Name: xenopus oocytes: optimized methods for microinjection, removal of follicular cell layers, and fast solution changes in electrophysiological experiments
Uploaded: 2016-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments at JoV

This work was supported by the Swiss National Science Foundation grant 315230_156929/1. M.C.M. is a recipient of a fellowship (Beca Chile Postdoctorado from CONICYT, Ministerio de Educacion, Chile).

وقد تمت الموافقة على التجارب على الحيوانات من قبل اللجنة المحلية لكانتون برن Kantonstierarzt، Kantonaler Veterinärdienst برن (BE85 / 15). 1. إعداد القيطم البويضات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الضفادع (القيطم المورق) على 12 ساعة / 12 ساعة ضوء / دورة الظلام في المياه التي يتم الاحتفاظ بدقة عند 20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة فصوص من المبيض من الضفادع الإناث 9. ملاحظة: إزالة الفصوص هي حافز للتجديد، وغالبا ما تكون نوعية البويضات يحسن مع الجراحة. وتغطي البويضة بواسطة طبقة المحي، وطبقة من خلايا بصيلات، والنسيج الضام التي تحتوي على الأوعية الدموية 21. ويطلق على هيكل كامل من &quot;جراب&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع فصوص من المبايض التي تعج المسام التي تحتوي على البويضات في العقيمة بارت المالحة 7 (MBS) تستكمل مع البنسلين والستربتومايسين (88 ملي كلوريد الصوديوم، 1 ملم بوكل، 2.4 ملم<html> NaHCO 3، 0.82 ملي MgSO 4، 0.41 ملي CaCl 2، 0.33 ملي كا (NO 3) 2، 10 ملم 4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic. HEPES (7.5 درجة الحموضة، هيدروكسيد الصوديوم)، و 100 ميكروغرام / مل البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واحد من مرحلة V-VI 21 بصيلات. عقد الفص المبيض مع ملقط. خفض حلقة البلاتين (الشكل 1) على بصيلات وسحب بلطف حلقة لعرقلة النسيج الضام التي تحتوي على بصيلات من أنسجة المبيض. ملاحظة: تتميز المرحلة V-VI 21 بصيلات عن حجمها (1،0-1،2 مم في القطر) وعلى النقيض جيدة بين نصف الكرة الحيوان مصطبغة داكنة ونصف الكرة نباتية صفراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل فقط بصيلات أبحث صحية (أي كروية تماما ومع تصبغ سليمة) إلى 35 مم طبق بيتري بواسطة ماصة باستير البلاستيك (قطع مرة أخرى إلى قطر افتتاح 1.5 ملم). </li></ol>&quot;jove_title&quot;&gt; 2. Microinjection من مرنا في السيتوبلازم ملاحظة: يتم اشتقاق نظام حقن مكروي الموصوفة هنا من ذلك الذي ذكرته Kressmann وBirnstiel 22. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد cRNAs من cDNAs منها الترميز لمفارز α β 4 2 δ GABA ومستقبلات بواسطة النسخ في المختبر، إضافة بولي (A +) الذيل، وتقدير الحمض النووي الريبي الكهربائي للهلام 23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الماصات حقن مكروي من الشعيرات الدموية البورسليكات الزجاج (1.0 ملم القطر الخارجي (OD)، 0.58 مم القطر الداخلي (ID)، و 100 ملم طول) باستخدام مجتذب micropipette. قطع نصائح من الزجاج الشعيرات الدموية تحت المجهر باستخدام micromanipulator وخييط لخلق قطرها غيض من 12-15 ميكرون مع طرف مشطوف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ردم ماصات حقن مكروي مع زيت البارافين باستخدام الحقنة 10 مل، ومن ثم تحميل ماصة حقن مكروي الصعود إلى ميكر homebuiltجهاز oinjection (الشكل 2). ملاحظة: يتكون جهاز حقن زيت هيدروليكي homebuilt من محرك شواء التي تسيطر عليها التبديل دواسة القدم. تبديل إضافي يتغير الوضع تحول من المحرك. هذا المحرك يقود المسمار ميكرومتر (0.5 ملم / بدوره) أن تتقدم أو تتراجع المكبس من حقنة زجاجية 10 ميكرولتر. والحقن بسرعة حوالي 3 دورة في الدقيقة و 0.5 بدوره يتوافق مع حقن NL 50 في المسام. يتم توصيل غيض من حقنة لأنابيب تترافلوروإيثيلين سميكة الجدران التي هي في حد ذاتها متصلة إبرة الحقن بواسطة قطعة قصيرة جدا من أنابيب Tygon. يقام الشعرية حقن بواسطة تشاك الحفر التي يسيطر عليها من قبل micromanipulator. شغل في النظام بأكمله مع زيت البارافين. وينبغي تجنب أي فقاعات الهواء، لأنها سوف تنال من نظام الحقن. يضيء الإعداد مع مصدر الضوء البارد. مطلوب مجهر تشريحي للسيطرة البصرية. وتصور بصيلات تحت الضوء البارد مع stereomicroscope (40X التكبير). يتم اختبار أداء الإعداد حقن عن طريق حقن التتبع المشعة في البويضات القيطم. وينبغي تسليم 55 NL في الحقن - وحدة تخزين من 45. