This work was supported by the Swiss National Science Foundation grant 315230_156929/1. M.C.M. is a recipient of a fellowship (Beca Chile Postdoctorado from CONICYT, Ministerio de Educacion, Chile).

وقد تمت الموافقة على التجارب على الحيوانات من قبل اللجنة المحلية لكانتون برن Kantonstierarzt، Kantonaler Veterinärdienst برن (BE85 / 15). 1. إعداد القيطم البويضات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الضفادع (القيطم المورق) على 12 ساعة / 12 ساعة ضوء / دورة الظلام في المياه التي يتم الاحتفاظ بدقة عند 20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة فصوص من المبيض من الضفادع الإناث 9. ملاحظة: إزالة الفصوص هي حافز للتجديد، وغالبا ما تكون نوعية البويضات يحسن مع الجراحة. وتغطي البويضة بواسطة طبقة المحي، وطبقة من خلايا بصيلات، والنسيج الضام التي تحتوي على الأوعية الدموية 21. ويطلق على هيكل كامل من &quot;جراب&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع فصوص من المبايض التي تعج المسام التي تحتوي على البويضات في العقيمة بارت المالحة 7 (MBS) تستكمل مع البنسلين والستربتومايسين (88 ملي كلوريد الصوديوم، 1 ملم بوكل، 2.4 ملم<html> NaHCO 3، 0.82 ملي MgSO 4، 0.41 ملي CaCl 2، 0.33 ملي كا (NO 3) 2، 10 ملم 4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic. HEPES (7.5 درجة الحموضة، هيدروكسيد الصوديوم)، و 100 ميكروغرام / مل البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واحد من مرحلة V-VI 21 بصيلات. عقد الفص المبيض مع ملقط. خفض حلقة البلاتين (الشكل 1) على بصيلات وسحب بلطف حلقة لعرقلة النسيج الضام التي تحتوي على بصيلات من أنسجة المبيض. ملاحظة: تتميز المرحلة V-VI 21 بصيلات عن حجمها (1،0-1،2 مم في القطر) وعلى النقيض جيدة بين نصف الكرة الحيوان مصطبغة داكنة ونصف الكرة نباتية صفراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل فقط بصيلات أبحث صحية (أي كروية تماما ومع تصبغ سليمة) إلى 35 مم طبق بيتري بواسطة ماصة باستير البلاستيك (قطع مرة أخرى إلى قطر افتتاح 1.5 ملم). </li></ol>&quot;jove_title&quot;&gt; 2. Microinjection من مرنا في السيتوبلازم ملاحظة: يتم اشتقاق نظام حقن مكروي الموصوفة هنا من ذلك الذي ذكرته Kressmann وBirnstiel 22. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد cRNAs من cDNAs منها الترميز لمفارز α β 4 2 δ GABA ومستقبلات بواسطة النسخ في المختبر، إضافة بولي (A +) الذيل، وتقدير الحمض النووي الريبي الكهربائي للهلام 23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الماصات حقن مكروي من الشعيرات الدموية البورسليكات الزجاج (1.0 ملم القطر الخارجي (OD)، 0.58 مم القطر الداخلي (ID)، و 100 ملم طول) باستخدام مجتذب micropipette. قطع نصائح من الزجاج الشعيرات الدموية تحت المجهر باستخدام micromanipulator وخييط لخلق قطرها غيض من 12-15 ميكرون مع طرف مشطوف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ردم ماصات حقن مكروي مع زيت البارافين باستخدام الحقنة 10 مل، ومن ثم تحميل ماصة حقن مكروي الصعود إلى ميكر homebuiltجهاز oinjection (الشكل 2). ملاحظة: يتكون جهاز حقن زيت هيدروليكي homebuilt من محرك شواء التي تسيطر عليها التبديل دواسة القدم. تبديل إضافي يتغير الوضع تحول من المحرك. هذا المحرك يقود المسمار ميكرومتر (0.5 ملم / بدوره) أن تتقدم أو تتراجع المكبس من حقنة زجاجية 10 ميكرولتر. والحقن بسرعة حوالي 3 دورة في الدقيقة و 0.5 بدوره يتوافق مع حقن NL 50 في المسام. يتم توصيل غيض من حقنة لأنابيب تترافلوروإيثيلين سميكة الجدران التي هي في حد ذاتها متصلة إبرة الحقن بواسطة قطعة قصيرة جدا من أنابيب Tygon. يقام الشعرية حقن بواسطة تشاك الحفر التي يسيطر عليها من قبل micromanipulator. شغل في النظام بأكمله مع زيت البارافين. وينبغي تجنب أي فقاعات الهواء، لأنها سوف تنال من نظام الحقن. يضيء الإعداد مع مصدر الضوء البارد. مطلوب مجهر تشريحي للسيطرة البصرية. وتصور بصيلات تحت الضوء البارد مع stereomicroscope (40X التكبير). يتم اختبار أداء الإعداد حقن عن طريق حقن التتبع المشعة في البويضات القيطم. وينبغي تسليم 55 NL في الحقن - وحدة تخزين من 45. