقيقة (BPM). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل عدد من الانقباضات التي لوحظت خلال فترة 60 ثانية. استخدام عداد اليد رصيده وجهاز توقيت لتسهيل هذه العملية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس التغير في معدل ضربات القلب عن طريق تسجيل BPM لوحظ قبل وبعد العلاج بمركب cardiomodulatory. ملاحظة: على الرغم من أن الوقت اللازم لمراقبة تأثير على معدل ضربات القلب قد تختلف تبعا لمجمع يجري اختبارها، والتغيرات في معدل ضربات القلب وعادة ما يمكن أن يلاحظ في غضون دقائق. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد معدل ضربات القلب خط الأساس مباشرة قبلإضافة أي مركب الاختبار. وعادة ما يمكن تحديد معدل ضربات القلب في مرحلة ما بعد العلاج بعد 90-120 ثانية: ملاحظة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد cardiomodulators إمكانية (على سبيل المثال، أوكتوبامين) عن طريق إذابة المركب في محلول متساوي التوتر نفسه الذي استخدم ليستحم السفينة الظهرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مركبات اختبار في حل المحيطة السفينة الظهرية من خلال الاستفادة من micropipetter. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمزيد من الدقة وأعلى إنتاجية، وجعل تسجيل الفيديو من كل موضوع الاختبار ثم استخدام أشرطة الفيديو لتسجيل معدل ضربات القلب في وقت لاحق. ملاحظة: هذا يسمح للمحقق واحد لارباك تشريح من أجل تسهيل الإنتاج المستمر تقريبا من أشرطة الفيديو. عند تسجيل الفيديو، والحد الأدنى الموصى به من طول ما يقرب من 240 ثانية مع أي مركب اختبار يتم إضافتها على علامة 60 ثانية. وهذا يضمن أن المحقق لديه نافذة 60 ثانية لتسجيل معدل ضربات القلب الأساسي ومن ثم نافذة 60 ثانية أخرى لتسجيل بعد المعالجة معدل ضربات القلب 120 ثانيةبعد العلاج. </li></ol>

<ol>
	<li>Klowden, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulatory+Systems.">Circulatory Systems.</a> Physiological Systems in Insects, 3rd Edition. , 365-413 (2013).</li><li>League, G. P., Onuh, O. C., Hillyer, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+structural+and+functional+analysis+of+the+larval+and+adult+dorsal+vessel+and+its+role+in+hemolymph+circulation+in+the+mosquito+Anopheles+gambiae.">Comparative structural and functional analysis of the larval and adult dorsal vessel and its role in hemolymph circulation in the mosquito Anopheles gambiae.</a> J Exp Biol. 218 (Pt 3), 370-380 (2015).</li><li>Wasserthal, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillating+Hemolymph+Circulation+in+the+Butterfly+Papilio-Machaon+L+Revealed+by+Contact+Thermography+and+Photocell+Measurements.">Oscillating Hemolymph Circulation in the Butterfly Papilio-Machaon L Revealed by Contact Thermography and Photocell Measurements.</a> J Comp Physiol. 139 (2), 145-163 (1980).</li><li>Wasserthal, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+circulation+and+tracheal+ventilation+in+holometabolous+insects.">Interaction of circulation and tracheal ventilation in holometabolous insects.</a> Adv Insect Physiol. 26, 297-351 (1996).</li><li>Schwab, E. R., Chilson, R. A., Eddleman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heartbeat+Rate+Modulation+Mediated+by+the+Ventral+Nerve+Cord+in+the+Honey-Bee,+Apis-Mellifera.">Heartbeat Rate Modulation Mediated by the Ventral Nerve Cord in the Honey-Bee, Apis-Mellifera.</a> J Comp Physiol B-Biochem Syst Environ Physiol. 161 (6), 602-610 (1991).</li><li>Kaiser, W., Weber, T., Otto, D., Miroschnikow, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+supply+of+the+heart+and+electrocardiogram+potentials+with+reversed+polarity+in+sleeping+and+resting+honey+bees.">Oxygen supply of the heart and electrocardiogram potentials with reversed polarity in sleeping and resting honey bees.</a> Apidologie. 45 (1), 73-87 (2014).</li><li>Papaefthimiou, C., Theophilidis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Octopamine--a+single+modulator+with+double+action+on+the+heart+of+two+insect+species+(Apis+mellifera+macedonica+and+Bactrocera+oleae):+Acceleration+vs.+inhibition.">Octopamine--a single modulator with double action on the heart of two insect species (Apis mellifera macedonica and Bactrocera oleae): Acceleration vs. inhibition.</a> J Insect Physiol. 57 (2), 316-325 (2011).</li><li>Castro, C. A., Hogan, J. B., Benson, K. A., Shehata, C. W., Landauer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral-Effects+of+Vehicles+-+Dmso,+Ethanol,+Tween-20,+Tween-80,+and+Emulphor-620.">Behavioral-Effects of Vehicles - Dmso, Ethanol, Tween-20, Tween-80, and Emulphor-620.</a> Pharmacol Biochem Behav. 50 (4), 521-526 (1995).</li><li>Papaefthimiou, C., Papachristoforou, A., Theophilidis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+responses+of+the+honeybee+heart+to+nanomolar+concentrations+of+amitraz.">Biphasic responses of the honeybee heart to nanomolar concentrations of amitraz.</a> Pestic Biochem Phys. 107 (1), 132-137 (2013).</li><li>Roeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Octopamine+in+invertebrates.">Octopamine in invertebrates.</a> Prog Neurobiol. 59 (5), 533-561 (1999).</li><li>Johnson, E., Ringo, J., Dowse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Drosophila+heartbeat+by+neurotransmitters.">Modulation of Drosophila heartbeat by neurotransmitters.</a> J Comp Physiol B. 167 (2), 89-97 (1997).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