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة مع طرف بلاستيكية معقمة، اختبار الإعداد عن طريق وضع قطرات من الماء المعقم على الداخل نظيفة من بالحرارة مقاومة للرطوبة (2 × 2 سم). تزج غيض من ماصة الحقن في هذه القطيرات، ثم قم بتشغيل المحرك لسحب المكبس (الضغط السلبي داخل ماصة الحقن). ملاحظة: يجب أن المياه تدخل ماصة وتشكيل واجهة مرئية مع النفط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التراجع غيض من ماصة من الحبرية وتطبيق الضغط الايجابي إلى داخل ماصة الحقن. ينبغي أن تشكل قطرة ماء في غيض من ماصة الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحضير للحقن المسام من بطانة لهم حتى مع القطبين النباتية مشيرا صعودا في الفجوات من شبكة من النايلون (G: 0.8 مم) لصقها على الجزء السفلي من بيطبق الثلاثية (60 ملم) مغطاة MBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء 2 ميكرولتر من مرنا باستخدام ماصة مع طرف بلاستيكية معقمة على الداخل نظيفة من بالحرارة. خذ مرنا حتى في ماصة حقن عن طريق الضغط السلبي إلى داخل ماصة الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع ماصة حقن أكثر من جراب الفردية باستخدام micromanipulator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج إبرة حقن في مركز القطب النباتي وحقن 50 NL مرنا بمعدل تدفق 0.6 ميكرولتر / دقيقة عن طريق الضغط الإيجابي إلى داخل ماصة. انتظر 5-10 الصورة قبل إزالة معلومات سرية حقن ماصة من جراب لتجنب مرنا الهروب. ملاحظة: يجب حقن مرنا في (مصفر) القطب النباتية لتجنب الحقن في النواة، والذي يقع في نصف الكرة الحيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بصيلات حقن إلى طبق بيتري جديد (35 ملم) مليئة 2 مل من MBS. وضع الطبق في برودة النبيذ وضعت في 18 درجة مئوية. احتضان بصيلات حقن 1 -7 أيام قبل التسجيل، اعتمادا على هوية البروتين المعبر عنه حديثا. </li></ol> 3. تجريد من المسام (الشكل 3) ملاحظة: كما هو مذكور أعلاه، البويضة بواسطة طبقة المحي، خلايا بصيلات، والنسيج الضام، والتي تحتوي على الأوعية الدموية 24 تغطيتها، كما هو معروف &quot;جراب&quot;. كل الطبقات باستثناء الطبقة المحي، الذي يوفر الاستقرار الميكانيكي دون منع وصول الحلول إلى سطح الخلية، ويجب إزالتها قبل التجارب الكهربية. وقد سبق أن وصفه المسام دون طبقات الخلايا المحيطة &quot;المعري&quot; البويضة 25. وعادة ما يتم تنفيذ هذه الخطوة على نفس يوم التجارب الكهربية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل عشرة حقن بصيلات إلى أنبوب البورسليكات الزجاج التي تحتوي على 0.5 مل من MBS، 1 ملغ / مل كولاجيناز، و 0.1 ملغ / مل مثبط التربسين. تزج الأنبوب في حمام مائي الحفاظ على 36 درجة مئوية. احتضانجراب لمدة 20 دقيقة ويهز الأنابيب في بعض الأحيان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف بصيلات بنقلهم إلى أنبوب الثاني يحتوي على 1 مل من MBS في RT. تركها في الأنبوب لمدة حوالي 10 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بصيلات إلى أنبوب ثالث يحتوي على 0.5 مل من MBS المركزة مضاعفة تحتوي على 4 ملي الإثيلين غليكول مكرر (2-aminoethylether) - N، N، N &#39;، N&#39;- حمض tetraacetic (EGTA)، واحتضان لهم لمدة 4 دقائق في RT. هز أنبوب في بعض الأحيان. ملاحظة: حل مفرط التوتر (MBS تتركز بشكل مضاعف) يستخدم للحث على انكماش البويضات داخل طبقات الخلايا المسام، وبالتالي فصل طبقات الخلايا الجرابية من البويضة. وأضاف EGTA لكبح النشاط كولاجيناز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف بصيلات بنقلهم إلى أنبوب الثاني يحتوي على 1 مل من MBS في RT. تركها في الأنبوب لمدة حوالي 10 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البويضات إلى طبق بتري (35 مم) التي تحتوي على 2 مل من MBS. تحت مجهر تشريحي، فصل المظاريف الخارجية من بصيلات بواسطةببساطة دفع البويضة المجردة بعيدا باستخدام حلقة البلاتين. ملاحظة: المغلفات الخارجية للالبويضات عصا بحزم إلى الطبق والثقافة، ويمكن فصلها بسهولة من البويضات. وبعض البويضات تفقد عفويا المظاريف الخاصة الخارجية وسيتم استردادها كما البويضات الجرداء. وقد أدى هذا الإجراء في إعداد مستقر نسبيا التي تحافظ على مظهر كروية من البويضات. </li></ol> 4. حل سريع التغيير في جميع أنحاء سيت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء المشبك التجربة الجهد، كما هو موضح 9،26. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير في حل نظام الارواء التي تغذيها الجاذبية من خلال تحويل مفاتيح نضح على النحو المطلوب من قبل التجربة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق حل نضح في 6 مل / دقيقة من خلال الزجاج الشعرية مع قطرها الداخلي 1.35 مم، والفم والتي يتم وضعها عن 0.4 مم من سطح البويضة، للسماح التغيرات السريعة في تركيز ناهض حول البويضة. وكان معدل التغير في السابق تقدير ملاحظة:د الى 70٪ في أقل من 0.5 ق 27. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Gurdon, J. B., Lane, C. D., Woodland, H. R., Marbaix, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+frog+eggs+and+oocytes+for+the+study+of+messenger+RNA+and+its+translation+in+living+cells.">Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells.</a> Nature. 233 (5316), 177-182 (1971).</li><li>Soreq, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthesis+of+biologically+active+proteins+in+mRNA-microinjected+Xenopus+oocytes.">The biosynthesis of biologically active proteins in mRNA-microinjected Xenopus oocytes.</a> CRC Crit Rev Biochem. 18 (3), 199-238 (1985).</li><li>Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Xenopus+oocytes+for+the+functional+expression+of+plasma+membrane+proteins.">Use of Xenopus oocytes for the functional expression of plasma membrane proteins.</a> J Membr Biol. 117 (3), 201-221 (1990).</li><li>Dascal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Xenopus+oocytes+for+the+study+of+ion+channels.">The use of Xenopus oocytes for the study of ion channels.</a> CRC Crit Rev Biochem. 22 (4), 317-387 (1987).</li><li>Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+single+sodium+channels+translated+by+Xenopus+oocytes+after+injection+with+messenger+ribonucleic+acid.">Properties of single sodium channels translated by Xenopus oocytes after injection with messenger ribonucleic acid.</a> J Physiol. 386, 73-90 (1987).</li><li>Sigel, E., Minier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+oocyte:+system+for+the+study+of+functional+expression+and+modulation+of+proteins.">The Xenopus oocyte: system for the study of functional expression and modulation of proteins.</a> Mol Nutr Food Res. 49 (3), 228-234 (2005).</li><li>Colman, A., Hames, B. D., Higgins, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+exogenous+DNA+in+Xenopus+oocytes.">Expression of exogenous DNA in Xenopus oocytes.</a> Transcription and Translation'A Practical Approach. , 49-69 (1984).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defolliculation+of+Xenopus+oocytes.">Defolliculation of Xenopus oocytes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (12), 1377-1379 (2010).</li><li>Smart, T. G., Krishek, B. J., Boulton, A. A., Baker, ., Wolfgang, W. a. l. z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+oocyte+microinjection+and+ion-channel+expression.">Xenopus oocyte microinjection and ion-channel expression.</a> Patch-Clamp Applications and Protocols. , 259-305 (1995).</li><li>Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+sites+involved+in+modulation+of+the+GABA+receptor+channel+by+the+intravenous+anesthetics+propofol,+etomidate+and+pentobarbital.">Functional sites involved in modulation of the GABA receptor channel by the intravenous anesthetics propofol, etomidate and pentobarbital.</a> Neuropharmacology. 105, 207-214 (2016).</li><li>Maldifassi, M. C., Baur, R., Pierce, D., Nourmahnad, A., Forman, S. A., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+positive+allosteric+modulators+of+GABAA+receptors+with+anesthetic+activity.">Novel positive allosteric modulators of GABAA receptors with anesthetic activity.</a> Sci Rep. 6, 25943 (2016).</li><li>Wongsamitkul, N., Baur, R., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+functional+properties+and+subunit+arrangement+of+&#945;4&#946;2&#948;+GABAA+receptors.">Towards understanding functional properties and subunit arrangement of &#945;4&#946;2&#948; GABAA receptors.</a> J Biol Chem. 291 (35), 18474-18483 (2016).</li><li>Burgunder, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chloride+channel+mutations+leading+to+mild+myotonia+among+Chinese.">Novel chloride channel mutations leading to mild myotonia among Chinese.</a> Neuromuscul Disord. 18 (8), 633-640 (2008).</li><li>Steinmann, M. E., Gonzalez-Salgado, A., Butikofer, P., Maser, P., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+heteromeric+potassium+channel+involved+in+the+modulation+of+the+plasma+membrane+potential+is+essential+for+the+survival+of+African+trypanosomes.">A heteromeric potassium channel involved in the modulation of the plasma membrane potential is essential for the survival of African trypanosomes.</a> FASEB J. 29 (8), 3228-3237 (2015).