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة مع طرف بلاستيكية معقمة، اختبار الإعداد عن طريق وضع قطرات من الماء المعقم على الداخل نظيفة من بالحرارة مقاومة للرطوبة (2 × 2 سم). تزج غيض من ماصة الحقن في هذه القطيرات، ثم قم بتشغيل المحرك لسحب المكبس (الضغط السلبي داخل ماصة الحقن). ملاحظة: يجب أن المياه تدخل ماصة وتشكيل واجهة مرئية مع النفط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التراجع غيض من ماصة من الحبرية وتطبيق الضغط الايجابي إلى داخل ماصة الحقن. ينبغي أن تشكل قطرة ماء في غيض من ماصة الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحضير للحقن المسام من بطانة لهم حتى مع القطبين النباتية مشيرا صعودا في الفجوات من شبكة من النايلون (G: 0.8 مم) لصقها على الجزء السفلي من بيطبق الثلاثية (60 ملم) مغطاة MBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء 2 ميكرولتر من مرنا باستخدام ماصة مع طرف بلاستيكية معقمة على الداخل نظيفة من بالحرارة. خذ مرنا حتى في ماصة حقن عن طريق الضغط السلبي إلى داخل ماصة الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع ماصة حقن أكثر من جراب الفردية باستخدام micromanipulator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج إبرة حقن في مركز القطب النباتي وحقن 50 NL مرنا بمعدل تدفق 0.6 ميكرولتر / دقيقة عن طريق الضغط الإيجابي إلى داخل ماصة. انتظر 5-10 الصورة قبل إزالة معلومات سرية حقن ماصة من جراب لتجنب مرنا الهروب. ملاحظة: يجب حقن مرنا في (مصفر) القطب النباتية لتجنب الحقن في النواة، والذي يقع في نصف الكرة الحيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بصيلات حقن إلى طبق بيتري جديد (35 ملم) مليئة 2 مل من MBS. وضع الطبق في برودة النبيذ وضعت في 18 درجة مئوية. احتضان بصيلات حقن 1 -7 أيام قبل التسجيل، اعتمادا على هوية البروتين المعبر عنه حديثا. </li></ol> 3. تجريد من المسام (الشكل 3) ملاحظة: كما هو مذكور أعلاه، البويضة بواسطة طبقة المحي، خلايا بصيلات، والنسيج الضام، والتي تحتوي على الأوعية الدموية 24 تغطيتها، كما هو معروف &quot;جراب&quot;. كل الطبقات باستثناء الطبقة المحي، الذي يوفر الاستقرار الميكانيكي دون منع وصول الحلول إلى سطح الخلية، ويجب إزالتها قبل التجارب الكهربية. وقد سبق أن وصفه المسام دون طبقات الخلايا المحيطة &quot;المعري&quot; البويضة 25. وعادة ما يتم تنفيذ هذه الخطوة على نفس يوم التجارب الكهربية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل عشرة حقن بصيلات إلى أنبوب البورسليكات الزجاج التي تحتوي على 0.5 مل من MBS، 1 ملغ / مل كولاجيناز، و 0.1 ملغ / مل مثبط التربسين. تزج الأنبوب في حمام مائي الحفاظ على 36 درجة مئوية. احتضانجراب لمدة 20 دقيقة ويهز الأنابيب في بعض الأحيان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف بصيلات بنقلهم إلى أنبوب الثاني يحتوي على 1 مل من MBS في RT. تركها في الأنبوب لمدة حوالي 10 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بصيلات إلى أنبوب ثالث يحتوي على 0.5 مل من MBS المركزة مضاعفة تحتوي على 4 ملي الإثيلين غليكول مكرر (2-aminoethylether) - N، N، N &#39;، N&#39;- حمض tetraacetic (EGTA)، واحتضان لهم لمدة 4 دقائق في RT. هز أنبوب في بعض الأحيان. ملاحظة: حل مفرط التوتر (MBS تتركز بشكل مضاعف) يستخدم للحث على انكماش البويضات داخل طبقات الخلايا المسام، وبالتالي فصل طبقات الخلايا الجرابية من البويضة. وأضاف EGTA لكبح النشاط كولاجيناز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف بصيلات بنقلهم إلى أنبوب الثاني يحتوي على 1 مل من MBS في RT. تركها في الأنبوب لمدة حوالي 10 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البويضات إلى طبق بتري (35 مم) التي تحتوي على 2 مل من MBS. تحت مجهر تشريحي، فصل المظاريف الخارجية من بصيلات بواسطةببساطة دفع البويضة المجردة بعيدا باستخدام حلقة البلاتين. ملاحظة: المغلفات الخارجية للالبويضات عصا بحزم إلى الطبق والثقافة، ويمكن فصلها بسهولة من البويضات. وبعض البويضات تفقد عفويا المظاريف الخاصة الخارجية وسيتم استردادها كما البويضات الجرداء. وقد أدى هذا الإجراء في إعداد مستقر نسبيا التي تحافظ على مظهر كروية من البويضات. </li></ol> 4. حل سريع التغيير في جميع أنحاء سيت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء المشبك التجربة الجهد، كما هو موضح 9،26. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير في حل نظام الارواء التي تغذيها الجاذبية من خلال تحويل مفاتيح نضح على النحو المطلوب من قبل التجربة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق حل نضح في 6 مل / دقيقة من خلال الزجاج الشعرية مع قطرها الداخلي 1.35 مم، والفم والتي يتم وضعها عن 0.4 مم من سطح البويضة، للسماح التغيرات السريعة في تركيز ناهض حول البويضة. وكان معدل التغير في السابق تقدير ملاحظة:د الى 70٪ في أقل من 0.5 ق 27. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Gurdon, J. B., Lane, C. D., Woodland, H. R., Marbaix, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+frog+eggs+and+oocytes+for+the+study+of+messenger+RNA+and+its+translation+in+living+cells.">Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells.</a> Nature. 233 (5316), 177-182 (1971).</li><li>Soreq, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthesis+of+biologically+active+proteins+in+mRNA-microinjected+Xenopus+oocytes.">The biosynthesis of biologically active proteins in mRNA-microinjected Xenopus oocytes.</a> CRC Crit Rev Biochem. 18 (3), 199-238 (1985).</li><li>Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Xenopus+oocytes+for+the+functional+expression+of+plasma+membrane+proteins.">Use of Xenopus oocytes for the functional expression of plasma membrane proteins.</a> J Membr Biol. 117 (3), 201-221 (1990).</li><li>Dascal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Xenopus+oocytes+for+the+study+of+ion+channels.">The use of Xenopus oocytes for the study of ion channels.</a> CRC Crit Rev Biochem. 22 (4), 317-387 (1987).</li><li>Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+single+sodium+channels+translated+by+Xenopus+oocytes+after+injection+with+messenger+ribonucleic+acid.">Properties of single sodium channels translated by Xenopus oocytes after injection with messenger ribonucleic acid.</a> J Physiol. 386, 73-90 (1987).</li><li>Sigel, E., Minier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+oocyte:+system+for+the+study+of+functional+expression+and+modulation+of+proteins.">The Xenopus oocyte: system for the study of functional expression and modulation of proteins.</a> Mol Nutr Food Res. 49 (3), 228-234 (2005).</li><li>Colman, A., Hames, B. D., Higgins, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+exogenous+DNA+in+Xenopus+oocytes.">Expression of exogenous DNA in Xenopus oocytes.</a> Transcription and Translation'A Practical Approach. , 49-69 (1984).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defolliculation+of+Xenopus+oocytes.">Defolliculation of Xenopus oocytes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (12), 1377-1379 (2010).</li><li>Smart, T. G., Krishek, B. J., Boulton, A. A., Baker, ., Wolfgang, W. a. l. z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+oocyte+microinjection+and+ion-channel+expression.">Xenopus oocyte microinjection and ion-channel expression.</a> Patch-Clamp Applications and Protocols. , 259-305 (1995).</li><li>Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+sites+involved+in+modulation+of+the+GABA+receptor+channel+by+the+intravenous+anesthetics+propofol,+etomidate+and+pentobarbital.">Functional sites involved in modulation of the GABA receptor channel by the intravenous anesthetics propofol, etomidate and pentobarbital.</a> Neuropharmacology. 105, 207-214 (2016).</li><li>Maldifassi, M. C., Baur, R., Pierce, D., Nourmahnad, A., Forman, S. A., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+positive+allosteric+modulators+of+GABAA+receptors+with+anesthetic+activity.">Novel positive allosteric modulators of GABAA receptors with anesthetic activity.</a> Sci Rep. 6, 25943 (2016).</li><li>Wongsamitkul, N., Baur, R., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+functional+properties+and+subunit+arrangement+of+&#945;4&#946;2&#948;+GABAA+receptors.">Towards understanding functional properties and subunit arrangement of &#945;4&#946;2&#948; GABAA receptors.</a> J Biol Chem. 291 (35), 18474-18483 (2016).</li><li>Burgunder, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chloride+channel+mutations+leading+to+mild+myotonia+among+Chinese.">Novel chloride channel mutations leading to mild myotonia among Chinese.</a> Neuromuscul Disord. 18 (8), 633-640 (2008).</li><li>Steinmann, M. E., Gonzalez-Salgado, A., Butikofer, P., Maser, P., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+heteromeric+potassium+channel+involved+in+the+modulation+of+the+plasma+membrane+potential+is+essential+for+the+survival+of+African+trypanosomes.">A heteromeric potassium channel involved in the modulation of the plasma membrane potential is essential for the survival of African trypanosomes.</a> FASEB J. 29 (8), 3228-3237 (2015).