The protocol presented here provides a simple and effective approach to testing pharmacological compounds for their effects on honey bee heart rate. As observed in prior experiments that either transect the ventral nerve cord of a living insect5 or dissect out the ventral nerve cord when exposing the dorsal vessel7, the loss of central nervous system regulation results in a stable, low frequency heartbeat. The low frequency of beats allows the investigator to visually assess heart rate without havin...

<html> ويتمثل الهدف العام من هذه المنهجية هو السماح للمحقق لمراقبة بسرعة وسهولة، وبتحديد التأثير أن وكيل الدوائي له على معدل ضربات القلب من عسل النحل. النحل، مثل غيرها من الحشرات، يكون نظام الدورة الدموية المفتوحة التي تنشر الدملمف، أي ما يعادل الحشرات من الدم، في جميع أنحاء تجويف الجسم، والمعروفة باسم hemocoel. تداول الدملمف ضروري لنقل المواد الغذائية وعوامل المناعة، والنفايات، وكذلك هرمونات عصبية وغيرها من الجزيئات يشير الى 1. ومما يسهل تداولها من قبل سفينة الظهرية، والتي تمتد على طول خط الوسط الظهرية من الحشرات، وكذلك أجهزة نابض التبعي. ينقسم السفينة الظهرية إلى قسمين متميزة وظيفيا، عين القلب في البطن والشريان الأورطي في الصدر والرأس. تقلصات نشر في الدملمف مضخة القلب نحو الصدر والرأس، في حين تضمن أجهزة نابض التبعي تدفق اللمف الدموي إلى الحدود القصوى. الطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; الحشرات وظيفة القلب ويمكن ملاحظة ذلك باستخدام مجموعة متنوعة من الأساليب، وهذا يتوقف على حجم، مرحلة علم وظائف الأعضاء، أو حياة الحشرة. نهج مشترك لمراقبة معدل ضربات القلب في اليرقات والحشرات الصغيرة هو استخدام التصوير حيوي داخلي 2. هذا الأسلوب هو أقل فائدة في النحل البالغ، ولكن، كما أنه يمكن أن يكون من الصعب عرضها بشكل واضح السفينة الظهرية من خلال جدار البطن. نهج مستقر لتسجيل معدل ضربات القلب في مجموعة متنوعة من الحشرات، بما في ذلك النحل، هو استخدام الحراري الاتصال، الذي يستخدم الثرمستورات تطبيقها على السطح الخارجي للحشرة لكشف نبضات القلب 3،4. كما تم تسجيل معدل ضربات القلب في النحل البالغ باستخدام تقنية الكهربية لقياس والكهربائية 4،5 إشارة مقاومة. هذا الأسلوب يتطلب إدخال أقطاب كهربائية في الحيوان بجانب القلب واستخدام محول مقاومة لتسجيل دقات القلب (4). وبالمثل، استخدمت الكهربائي إلى DETECر الإشارات الكهربائية التي ينتجها القلب وجنبا إلى جنب مع تسجيل فيديو للنحل لمراقبة التغيرات في نشاط القلب 6. وهناك ميزة واضحة لهذه المناهج هي أن معدل ضربات القلب يتم تقييم في حالها، والنحل الحية، وليس في عينة تشريح، مما يساعد على ضمان توفر مجموعة كاملة من الاستجابات الفسيولوجية في هذا الموضوع. وتشمل التحديات من هذه الأساليب المحاسبية لتجميد أو تخدير لهذا الموضوع، والحاجة للحد من متغيرات ومؤثرات الخارجية التي قد تغير معدل ضربات القلب، وكذلك تحديد طريقة تسليم المناسب عند اختبار وكلاء الدوائية. مقاربة أخرى التي استخدمت لدراسة النحل النشاط القلبي لتشريح جزء من الحشرة من أجل فضح القلب، ثم قياس تقلصات سفينة الظهرية باستخدام القوة التشريد محول 7. في هذا البروتوكول، واستحم القلب باستمرار مع المياه المالحة الفسيولوجية التي تعمل بنظام التشغيل والاختبار المشتركmpounds يمكن حله في هذا الحل لتطبيق لهذا الموضوع (7). وهناك فرق كبير بين هذه الطريقة وتلك التي سبق وصفها هو أن الحبل العصبي البطني تتم إزالة، والقضاء على الدور الذي ثبت الجهاز العصبي المركزي للعب في تحوير معدل ضربات القلب 5. والنتيجة هي أن ضربات القلب الأساسي، التي عادة ما تكون غير منتظمة جدا، تستقر على تردد أقل من ذلك بكثير والسعة من عادة ما لوحظ في حشرة تعيش 5،7. ما كل من هذه الأساليب تكون مشتركة هي أنها تتطلب معدات متخصصة للغاية ومكلفة في كثير من الأحيان، بالإضافة إلى مستوى معين من الخبرة، من أجل أن تتم. ولعل أكبر العيب هو أن أيا من هذه الطرق بشكل خاص مناسبة تماما لالتجارب التي تنطوي على اختبار عدد كبير من الموضوعات، مثل فحص مكتبة من مركبات يحتمل cardiomodulatory. أعظم قوة النهج الموصوف هناهو بساطته. بروتوكول من