Name: dissection and observation of honey bee dorsal vessel for studies of cardiac function
Uploaded: 2016-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
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The authors thank Drs. Jeffrey Bloomquist and Daniel Swale for their technical comments and suggestions. This project was partially funded by the Department of Entomology and the College of Agriculture and Life Sciences at Virginia Tech.

1. Erhebung und Erstellung von Testpersonen <ol><li> Sammeln Sie die entsprechende Anzahl von Bienen aus der Kolonie. Hinweis: Die Anzahl benötigt, hängt nicht nur von der Größe und der Umfang des Experiments, sondern auch die Fähigkeit des Forschers. wenn es zwei Behandlungsgruppen mit einer gewünschten Probengröße von 10 Bienen pro Gruppe sind, zum Beispiel ein einigermaßen erfahrener Ermittler könnte mindestens 30 Bienen zu machen erfolglos Dissektionen sammeln und mit 20 nützlichen Videos am Ende punkten. </li><li> Minimieren Sie die Zeitspanne, die zwischen Sammlung und Präparation passiert. Hinweis: Obwohl Bienen kann im Labor für Tage vor der Dissektion untergebracht werden, wobei die Erfolgsrate von Dissektionen (dh die Wahrscheinlichkeit einer stabilen Herzfrequenz in einem seziert Rückengefäß aufrechtzuerhalten) wurde beobachtet , bezogen auf die Menge der Zeit zu verringern , dass Bienen sind weg von der Kolonie untergebracht. <ol><li> Geben Sie Bienen mit einer Quelle für Wasser und Nahrung, während im Labor untergebracht. Für EXAmple, auf ein Minimum, den Zugang zu einer 50% (w / v) Saccharoselösung in Wasser (dies ist ausreichend für Zeitdauern von weniger als 6 h). Für längere Zeiträume bieten Bienen den Honig gelangen. </li><li> Haus Bienen im Labor über Nacht bei einer Temperatur von etwa 32 ° C und 60-80% relativer Luftfeuchtigkeit Stress zu reduzieren und Austrocknung zu vermeiden. </li></ol></li><li> Vor der Präparation, betäuben die Bienen kurz in der Handhabung zu erleichtern. HINWEIS: Dies kann die Erfolgsrate von Dissektionen verringern und den Durchsatz zu verringern. <ol><li> Kühlen Sie die Bienen entweder, indem sie auf Eis gestellt oder in einen Kühlschrank für gerade lange genug, um zu reduzieren Bewegung, um bei der Handhabung zu erleichtern. </li><li> Alternativ kurz Bienen zu CO 2 , um bei der Handhabung zu erleichtern aussetzen. HINWEIS: Längere Einwirkung von Kälte kann die Erfolgsrate von Dissektionen reduzieren. Erweiterte oder wiederholter Exposition gegenüber CO 2 kann auch die Erfolgsrate von Dissektionen reduzieren. </li></ol></li></ol> 2. Dissectionvon dorsale Bauchwand HINWEIS: Die Bienen sollten zum Zeitpunkt der Dissektion am Leben. <ol><li> Mit einer Pinzette und / oder Mikrodissektion Schere, entfernen Sie die Beine und Flügel Dissektion des Bauches zu erleichtern. Halten Sie einen kleinen Becher oder einem ähnlichen Behälter mit destilliertem Wasser gefüllt in der Nähe zum Zwecke der Instrumente zwischen Dissektionen Spülen. </li><li> Während die Biene mit einer Pinzette zurückzuhalten, die Mikrodissektion Schere verwenden seitlich zwischen dem ersten und dem zweiten tergites (siehe Abbildung 1) entlang der dorsalen Bauchwand zu schneiden. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55029/55029fig1.jpg" /> Abbildung 1: Dorsale Ansicht der Bienen Bauch. Der anfängliche Einschnitt sollte zwischen den ersten und zweiten tergites hergestellt werden, wie durch die rote Linie bezeichnet. Maßstabsbalken = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55029/55029fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken sie</a>e eine größere Version dieser Figur zu sehen. <ol start="3"><li> Während die leichte Schulter der hinteren Kante des zweiten Tergit mit der Greifzange, die entlang jeder Seite der Biene von der anfänglichen Einschnitt in die Stinger längs geschnitten (siehe Abbildung 2). Seien Sie vorsichtig beim Durchstoßen des Magen-Darm-Trakt zu vermeiden Schneiden. </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55029/55029fig2.jpg" /> Abbildung 2: Seitenansicht der Bienen Bauch. Die zweite und dritte Einschnitte sollten entlang jeder Seite des Abdomens durchgeführt werden, wie durch die rote Linie bezeichnet. Maßstabsbalken = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55029/55029fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55029/55029fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="4"><li> Tauschen