</li><li>Gonzalez-Salgado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=myo-Inositol+uptake+is+essential+for+bulk+inositol+phospholipid+but+not+glycosylphosphatidylinositol+synthesis+in+Trypanosoma+brucei.">myo-Inositol uptake is essential for bulk inositol phospholipid but not glycosylphosphatidylinositol synthesis in Trypanosoma brucei.</a> J Biol Chem. 287 (16), 13313-13323 (2012).</li><li>Gonzalez-Salgado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+brucei+Bloodstream+Forms+Depend+upon+Uptake+of+myo-Inositol+for+Golgi+Complex+Phosphatidylinositol+Synthesis+and+Normal+Cell+Growth.">Trypanosoma brucei Bloodstream Forms Depend upon Uptake of myo-Inositol for Golgi Complex Phosphatidylinositol Synthesis and Normal Cell Growth.</a> Eukaryot Cell. 14 (6), 616-624 (2015).</li><li>Wu, M., Gerhart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raising+Xenopus+in+the+laboratory.">Raising Xenopus in the laboratory.</a> Methods Cell Biol. 36, 3-18 (1991).</li><li>Gurdon, J. B., Wilt, F. H., Wessels, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+clawed+frogs.">American clawed frogs.</a> Methods in developmental biology. , 75-84 (1967).</li><li>Elsner, H. A., Honck, H. H., Willmann, F., Kreienkamp, H. J., Iglauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poor+quality+of+oocytes+from+Xenopus+laevis+used+in+laboratory+experiments:+prevention+by+use+of+antiseptic+surgical+technique+and+antibiotic+supplementation.">Poor quality of oocytes from Xenopus laevis used in laboratory experiments: prevention by use of antiseptic surgical technique and antibiotic supplementation.</a> Comp Med. 50 (2), 206-211 (2000).</li><li>Green, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+oogenesis+in+the+South+African+clawed+frog+(Xenopus+laevis).">Factors affecting oogenesis in the South African clawed frog (Xenopus laevis).</a> Comp Med. 52 (4), 307-312 (2002).</li><li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+in+Xenopus+laevis+(Daudin).+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals.">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J Morphol. 136 (2), 153-179 (1972).</li><li>Kressmann, A., Celis, J. E., Grassmann, A., Loyter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birnstiel+M.L.+Surrogate+genetics.">Birnstiel M.L. Surrogate genetics.</a> Transfer of Cell Constituents into Eucaryotic Cells. , 388-407 (1980).</li><li>Middendorp, S. J., Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+modulation+of+synaptic+and+extrasynaptic+GABAA+receptors+by+an+antagonist+of+the+high+affinity+benzodiazepine+binding+site.">Positive modulation of synaptic and extrasynaptic GABAA receptors by an antagonist of the high affinity benzodiazepine binding site.</a> Neuropharmacology. 95, 459-467 (2015).</li><li>Dumont, J. N., Brummett, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+in+Xenopus+laevis+(Daudin).+V.+Relationships+between+developing+oocytes+and+their+investing+follicular+tissues.">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). V. Relationships between developing oocytes and their investing follicular tissues.</a> J Morphol. 155 (1), 73-97 (1978).</li><li>Dascal, N., Landau, E. M., Lass, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+oocyte+resting+potential,+muscarinic+responses+and+the+role+of+calcium+and+guanosine+3',5'-cyclic+monophosphate.">Xenopus oocyte resting potential, muscarinic responses and the role of calcium and guanosine 3',5'-cyclic monophosphate.</a> J Physiol. 352, 551-574 (1984).</li><li>Buckingham, S. D., Pym, L., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocytes+as+an+expression+system+for+studying+receptor/channel+targets+of+drugs+and+pesticides.">Oocytes as an expression system for studying receptor/channel targets of drugs and pesticides.</a> Methods Mol Biol. 322, 331-345 (2006).</li><li>Sigel, E., Baur, R., Trube, G., M&#246;hler, H., Malherbe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+subunit+combination+of+rat+brain+GABAA+receptors+on+channel+function.">The effect of subunit combination of rat brain GABAA receptors on channel function.</a> Neuron. 5, 703-711 (1990).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