</li><li>Gonzalez-Salgado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=myo-Inositol+uptake+is+essential+for+bulk+inositol+phospholipid+but+not+glycosylphosphatidylinositol+synthesis+in+Trypanosoma+brucei.">myo-Inositol uptake is essential for bulk inositol phospholipid but not glycosylphosphatidylinositol synthesis in Trypanosoma brucei.</a> J Biol Chem. 287 (16), 13313-13323 (2012).</li><li>Gonzalez-Salgado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+brucei+Bloodstream+Forms+Depend+upon+Uptake+of+myo-Inositol+for+Golgi+Complex+Phosphatidylinositol+Synthesis+and+Normal+Cell+Growth.">Trypanosoma brucei Bloodstream Forms Depend upon Uptake of myo-Inositol for Golgi Complex Phosphatidylinositol Synthesis and Normal Cell Growth.</a> Eukaryot Cell. 14 (6), 616-624 (2015).</li><li>Wu, M., Gerhart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raising+Xenopus+in+the+laboratory.">Raising Xenopus in the laboratory.</a> Methods Cell Biol. 36, 3-18 (1991).</li><li>Gurdon, J. B., Wilt, F. H., Wessels, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+clawed+frogs.">American clawed frogs.</a> Methods in developmental biology. , 75-84 (1967).</li><li>Elsner, H. A., Honck, H. H., Willmann, F., Kreienkamp, H. J., Iglauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poor+quality+of+oocytes+from+Xenopus+laevis+used+in+laboratory+experiments:+prevention+by+use+of+antiseptic+surgical+technique+and+antibiotic+supplementation.">Poor quality of oocytes from Xenopus laevis used in laboratory experiments: prevention by use of antiseptic surgical technique and antibiotic supplementation.</a> Comp Med. 50 (2), 206-211 (2000).</li><li>Green, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+oogenesis+in+the+South+African+clawed+frog+(Xenopus+laevis).">Factors affecting oogenesis in the South African clawed frog (Xenopus laevis).</a> Comp Med. 52 (4), 307-312 (2002).</li><li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+in+Xenopus+laevis+(Daudin).+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals.">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J Morphol. 136 (2), 153-179 (1972).</li><li>Kressmann, A., Celis, J. E., Grassmann, A., Loyter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birnstiel+M.L.+Surrogate+genetics.">Birnstiel M.L. Surrogate genetics.</a> Transfer of Cell Constituents into Eucaryotic Cells. , 388-407 (1980).</li><li>Middendorp, S. J., Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+modulation+of+synaptic+and+extrasynaptic+GABAA+receptors+by+an+antagonist+of+the+high+affinity+benzodiazepine+binding+site.">Positive modulation of synaptic and extrasynaptic GABAA receptors by an antagonist of the high affinity benzodiazepine binding site.</a> Neuropharmacology. 95, 459-467 (2015).</li><li>Dumont, J. N., Brummett, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+in+Xenopus+laevis+(Daudin).+V.+Relationships+between+developing+oocytes+and+their+investing+follicular+tissues.">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). V. Relationships between developing oocytes and their investing follicular tissues.</a> J Morphol. 155 (1), 73-97 (1978).</li><li>Dascal, N., Landau, E. M., Lass, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+oocyte+resting+potential,+muscarinic+responses+and+the+role+of+calcium+and+guanosine+3',5'-cyclic+monophosphate.">Xenopus oocyte resting potential, muscarinic responses and the role of calcium and guanosine 3',5'-cyclic monophosphate.</a> J Physiol. 352, 551-574 (1984).</li><li>Buckingham, S. D., Pym, L., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocytes+as+an+expression+system+for+studying+receptor/channel+targets+of+drugs+and+pesticides.">Oocytes as an expression system for studying receptor/channel targets of drugs and pesticides.</a> Methods Mol Biol. 322, 331-345 (2006).</li><li>Sigel, E., Baur, R., Trube, G., M&#246;hler, H., Malherbe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+subunit+combination+of+rat+brain+GABAA+receptors+on+channel+function.">The effect of subunit combination of rat brain GABAA receptors on channel function.</a> Neuron. 5, 703-711 (1990).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