Sie die Schere für einen zweiten Satz von feinen Pinzette und verwenden sie sorgfältig auf die dorsale Bauchwand vom Rest trennen of den Bauch. Entfernen Sie vorsichtig die Stinger und einen Teil des Magen-Darm-Trakt, die an der dorsalen Bauchwand befestigt bleibt. Vermeiden Sie den Darm Bersten, als der Inhalt kann Mantel der Bauchdecke und Visualisierung des Rückengefäß behindern. </li></ol><img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55029/55029fig3.jpg" /> Abbildung 3: Ansicht des Rückengefäß. Sobald der Darm und Stinger entfernt worden sind, ist der Rückengefäß sichtbar entlang der Mittellinie der dorsalen Bauchwand seziert. Maßstabsbalken = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55029/55029fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55029/55029fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="5"><li> Ordnen Sie die dorsalen Bauchwand in der gewünschten Ausrichtung unterhalb der Kamera , so dass das Rückengefäß sichtbar ist (siehe Abbildung 3). Nutzen Sie die Mikrodissektion Schere überschüssige ab wegzutrimmendominal Wand, die Visualisierung des dorsalen Fahrzeugs behindert wird. Die Form der dorsalen Bauchwand sollte eine flache Schale oder Schüssel ähneln, wenn sie richtig gelegen. <ol><li> Da das Rückengefäß nicht in die hinterste Abdominalsegment der Biene erweitern, entfernen Sie das letzte Tergit, um die Visualisierung des Rückengefäß zu verbessern. </li></ol></li><li> Mit Hilfe eines einstellbaren Volumen-Mikropipette, decken Sie die Rückengefäß mit 10 ul einer isotonischen Lösung physiologischen Bedingungen zu erhalten und einen stetigen Herzschlag erleichtern. HINWEIS: Die empfohlene Lösung Viertel Stärke Ringer-Lösung (0,120 g / L Calciumchlorid, 0,105 g / l Kaliumchlorid, 0,050 g / L Natriumbicarbonat und 2,250 g / l Natriumchlorid), das eine stabile zu erleichtern gefunden wurde, kontinuierliche Herzschlag. </li></ol> 3. Beobachtung und Modulation der Herzfrequenz <ol><li> Lassen Sie das Rückengefäß ungestört sitzen, bis eine stabile, kontinuierliche Herzschlag erreicht wird(In der Regel innerhalb von 300 sec). HINWEIS: Herzschlag als rhythmische Kontraktionen des dorsalen Gefäß sichtbar gemacht wird. Anfänglich kann es scheinen kein Herzschlag zu sein, besonders wenn die Biene anästhesiert wurde, aber das Herz wird in der Regel schlag fortgesetzt, nachdem mehrere Minuten in isotonischer Lösung ruhen und kann stundenlang weiter zu schlagen, vorausgesetzt, es bleibt in Lösung getaucht. </li><li> Messen Sie die Herzfrequenz in Bezug auf die Anzahl der Schläge pro Minute (BPM). <ol><li> Notieren Sie die Anzahl der Kontraktionen während eines 60 Sekunden Zeit beobachtet. Verwenden Sie einen Handtallykostenzähler und einen Timer, diesen Prozess zu erleichtern. </li></ol></li><li> Messen Sie die Veränderung der Herzfrequenz durch die beobachtete BPM Aufzeichnung vor und nach der Behandlung mit einer cardiomodulatory Verbindung. HINWEIS: Obwohl die Zeit eine Wirkung auf die Herzfrequenz variieren von der Verbindung kann in Abhängigkeit zu beobachten erforderlich getestet werden, können Veränderungen der Herzfrequenz der Regel innerhalb weniger Minuten beobachtet werden. <ol><li> Bestimmen Sie die Basisherzfrequenz unmittelbar vor derdie Zugabe einer Testverbindung. HINWEIS: Die Nachbehandlung Herzfrequenz kann in der Regel nach 90 bis 120 Sekunden bestimmt werden. </li><li> Bereiten Potential cardiomodulators (zB Octopamin) , indem die Verbindung in der gleichen isotonischen Lösung Auflösen verwendet , um die Rückengefäß baden. </li><li> Fügen Sie die Testverbindungen zur Lösung des Rückengefäß umgeben von einer micropipetter verwendet. </li></ol></li><li> Für eine höhere Genauigkeit und einen höheren Durchsatz, eine Videoaufzeichnung eines jeden Probanden machen und dann die Videos verwenden, um die Herzfrequenz zu einem späteren Zeitpunkt punkten. HINWEIS: Dies ermöglicht einen einzelnen Ermittler Dissektionen, um zu staffeln fast kontinuierliche Produktion von Videos zu erleichtern. Wenn die Aufnahme von Videos ist die empfohlene Mindestlänge ca. 240 sec bei jeder Testverbindung, bei der Markierung 60 Sekunden hinzugefügt. Dadurch wird sichergestellt, dass der Prüfer für Scoring-Basisherzfrequenz mit 60 sec Fenster hat und dann eine weitere 60 sec Fenster für Scoring Nachbehandlung Herzfrequenz 120 Sekundennach der Behandlung. </li></ol>