السهل نسبيا لإتقان، والإعداد يتطلب مساحة صغيرة، وفقط المدخلات المالية الحد الأدنى الضروري. والأسلوب يتطلب أكثر قليلا من بعض النحل، عدد قليل من الأدوات الجراحية، وهو محلول متساوي التوتر، وإما المجهر الرقمي أو المجهر التقليدية مع كاميرا رقمية. يتم تشريح النحل لتصور السفينة الظهرية وتستخدم أشرطة الفيديو الرقمية لتسجيل معدل ضربات القلب قبل وبعد العلاج مع وكلاء الدوائية. وعلى الرغم من تسجيل الفيديو ليست في الواقع ضرورية لمراقبة التغيرات في معدل ضربات القلب، وسوف تزيد بشكل كبير الإنتاجية (أي عدد من المواضيع التي يمكن معالجتها في فترة معينة من الزمن). يمكن للمحقق تعظيم كفاءة من خلال تسجيل عدد كبير من أشرطة الفيديو في وقت واحد ومن ثم في وقت لاحق وسجل أشرطة الفيديو هذه في وقت أكثر ملاءمة. ميزة أخرى لهذا النهج هو أن أشرطة الفيديو تسمح المحقق للبدء من جديد، يجب أن توقف عملية التهديف، وجعلها أسهل للالخامسiewer ليكون أعمى للعلاج من أجل الحد من التحيز.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="834">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:200px;">Dino-Lite Edge digital USB microscope</td>
			<td style="width:111px;">Dino-Lite</td>
			<td style="width:119px;">AM4815ZT</td>
			<td style="width:405px;">Any digital microscope or similar setup will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:200px;">Microscope stand</td>
			<td style="width:111px;">Dino-Lite</td>
			<td style="width:119px;">RK-10</td>
			<td>Any stand appropriate for the digital microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:200px;">Laptop or PC</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Necessary for digital microscope</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:200px;">Microdissection scissors (Vannas, 8cm, Straight, 5mm Blades)</td>
			<td style="width:111px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">14003</td>
			<td>Any similar scissors suitable for microdissection will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:200px;">Microdissecting Forceps, 10.2cm, Angled (2 pair)</td>
			<td style="width:111px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">504482</td>
			<td>Any similar forceps suitable for microdissection will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:200px;">Ringers solution 1/4 strength tablets&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">96724-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:200px;">Dissecting tray</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any surface suitable for microdissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:200px;">Single channel 10 &#181;l pipette</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any device capable of accurately delivering 10 &#181;l volume</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:200px;">Pipette tips</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:200px;">Small beaker or container of water</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to rinse instruments between subjects</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:200px;">Hand tally counter</td>
			<td style="width:111px;">Office Depot</td>
			<td style="width:119px;">295033</td>
			<td>Any similar product will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:200px;">Timer</td>
			<td style="width:111px;">Office Depot</td>
			<td style="width:119px;">644219</td>
			<td>Any similar product will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:200px;">Deionized water</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Preparation of Ringers solution and rinsing instruments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and observation of honey bee dorsal vessel for studies of cardiac function