الطرق الموضحة في هذه المقالة تحيد عن تلك المستخدمة تقليديا 7-9. ذلك هو المعيار لفضح فصوص من المبيض إلى 1-2 ح العلاج كولاجيناز 8؛ عزل التالفة، البويضات الجرداء. وضخها مع مرنا باستخدام أجهزة حقن التجارية. هذا الإجراء الكلاسيكي لديه عيوب التالية: 1) من المرجح أن ?...

وتستخدم على نطاق واسع البويضات القيطم كنظام للتعبير (المراجع 2-3، والمراجع فيها). وهم قادرون على تجميع ودمج البروتينات multisubunit نشطة وظيفيا في أغشية البلازما الخاصة بهم بشكل صحيح. باستخدام هذا النظام، فمن الممكن للتحقيق وظيفيا بروتينات الغشاء وحدها أو بالاشتراك مع غيرها من البروتينات، لدراسة خصائص، خيالية، أو البروتينات متصلا تحور، ولفحص المخدرات المحتملة. وتشمل مزايا استخدام البويضات على الأنظمة التعبير مغاير غيرها من معالجة بسيطة من الخلايا العملاقة، ونسبة عالية من الخلايا معربا عن المعلومات الوراثية الأجنبية، وتحكم بسيطة من بيئة البويضة عن طريق نضح حمام، والسيطرة على غشاء المحتملة . عيب هذا النظام هو التعبير التفاوت الموسمي لوحظ في العديد من المختبرات 17-20. والسبب في هذا الاختلافأبعد ما يكون عن الوضوح. بالإضافة إلى ذلك، كثيرا ما لوحظ نوعية البويضات تختلف بشدة. وشملت الطرق التقليدية 7-9 عزلة فصوص المبيض، والتعرض للفصوص المبيض إلى كولاجيناز لبعض ساعة، واختيار من البويضات الجرداء، وحقن مكروي بويضة. هنا، وأفاد عدد من وإجراءات سريعة البديلة التي سمحت لنا للعمل مع هذا النظام التعبير لأكثر من 30 عاما مع عدم وجود التفاوت الموسمي واختلاف بسيط في نوعية البويضة. طرق تعديل وتحسين وصفها هنا لعزل البويضات، حقن مكروي مع كرنا، وإزالة طبقات الخلايا الجرابية يمكن أن تستخدم للتعبير عن أي بروتين من خيار في البويضة القيطم. ويمكن تطبيق طريقة بسيطة جدا لتغيرات حل سريع للوسط حول البويضة لدراسة أي القناة الايونية بوابات يجند وناقلات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1467">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">NaCl</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">71380</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">P-9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">M-1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:663px;">CaCl2&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">223560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:663px;">Ca(NO3)2&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">C1396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">HEPES</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">Penicilin/streptomycin</td>
			<td style="width:240px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">15140-148</td>
			<td>100 &#956;g penicillin/ml and 100 &#956;g streptomycin/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">Platinum wire loop</td>
			<td style="width:240px;">home-made</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:240px;">Zeitz-Instruments GmBH</td>
			<td style="width:136px;">DMZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hamilton syringe&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Hamilton</td>
			<td style="width:136px;">80300</td>
			<td>10 &#956;l, Type 701N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thick walled polytetrafluoroethylene tubing</td>
			<td style="width:240px;">Labmarket GmBH</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>1.0 mm OD&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">Paraffin oil</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">18512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">Nylon net, gauge 0.8 mm&#160;</td>
			<td style="width:240px;">ZBF Z&#252;richer Beuteltuchfabrik AG</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">Borosilicate glass tube&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Corning</td>
			<td style="width:136px;">99445-12</td>
			<td>PYREX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">Collagenase NB Standard Grade</td>
			<td style="width:240px;">SERVA</td>
			<td style="width:136px;">17454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor type I-S</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">T-9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">EGTA</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">E3389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">Glass capillary</td>
			<td style="width:240px;">Jencons (Scientific ) LTD.</td>
			<td style="width:136px;">H15/10</td>
			<td>1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillary</td>
			<td style="width:240px;">Harvard Apparatus Limited</td>
			<td style="width:136px;">30-0019</td>
			<td>1.0 OD X&#160; 0.58 ID X 100 Length mm (for microinjection)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillary&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Harvard Apparatus Limited</td>
			<td style="width:136px;">30-0044</td>
			<td>1.2 OD X 0.69 ID X 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">&#947;-Aminobutyric acid (GABA)</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">A2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">3&#945;,21-Dihydroxy-5&#945;-pregnan-20-one (THDOC)</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">P2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">grill motor</td>
			<td style="width:240px;">Faulhaber&#160;</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">micrometer screw</td>
			<td style="width:240px;">Kiener-Wittlin</td>
			<td style="width:136px;">10400</td>
			<td>TESA, AR 02.11201</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">Sterile plastic transfer pipettes</td>
			<td style="width:240px;">Saint-Amand&#160; Mfg.</td>
			<td style="width:136px;">222-20S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