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	<li>Klowden, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulatory+Systems.">Circulatory Systems.</a> Physiological Systems in Insects, 3rd Edition. , 365-413 (2013).</li><li>League, G. P., Onuh, O. C., Hillyer, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+structural+and+functional+analysis+of+the+larval+and+adult+dorsal+vessel+and+its+role+in+hemolymph+circulation+in+the+mosquito+Anopheles+gambiae.">Comparative structural and functional analysis of the larval and adult dorsal vessel and its role in hemolymph circulation in the mosquito Anopheles gambiae.</a> J Exp Biol. 218 (Pt 3), 370-380 (2015).</li><li>Wasserthal, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillating+Hemolymph+Circulation+in+the+Butterfly+Papilio-Machaon+L+Revealed+by+Contact+Thermography+and+Photocell+Measurements.">Oscillating Hemolymph Circulation in the Butterfly Papilio-Machaon L Revealed by Contact Thermography and Photocell Measurements.</a> J Comp Physiol. 139 (2), 145-163 (1980).</li><li>Wasserthal, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+circulation+and+tracheal+ventilation+in+holometabolous+insects.">Interaction of circulation and tracheal ventilation in holometabolous insects.</a> Adv Insect Physiol. 26, 297-351 (1996).</li><li>Schwab, E. R., Chilson, R. A., Eddleman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heartbeat+Rate+Modulation+Mediated+by+the+Ventral+Nerve+Cord+in+the+Honey-Bee,+Apis-Mellifera.">Heartbeat Rate Modulation Mediated by the Ventral Nerve Cord in the Honey-Bee, Apis-Mellifera.</a> J Comp Physiol B-Biochem Syst Environ Physiol. 161 (6), 602-610 (1991).</li><li>Kaiser, W., Weber, T., Otto, D., Miroschnikow, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+supply+of+the+heart+and+electrocardiogram+potentials+with+reversed+polarity+in+sleeping+and+resting+honey+bees.">Oxygen supply of the heart and electrocardiogram potentials with reversed polarity in sleeping and resting honey bees.</a> Apidologie. 45 (1), 73-87 (2014).</li><li>Papaefthimiou, C., Theophilidis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Octopamine--a+single+modulator+with+double+action+on+the+heart+of+two+insect+species+(Apis+mellifera+macedonica+and+Bactrocera+oleae):+Acceleration+vs.+inhibition.">Octopamine--a single modulator with double action on the heart of two insect species (Apis mellifera macedonica and Bactrocera oleae): Acceleration vs. inhibition.</a> J Insect Physiol. 57 (2), 316-325 (2011).</li><li>Castro, C. A., Hogan, J. B., Benson, K. A., Shehata, C. W., Landauer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral-Effects+of+Vehicles+-+Dmso,+Ethanol,+Tween-20,+Tween-80,+and+Emulphor-620.">Behavioral-Effects of Vehicles - Dmso, Ethanol, Tween-20, Tween-80, and Emulphor-620.</a> Pharmacol Biochem Behav. 50 (4), 521-526 (1995).</li><li>Papaefthimiou, C., Papachristoforou, A., Theophilidis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+responses+of+the+honeybee+heart+to+nanomolar+concentrations+of+amitraz.">Biphasic responses of the honeybee heart to nanomolar concentrations of amitraz.</a> Pestic Biochem Phys. 107 (1), 132-137 (2013).</li><li>Roeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Octopamine+in+invertebrates.">Octopamine in invertebrates.</a> Prog Neurobiol. 59 (5), 533-561 (1999).</li><li>Johnson, E., Ringo, J., Dowse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Drosophila+heartbeat+by+neurotransmitters.">Modulation of Drosophila heartbeat by neurotransmitters.</a> J Comp Physiol B. 167 (2), 89-97 (1997).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