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

لأن العديد من المركبات النشطة الدوائية التي يمكن اختبارها باستخدام هذا البروتوكول هي غير قابلة للذوبان في الماء، فإنه من الضروري أن يكون مذيب يمكن الاعتماد عليها من شأنها أن تسمح المركبات اختبار ليتم تسليمها عن طريق محلول متساوي التوتر تستخدم ليس?...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function at JoVE.com

Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

تشريح ومراقبة من عسل النحل ظهري سفينة لدراسات وظيفة القلب

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination ...

dissection-observation-honey-bee-dorsal-vessel-for-studies-cardiac

Research

JoVE Journal

Biology

10.8K Views.  Virginia Tech. The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

Video: Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to measure odor evoked activity in the antennal lobe1. From then on, it has been continuously refined and applied to different neuropiles in the bee brain. Here, we describe the preparation currently used in the lab to measure activity in mushroom body neurons using a dextran coupled calcium-sensitive dye (Fura-2). We retrogradely stain mushroom body neurons by injecting dye into their axons or soma region. We focus on reducing the invasiveness, to achieve a preparation in which it is still possible to train the bee using PER conditioning. We are able to monitor and quantify the behavioral response by recording electro-myograms from the muscle which controls the PER (M17)2.
After the physiological experiment the imaged structures are investigated in greater detail using confocal scanning microscopy to address the identity of the neurons.

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Bees can be conditioned in an appetitive olfactory learning paradigm (PER-conditioning). Using odors as stimuli, we established a method in which behavior is recorded while simultaneously Calcium Imaging is used to measure odor evoked activity in mushroom body neurons in vivo.

الكالسيوم في الجسم الحي 2 + -- التصوير من الخلايا العصبية بالجسم فطر خلال التعلم الشم في عسل النحل

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

رصد وظيفة القلب في اليرقات ذبابة الفاكهة السوداء البطن للدراسات فسيولوجية

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

الأساسية<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em&gt; طرق: التزامن والمراقبة

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

حيوي داخلي المجهري للدوران الأوعية الدقيقة في العضلات المشمرة ماوس لتحليل الهجرة الجذعية الطرفية المحمولة

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Obtaining Specimens with Slowed, Accelerated and Reversed Aging in the Honey Bee Model

Societies of highly social animals feature vast lifespan differences between closely related individuals. Among social insects, the honey bee is the best established model to study how plasticity in lifespan and aging is explained by social factors.
The worker caste of honey bees includes nurse bees, which tend the brood, and forager bees, which collect nectar and pollen. Previous work has shown that brain functions and flight performance senesce more rapidly in foragers than in nurses. However, brain functions can recover, when foragers revert back to nursing tasks. Such patterns of accelerated and reversed functional senescence are linked to changed metabolic resource levels, to alterations in protein abundance and to immune function. Vitellogenin, a yolk protein with adapted functions in hormonal control and cellular defense, may serve as a major regulatory element in a network that controls the different aging dynamics in workers.
Here we describe how the emergence of nurses and foragers can be monitored, and manipulated, including the reversal from typically short-lived foragers into longer-lived nurses. Our representative results show how individuals with similar chronological age differentiate into foragers and nurse bees under experimental conditions. We exemplify how behavioral reversal from foragers back to nurses can be validated. Last, we show how different cellular senescence can be assessed by measuring the accumulation of lipofuscin, a universal biomarker of senescence.
For studying mechanisms that may link social influences and aging plasticity, this protocol provides a standardized tool set to acquire relevant sample material, and to improve data comparability among future studies.