xenopus oocytes: optimized methods for microinjection, removal of follicular cell layers, and fast solution changes in electrophysiological experiments

البويضة القيطم كنظام تعبير مغايرة للبروتينات، وصفت لأول مرة من قبل Gurdon وآخرون. 1، واستخدمت على نطاق واسع منذ اكتشافه (المراجع 2-3، والمراجع فيها). وهناك سمة أن يجعل البويضة جاذبية للتعبير قناة الخارجية هي وفرة الفقيرة من القنوات الأيونية الذاتية 4. وقد أثبت هذا النظام التعبير مفيد لتوصيف العديد من البروتينات، ومن بينها القنوات الأيونية بوابات يجند. يوصف التعبير عن GABA ومستقبلات في البويضات القيطم وتوصيف وظيفي من هنا، بما في ذلك عزل البويضات، إبر دقيقة جدا مع كرنا، وإزالة طبقات الخلايا الجرابية، والتغيرات حل سريع في التجارب الكهربية. تم تحسين الإجراءات في هذا المختبر 5،6 وتحيد عن تلك التي تستخدم بشكل روتيني 7-9. تقليديا، يتم إعداد البويضات الجرداءمع العلاج لفترات طويلة كولاجيناز من فصوص المبيض في RT، وهذه البويضات الجرداء وmicroinjected مع مرنا. باستخدام الطرق الأمثل، وقد أعرب عن بروتينات الغشاء متنوعة ودرس مع هذا النظام، مثل المؤتلف مستقبلات GABA و10-12، وقنوات كلوريد البشرية المؤتلفة 13، المثقبيات قنوات البوتاسيوم 14، ونقل ميو -inositol 15 و 16. يمكن تطبيق طرق مفصلة هنا للتعبير عن أي بروتين الاختيار في البويضات القيطم، والتغيير حل سريع يمكن استخدامها لدراسة قنوات الأيونات الأخرى بوابات يجند.