The protocol presented here provides a simple and effective approach to testing pharmacological compounds for their effects on honey bee heart rate. As observed in prior experiments that either transect the ventral nerve cord of a living insect5 or dissect out the ventral nerve cord when exposing the dorsal vessel7, the loss of central nervous system regulation results in a stable, low frequency heartbeat. The low frequency of beats allows the investigator to visually assess heart rate without havin...

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist der Prüfer zu ermöglichen, schnell und einfach zu beobachten und die Wirkung zu quantifizieren, dass ein pharmakologisches Mittel auf die Herzfrequenz von Honigbienen hat. Bees, wie andere Insekten, haben ein offenes Kreislaufsystem, die Hämolymphe der Insekten Äquivalent von Blut während der gesamten Körperhöhle, bekannt als Hämocoel verbreitet. Die Zirkulation von Hämolymphe ist essentiell für den Transport von Nährstoffen, Immunfaktoren, Abfallprodukte sowie Neurohormone und andere Signalmoleküle 1. Kreislauf wird durch die Rückengefäß erleichtert, die entlang der dorsalen Mittellinie des Insekts erstreckt, sowie Zubehör pulsatile Organe. Das Rückengefäß gliedert sich in zwei funktionell unterschiedliche Abschnitte, die das Herz in den Bauch und die Aorta im Thorax und Kopf bezeichnet. Propagated Kontraktionen in der Herzpumpe Hämolymphe in Richtung des Thorax und Kopf, während Zubehör pulsierender Organe gewährleisten Hämolymphe Fluss zu den Extremitäten. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Insect Herzfunktion kann unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren beobachtet werden, abhängig von der Größe, der Physiologie oder Lebensstadium des Insekts. Ein gemeinsamer Ansatz zur Beobachtung der Herzfrequenz in Larven oder kleineren Insekten ist die Verwendung von intravital Bildgebung 2. Diese Methode ist weniger nützlich bei erwachsenen Bienen jedoch, da es schwierig sein kann, um das Rückengefäß durch die Bauchdecke deutlich anzuzeigen. Ein etablierter Ansatz zur Erfassung der Herzfrequenz in einer Vielzahl von Insekten, einschließlich Bienen, ist die Verwendung von Kontaktthermographie, die an der Außenseite des Insekten angewendet Thermistoren verwendet , um Herz Pulsationen 3,4 detektieren. Die Herzfrequenz bei erwachsenen Bienen hat auch eine elektrophysiologische Technik aufgezeichnet wurden mit Hilfe eines elektrischen Impedanzsignals 4,5 zu messen. Diese Technik erfordert das Einsetzen von Elektroden in das Tier neben dem Herzen und die Verwendung eines Impedanzwandlers aufzuzeichnen Herzschläge 4. In ähnlicher Weise wurden Elektrokardiogramme verwendet, um DETECt elektrische Signale durch das Herz erzeugt und mit Videoaufzeichnung der bee 6 kombiniert Veränderungen in der Herzaktivität zu beobachten. Ein klarer Vorteil dieser Ansätze ist, dass die Herzfrequenz in einer intakten, lebenden Bienen bewertet wird, anstatt in einem seziert Probe, die die