الطرق الموضحة في هذه المقالة تحيد عن تلك المستخدمة تقليديا 7-9. ذلك هو المعيار لفضح فصوص من المبيض إلى 1-2 ح العلاج كولاجيناز 8؛ عزل التالفة، البويضات الجرداء. وضخها مع مرنا باستخدام أجهزة حقن التجارية. هذا الإجراء الكلاسيكي لديه عيوب التالية: 1) من المرجح أن ?...

وتستخدم على نطاق واسع البويضات القيطم كنظام للتعبير (المراجع 2-3، والمراجع فيها). وهم قادرون على تجميع ودمج البروتينات multisubunit نشطة وظيفيا في أغشية البلازما الخاصة بهم بشكل صحيح. باستخدام هذا النظام، فمن الممكن للتحقيق وظيفيا بروتينات الغشاء وحدها أو بالاشتراك مع غيرها من البروتينات، لدراسة خصائص، خيالية، أو البروتينات متصلا تحور، ولفحص المخدرات المحتملة. وتشمل مزايا استخدام البويضات على الأنظمة التعبير مغاير غيرها من معالجة بسيطة من الخلايا العملاقة، ونسبة عالية من الخلايا معربا عن المعلومات الوراثية الأجنبية، وتحكم بسيطة من بيئة البويضة عن طريق نضح حمام، والسيطرة على غشاء المحتملة . عيب هذا النظام هو التعبير التفاوت الموسمي لوحظ في العديد من المختبرات 17-20. والسبب في هذا الاختلافأبعد ما يكون عن الوضوح. بالإضافة إلى ذلك، كثيرا ما لوحظ نوعية البويضات تختلف بشدة. وشملت الطرق التقليدية 7-9 عزلة فصوص المبيض، والتعرض للفصوص المبيض إلى كولاجيناز لبعض ساعة، واختيار من البويضات الجرداء، وحقن مكروي بويضة. هنا، وأفاد عدد من وإجراءات سريعة البديلة التي سمحت لنا للعمل مع هذا النظام التعبير لأكثر من 30 عاما مع عدم وجود التفاوت الموسمي واختلاف بسيط في نوعية البويضة. طرق تعديل وتحسين وصفها هنا لعزل البويضات، حقن مكروي مع كرنا، وإزالة طبقات الخلايا الجرابية يمكن أن تستخدم للتعبير عن أي بروتين من خيار في البويضة القيطم. ويمكن تطبيق طريقة بسيطة جدا لتغيرات حل سريع للوسط حول البويضة لدراسة أي القناة الايونية بوابات يجند وناقلات.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P-9541</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M-1880</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>223560</td><td></td></tr><tr><td>Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-148</td><td>100 &amp;mu;g penicillin/mL and 100 &amp;mu;g streptomycin/mL</td></tr><tr><td>Platinum wire loop</td><td>home-made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Zeitz-Instruments GmBH</td><td>DMZ</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe&amp;nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td>10 &amp;mu;L, Type 701N</td></tr><tr><td>Thick walled polytetrafluoroethylene tubing</td><td>Labmarket GmBH</td><td></td><td>1.0 mm OD&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Paraffin oil</td><td>Sigma</td><td>18512</td><td></td></tr><tr><td>Nylon net, G: 0.8 mm&amp;nbsp;</td><td>ZBF Z&amp;uuml;richer Beuteltuchfabrik AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass tube&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>99445-12</td><td>PYREX</td></tr><tr><td>Collagenase NB Standard Grade</td><td>SERVA</td><td>17454</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin inhibitor type I-S</td><td>Sigma</td><td>T-9003</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3389</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Jencons (Scientific ) LTD.</td><td>H15/10</td><td>1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0019</td><td>1.0 OD x&amp;nbsp; 0.58 ID x 100 Length mm (for microinjection)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0044</td><td>1.2 OD x 0.69 ID x 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp)</td></tr><tr><td>&amp;gamma;-Aminobutyric acid (GABA)</td><td>Sigma</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;alpha;,21-Dihydroxy-5&amp;alpha;-pregnan-20-one (THDOC)</td><td>Sigma</td><td>P2016</td><td></td></tr><tr><td>grill motor</td><td>Faulhaber&amp;nbsp;</td><td></td><td>DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2</td></tr><tr><td>micrometer screw</td><td>Kiener-Wittlin</td><td>10400</td><td>TESA, AR 02.11201</td></tr><tr><td>Sterile plastic transfer pipettes</td><td>Saint-Amand&amp;nbsp; Mfg.</td><td>222-20S</td><td></td></tr></tbody></table>