In honey bee workers, aging depends on social behaviors rather than on chronological age. Here we show how worker-types with very different aging patterns can be obtained and analyzed for cellular senescence.

الحصول على عينات مع تباطأ، وتسارع الشيخوخة في عكس عسل النحل النموذجي

Societies of highly social animals feature vast lifespan differences between closely related individuals. Among social insects, the honey bee is the best ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

إعادة إعماره الوظيفية وآخر قناة قياسات تنقية Wildtype والمسخ CFTR البروتين

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees collect and convert to beebread by placing colonies in a specially constructed enclosed flight area. Methods were developed to analyze the protein and amino acid composition of the pollen and beebread. We also describe how consumption of the beebread was measured and methods used to determine adult worker bee hemolymph protein titers after feeding on beebread for 4, 7 and 11 days after emergence. Methods were applied to determine if genotype affects the conversion of pollen to beebread and the rate that bees consume and acquire protein from it. Two subspecies (European and Africanized honey bees; EHB and AHB respectively) were provided with the same pollen source. Based on the developed methods, beebread made by both subspecies had lower protein concentrations and pH values than the pollen. In general, amino acid concentrations in beebread made by either EHB or AHB were similar and occurred at higher levels in beebread than in pollen. Both AHB and EHB consumed significantly more of the beebread made by AHB than by EHB. Though EHB and AHB consumed similar amounts of each type of beebread, hemolymph protein concentrations in AHB were higher than in EHB. Differences in protein acquisition between AHB and EHB might reflect environmental adaptations related to the geographic region where each subspecies evolved. These differences could contribute to the successful establishment of AHB populations in the New World because of the effects on brood rearing and colony growth.

Here are methods to quantify nutrients in pollen before and after its conversion to beebread by two subspecies of honeybees. We describe techniques to measure beebread consumption and resulting protein titers in both subspecies.

طرق لمقارنة العناصر الغذائية في خبز النحل الذي أدلى به Africanized والعسل النحل الأوروبي والتأثيرات على التتر البروتين الدملمف

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents in the treatment of several diseases. The development of new, innovative strategies for miRNA/siRNA therapy is based on an extensive knowledge of the underlying mechanisms. Recent data suggest that small RNAs are exchanged between cells in a gap junction-dependent manner, thereby inducing gene regulatory effects in the recipient cell. Molecular biological techniques and flow cytometric analysis are commonly used to study the intercellular exchange of miRNA. However, these methods do not provide high temporal resolution, which is necessary when studying the gap junctional flux of molecules. Therefore, to investigate the impact of miRNA/siRNA as intercellular signaling molecules, novel tools are needed that will allow for the analysis of these small RNAs at the cellular level. The present protocol describes the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) microscopy to elucidating the gap junction-dependent exchange of miRNA molecules between cardiac cells. Importantly, this straightforward and non-invasive live-cell imaging approach allows for the visualization and quantification of the gap junctional shuttling of fluorescently labeled small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution. The data obtained by 3D-FRAP confirm a novel pathway of intercellular gene regulation, where small RNAs act as signaling molecules within the intercellular network.

Here, we describe the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) for the analysis of the gap junction-dependent shuttling of miRNA. In contrast to commonly applied methods, 3D-FRAP allows for the quantification of the intercellular transfer of small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution.

تحليل الفجوة تعتمد على تقاطع نقل ميرنا مع المجهر 3D فراب

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment methods. Here we describe methods to measure the quantities of adult bees, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, by photographing frames, and by installing hives on scales and with internal sensors. Data from these periodic evaluations are then combined with running average and daily detrended data on hive weight and internal hive temperature. The resulting datasets have been used to detect colony-level effects of imidacloprid applied in a sugar syrup as low as 5 parts per billion. The methods are objective, require little training, and provide permanent records in the form of sensor output and photographs.

Sublethal doses of pesticides may affect colonies in ways that are difficult to detect using only periodic or visual methods. Methods to measure total adult bee mass, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, photographing frames, and installing sensors, are provided. Data analysis is also addressed.

رصد آثار مستعمرة-مستوى التعرض لمبيدات الآفات المقاسة على نحل العسل

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...