Verfügbarkeit des gesamten Spektrums von physiologischen Reaktionen im Fach hilft sicherzustellen. Die Herausforderungen dieser Ansätze umfassen Buchhaltung zur Immobilisierung oder anesthetization des Subjekts, die Notwendigkeit, außerhalb Variablen und Reize zu begrenzen, die die Herzfrequenz beeinflussen könnten, sowie eine entsprechende Liefermethode bestimmen, wann pharmakologische Wirkstoffe zu testen. Ein weiterer Ansatz, der zur Untersuchung von bee Herzaktivität verwendet wurde , ist , um teilweise das Insekt um sezieren das Herz freizulegen, dann messen dorsal Kontraktionen Gefäß eine Kraftverschiebungswandler 7 verwendet wird . In diesem Protokoll wird das Herz ständig mit dem Laufen physiologischer Kochsalzlösung und Test co gebadetmpounds 7 kann in dieser Lösung für die Anwendung auf dem Gegenstand gelöst werden. Ein signifikanter Unterschied zwischen diesem Verfahren und den zuvor beschriebenen ist , dass der Bauchmark entfernt wird, um die Rolle zu beseitigen , dass das zentrale Nervensystem in Modulieren Herzfrequenz 5 spielen gezeigt ist. Das Ergebnis ist , dass die Basisherzschlag, die in der Regel ziemlich erratisch ist, stabilisiert sich bei einer viel niedrigeren Frequenz und Amplitude als üblicherweise in einem lebenden Insekts 5,7 beobachtet. Was alle diese Methoden gemeinsam haben, ist, dass sie hoch spezialisierte und oft teure Ausrüstung erfordern, zusätzlich zu einem gewissen Maß an Know-how, um durchgeführt werden. Vielleicht ist der größte Nachteil ist, dass keiner dieser Ansätze sind besonders gut geeignet, um Versuche, die eine große Anzahl von Themen beinhalten testen, beispielsweise eine Bibliothek von potentiell cardiomodulatory Screening von Verbindungen. Die größte Stärke des hier beschriebenen Ansatzist seine Einfachheit. Das Protokoll ist relativ einfach zu meistern, das Setup benötigt wenig Platz, und nur ein minimaler finanzieller Aufwand notwendig ist. Das Verfahren erfordert wenig mehr als einige Bienen, einige chirurgische Instrumente, einer isotonischen Lösung und entweder ein digitales Mikroskop oder ein traditionelles Mikroskop mit einer Digitalkamera. Bienen werden seziert die dorsale Gefäß und digitalen Videos verwendet werden, zu visualisieren die Herzfrequenz vor und nach der Behandlung mit pharmakologischen Mitteln zu erfassen. Obwohl Videoaufzeichnung tatsächlich nicht notwendig ist , Änderungen der Herzfrequenz zu beobachten, wird es den Durchsatz stark erhöhen (dh die Anzahl der Probanden , die in einer bestimmten Zeitspanne verarbeitet werden können). Der Prüfer kann die Effizienz zu maximieren, indem sie eine große Anzahl von Videos auf einmal aufzunehmen und dann später erzielte diese Videos zu einem günstigeren Zeitpunkt. Ein weiterer Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass Videos erlauben die Ermittler über zu starten, sollte der Scoring-Prozess unterbrochen werden, und machen es einfacher für die viewer bis auf die Behandlung, um Bias zu reduzieren geblendet werden.