xenopus oocytes: optimized methods for microinjection, removal of follicular cell layers, and fast solution changes in electrophysiological experiments

البويضة القيطم كنظام تعبير مغايرة للبروتينات، وصفت لأول مرة من قبل Gurdon وآخرون. 1، واستخدمت على نطاق واسع منذ اكتشافه (المراجع 2-3، والمراجع فيها). وهناك سمة أن يجعل البويضة جاذبية للتعبير قناة الخارجية هي وفرة الفقيرة من القنوات الأيونية الذاتية 4. وقد أثبت هذا النظام التعبير مفيد لتوصيف العديد من البروتينات، ومن بينها القنوات الأيونية بوابات يجند. يوصف التعبير عن GABA ومستقبلات في البويضات القيطم وتوصيف وظيفي من هنا، بما في ذلك عزل البويضات، إبر دقيقة جدا مع كرنا، وإزالة طبقات الخلايا الجرابية، والتغيرات حل سريع في التجارب الكهربية. تم تحسين الإجراءات في هذا المختبر 5،6 وتحيد عن تلك التي تستخدم بشكل روتيني 7-9. تقليديا، يتم إعداد البويضات الجرداءمع العلاج لفترات طويلة كولاجيناز من فصوص المبيض في RT، وهذه البويضات الجرداء وmicroinjected مع مرنا. باستخدام الطرق الأمثل، وقد أعرب عن بروتينات الغشاء متنوعة ودرس مع هذا النظام، مثل المؤتلف مستقبلات GABA و10-12، وقنوات كلوريد البشرية المؤتلفة 13، المثقبيات قنوات البوتاسيوم 14، ونقل ميو -inositol 15 و 16. يمكن تطبيق طرق مفصلة هنا للتعبير عن أي بروتين الاختيار في البويضات القيطم، والتغيير حل سريع يمكن استخدامها لدراسة قنوات الأيونات الأخرى بوابات يجند.

وقد خص البويضات القيطم ميكانيكيا خارج باستخدام حلقة البلاتين (الشكل 1). تم microinjected البويضات مع مرنا الترميز لGABA ومفارز مستقبلات ألفا 4 بيتا 2، δ، 0.5: 0.5: 2.5 fmol / البويضة (الشكل 2). بعد 4 د، وإزالة طبقات الخلايا الجرا?...

Watch this Scientific Journal Video about Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments at JoV

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.