وقد خص البويضات القيطم ميكانيكيا خارج باستخدام حلقة البلاتين (الشكل 1). تم microinjected البويضات مع مرنا الترميز لGABA ومفارز مستقبلات ألفا 4 بيتا 2، δ، 0.5: 0.5: 2.5 fmol / البويضة (الشكل 2). بعد 4 د، وإزالة طبقات الخلايا الجرا?...

Watch this Scientific Journal Video about Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments at JoV

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.

القيطم البويضات: طرق الأمثل ل microinjection، إزالة طبقات الخلية مسامي، والتغييرات الحل السريع في التجارب الكهربية

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

xenopus-oocytes-optimized-methods-for-microinjection-removal

Research

JoVE Journal

Biology

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

20.0K Views.  University of Bern. Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented. 

Video: Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

نقل النووي في البويضات ماوس

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

التصحيح تسجيل المشبك من القنوات ايون معبرا عنه البويضات القيطم

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

طرق جزيء واحد لرصد التغيرات في خصائص طبقة ثنائية مطاطا

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection من البويضات المورق القيطم

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

تصور التعريب في الحمض النووي الريبي القيطم البويضات

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

تسميد البويضات القيطم باستخدام أسلوب نقل المضيف

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

تفعيل موت الخلايا المبرمج من قبل Microinjection هيولي من السيتوكروم ج</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

الأمثل أساليب النمذجة وتلوين لرصد انتشار استخدام الأصباغ انقسام الخلية خلية تتبع

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including by mechanical forces. Certain TRPV4 mutations cause complex hereditary bone or neuronal pathologies in human. Wild-type or mutant TRPV4 transgenes are commonly expressed in cultured mammalian cells and examined by Fura-2 fluorometry and by electrodes. In terms of the mechanism of mechanosensitivity and the molecular bases of the diseases, the current literature is confusing and controversial. To complement existing methods, we describe two additional methods to examine the molecular properties of TRPV4. (1) Rat TRPV4 and an aequorin transgene are transformed into budding yeast. A hypo-osmtic shock of the transformant population yields a luminometric signal due to the combination of aequorin with Ca2+, released through the TRPV4 channel. Here TRPV4 is isolated from its usual mammalian partner proteins and reveals its own mechanosensitivity. (2) cRNA of TRPV4 is injected into Xenopus oocytes. After a suitable period of incubation, the macroscopic TRPV4 current is examined with a two-electrode voltage clamp. The current rise upon removal of inert osmoticum from the oocyte bath is indicative of mechanosensitivity. The microAmpere (10-6 to 10-4 A) currents from oocytes are much larger than the subnano- to nanoAmpere (10-10 to 10-9 A) currents from cultured cells, yielding clearer quantifications and more confident assessments. Microscopic currents reflecting the activities of individual channel proteins can also be directly registered under a patch clamp, in on-cell or excised mode. The same oocyte provides multiple patch samples, allowing better data replication. Suctions applied to the patches can activate TRPV4 to directly assess mechanosensitivity. These methods should also be useful in the study of other types of TRP channels.

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

To complement commonly used methods to study TRPV4&#8217;s, two methods are described: Its mechanosensitivity can be studied by Ca2+-aequorin luminometry in transgenic yeast upon hypo-osmotic challenge. It can also be examined in TRPV4-RNA injected Xenopus oocytes by whole-cell two-electrode voltage clamp or patch clamp in on-cell or excised mode.

Luminometric الخميرة و<em&gt; القيطم</em&gt; سيت الكهربية الامتحانات من Mechanosensitivity الجزيئي للTRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including ...