<table><tbody><tr><td>Dino-Lite Edge digital USB microscope</td><td>Dino-Lite</td><td>AM4815ZT</td><td>Any digital microscope or similar setup will suffice</td></tr><tr><td>Microscope stand</td><td>Dino-Lite</td><td>RK-10</td><td>Any stand appropriate for the digital microscope</td></tr><tr><td>Laptop or PC</td><td></td><td></td><td>Necessary for digital microscope</td></tr><tr><td>Microdissection scissors (Vannas, 8 cm, Straight, 5 mm Blades)</td><td>World Precision Instruments</td><td>14003</td><td>Any similar scissors suitable for microdissection will suffice</td></tr><tr><td>Microdissecting Forceps, 10.2 cm, Angled (2 pair)</td><td>World Precision Instruments</td><td>504482</td><td>Any similar forceps suitable for microdissection will suffice</td></tr><tr><td>Ringers solution 1/4 strength tablets&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>96724-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting tray</td><td></td><td></td><td>Any surface suitable for microdissection</td></tr><tr><td>Single channel 10 &amp;micro;l pipette</td><td></td><td></td><td>Any device capable of accurately delivering 10 &amp;micro;l volume</td></tr><tr><td>Pipette tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small beaker or container of water</td><td></td><td></td><td>Used to rinse instruments between subjects</td></tr><tr><td>Hand tally counter</td><td>Office Depot</td><td>295033</td><td>Any similar product will suffice</td></tr><tr><td>Timer</td><td>Office Depot</td><td>644219</td><td>Any similar product will suffice</td></tr><tr><td>Deionized water</td><td></td><td></td><td>Preparation of Ringers solution and rinsing instruments</td></tr></tbody></table>

dissection and observation of honey bee dorsal vessel for studies of cardiac function

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

Da viele der pharmakologisch wirksamen Verbindungen, die nicht löslich sind, getestet werden kann in Wasser unter Verwendung dieses Protokolls ist es erforderlich, ein zuverlässiges Lösungsmittel zu haben, die Testverbindungen über die isotonische Lösung ermöglicht geliefert werden verwendet, um die Rückengefäß baden. Dimethylsulfoxid (DMSO) ist ein Lösungsmittel , das üblicherweise als Vehikel zur Abgabe von experimentellen Arzneimitteln und anderen Verbindungen in Tieren ver...

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Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

Dissection und Beobachtung von Honey Bee Dorsal Schiff für Untersuchungen der Herzfunktion

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.8K Aufrufe.  Virginia Tech. The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

Serie: Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

Die Analyse der Herzkranzgefäße in Gelöscht Embryonale Herz

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and cytokinesis) and acytokinetic mitosis (karyokinesis but no cytokinesis). Such atypical cell cycle variations result in polyploid and multinucleated cells rather than in cell division. Therefore, to determine cardiac turnover and regeneration, it is of crucial importance to correctly identify cardiomyocyte nuclei, the number of nuclei per cell, and their cell cycle status. This is especially true for the use of nuclear markers for identifying cell cycle activity, such as thymidine analogues Ki-67, PCNA, or pHH3. Here, we present methods for recognizing cardiomyocytes and their nuclearity and for determining their cell cycle activity. We use two published transgenic systems: the Myh6-H2B-mCh transgenic mouse line, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and the CAG-eGFP-anillin mouse line, for distinguishing cell division from cell cycle variations. Combined together, these two systems ease the study of cardiac regeneration and plasticity.

To distinguish cell division from cell cycle variations in cardiomyocytes, we present protocols using two transgenic mouse lines: Myh6-H2B-mCh transgenic mice, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and CAG-eGFP-anillin mice, for distinguishing cell division from cell cycle variations.

Visualisierung von Zellzyklus-Variationen und Bestimmung der Nukleation in postnatale Kardiomyozyten

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Visualisierung des schlagenden Herzens in Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Biologie

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

Überwachung Herzfunktion Larven Drosophila melanogaster Für physiologische Untersuchungen

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Novel And Efficient Method for Drosophila Heart Fluorescence Staining with Cryosectioning