القيطم البويضات: طرق الأمثل ل microinjection، إزالة طبقات الخلية مسامي، والتغييرات الحل السريع في التجارب الكهربية

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

xenopus-oocytes-optimized-methods-for-microinjection-removal

Research

JoVE Journal

Biology

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

20.1K Views.  University of Bern. Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented. 

Video: Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

التلاعب و<em&gt; في المختبر</em&gt; نضوج<em&gt; القيطم المورق</em&gt; البويضات، تلاه سهم داخل الهيولى حقن الحيوانات المنوية، لدراسة التطور الجنيني

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Developmental Biology

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

باستخدام تحليل متحد البؤر من<em&gt; القيطم المورق</em&gt; بالتحقيق المغيرون من WNT وShh على محدثة التخلق التدرجات

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where real-time measurements of fluorescence and currents simultaneously report on local rearrangements and global function, respectively1. While high-resolution structural techniques such as cryo-electron microscopy or X-ray crystallography provide static images of the proteins of interest, VCF provides dynamic structural data that allows us to link the structural rearrangements (fluorescence) to dynamic functional data (electrophysiology). Until recently, the thiol-reactive chemistry used for site-directed fluorescent labeling of the proteins restricted the scope of the approach because all accessible cysteines, including endogenous ones, will be labeled. It was thus required to construct proteins free of endogenous cysteines. Labeling was also restricted to sites accessible from the extracellular side. This changed with the use of Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) to specifically incorporate a small fluorescent probe in response to stop codon suppression using an orthogonal tRNA and tRNA synthetase pair2. The VCF improvement only requires a two-step injection procedure of DNA injection (tRNA/synthetase pair) followed by RNA/fUAA co-injection. Now, labelling both intracellular and buried sites is possible, and the use of VCF has expanded significantly. The VCF technique thereby becomes attractive for studying a wide range of proteins and &#8211; more importantly &#8211; allows investigating numerous cytosolic regulatory mechanisms.

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

This article describes an enhancement of conventional Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) where Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) are used instead of maleimide dyes, to probe structural rearrangements in ion channels. The procedure includes Xenopus oocyte DNA injection, RNA/fUAA coinjection, and simultaneous current and fluorescence measurements.

الجهد المشبك فلوروميتري في<em&gt; القيطم</em&gt; البويضات باستخدام الفلورسنت الأحماض الأمينية غير طبيعية

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Biochemistry

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection من البويضات المورق القيطم

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

تصور التعريب في الحمض النووي الريبي القيطم البويضات

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

تسميد البويضات القيطم باستخدام أسلوب نقل المضيف

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

الماوس Microinjection سيت ، والنضج وتقييم الصيغة الصبغية

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal communication. Therefore, alterations in their abundance, function, and relationships with other synaptic elements have been observed as a major correlate of alterations in brain function and cognitive impairment in neurodegenerative diseases and mental disorders. Understanding how the function of excitatory and inhibitory synaptic receptors is altered by disease is of critical importance for the development of effective therapies. To gain disease-relevant information, it is important to record the electrical activity of neurotransmitter receptors that remain functional in the diseased human brain. So far this is the closest approach to assess pathological alterations in receptors' function. In this work, a methodology is presented to perform microtransplantation of synaptic membranes, which consists of reactivating synaptic membranes from snap frozen human brain tissue containing human receptors, by its injection and posterior fusion into the membrane of Xenopus laevis oocytes. The protocol also provides the methodological strategy to obtain consistent and reliable responses of &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) and &#947;-aminobutyric acid (GABA) receptors, as well as novel detailed methods that are used for normalization and rigorous data analysis.

The protocol demonstrates that by performing microtransplantation of synaptic membranes into Xenopus laevis oocytes, it is possible to record consistent and reliable responses of &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid and &#947;-aminobutyric acid receptors.

الزرع المجهري للأغشية المشبكية لإعادة تنشيط المستقبلات المشبكية البشرية للدراسات الوظيفية

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal ...

Neuroscience

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

القيطم المورق نموذجا لتحديد الترجمة انخفاض قيمة

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

القيطم البويضات: طرق الأمثل ل microinjection، إزالة طبقات الخلية مسامي، والتغييرات الحل السريع في التجارب الكهربية

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

التلاعب و

باستخدام تحليل متحد البؤر من

الجهد المشبك فلوروميتري في