Drosophila heart models are widely employed in studying cardiac aging and modeling&#160;human cardiac diseases. However, the dissection of Drosophila hearts before imaging is a meticulous time-intensive process that requires advanced training and motor skills. To address these challenges, we present an innovative protocol that utilizes cryosectioning for the fluorescence imaging of Drosophila heart tissue. The protocol has been demonstrated in imaging the adult Drosophila heart but could be adapted for developmental stages. The method enhances both the efficiency and accessibility of fluorescence staining while preserving the integrity of the tissue. This protocol simplifies the process without compromising the quality of imaging, thereby reducing the dependency on technicians with highly developed training and motor skills. Specifically, we replace complex techniques, such as capillary vacuum suction, with more straightforward methods like tissue embedding. This approach allows for the visualization of cardiac structures with greater ease and reproducibility. We demonstrate the utility of this protocol by effectively detecting key cardiac markers and&#160;achieving high-resolution fluorescence and immunostaining imaging that unveils intricate details of heart morphology and cellular organization. This method provides a robust and accessible tool for researchers exploring Drosophila cardiac biology, facilitating detailed analyses of heart development, function, and disease models.

The Drosophila heart sectioning and fluorescence imaging protocol simplifies studying heart structure and pathologies. This approach involves straightforward sectioning, staining, and imaging, bypassing the technical expertise needed for traditional dissection. It enhances accessibility, making Drosophila a more widely usable model for cardiac-related research within the broader scientific community.

Neuartige und effiziente Methode zur Fluoreszenzfärbung von Drosophila-Herzen mit Kryosektion

Drosophila heart models are widely employed in studying cardiac aging and modeling&#160;human cardiac diseases. However, the dissection of Drosophila ...

Genetik

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

Herz Dissection in Larven, juvenile und adulte Zebrafisch, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

Nagetier Arbeits Herz Modell für die Untersuchung der myokardialen Leistung und Sauerstoffverbrauch

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Dissection Techniques and Histological Sampling of the Heart in Large Animal Models for Cardiovascular Diseases

The standard gross examination and sampling are key elements in the reproducibility and success of experimental studies of cardiovascular diseases carried out in large animals. Considering the complex anatomy of the heart, interspecies differences, and the types of compensatory and pathological reactions, consistent protocols are challenging to implement. The utilization of multiple dissection protocols is usually adapted to suit the prosector's experience, and personal preference continues to be a source of experimental and interobserver variability. Here, the aim is to present the main anatomical features and landmarks, dissection protocols, and histological sampling standards of the heart in some commonly used species (including dogs, pigs, ruminants, and cats) as models of cardiovascular diseases.
Two standard gross examination protocols are presented here. First, the inflow-outflow method, which follows the physiological blood flow direction through the heart and large vessels (frequently used in dogs, ruminants, and pigs), and second, the four-chamber dissection technique (exemplified in cats). Both techniques can be adapted to any species in certain experimental circumstances. The sampling protocols include all the areas of interest (sinoatrial node, ventricles, interventricular septum, atria, valves, and aorta), and if properly carried out, improve both the reproducibility and reliability of experimental studies.

Due to the complex anatomy, a consistently reproducible dissection and harvesting protocol for cardiac samples can be challenging to implement. This manuscript presents the key elements of some standard cardiac dissection protocols, highlighting both the gross examination approaches and the sampling sites commonly used for histopathologic examination.

Dissektionstechniken und histologische Probenahme des Herzens in Großtiermodellen für Herz-Kreislauf-Erkrankungen

The standard gross examination and sampling are key elements in the reproducibility and success of experimental studies of cardiovascular diseases carried ...

Medizin

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Drosophila Vorbereitung und Longitudinal Imaging der Herzfunktion in vivo unter Verwendung optischer Kohärenzmikroskopie (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

Heart Dissection: A Method to Observe Zebrafish Cardiac Development

Source: Singleman C. et. al., <a href="https://www.jove.com/v/3165/" target="_blank">Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio</a>. J. Vis. Exp. (2011).
This video describes a technique of isolating the heart from a zebrafish at multiple developmental stages to study cardiac development, maturation, and ageing.

Herzdissektion: Eine Methode zur Beobachtung der Herzentwicklung von Zebrafischen

Source: Singleman C. et. al., Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio. J. Vis. Exp. (2011).
This video describes a technique ...

Dissection und Beobachtung von Honey Bee Dorsal Schiff für Untersuchungen der Herzfunktion

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