وقد أجري هذا العمل في المختبر ريتشارد شولتز. فإن الكتاب أيضا أن نعترف مايكل لامبسون تصور مقايسة السنترومير العد والوصول إلى مجهر مبائر له. تيريزا تشيانغ ودنكان فرانشيسكا ساعدت في تحقيق الاستفادة المثلى من مقايسة السنترومير العد والفرز. معتمد من قبل HD022681 بولا شتاين (لRMS) ومعتمد من قبل HD055822 كارين شندلر.

1. بويضة فأرة جمع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لزيادة عدد بصيلات غاري معزولة عن بعضها الماوس ، intraperitoneally حقن الفئران الإناث ناضجة جنسيا (نستخدم 6 أسابيع من العمر CF - 1 الفئران من هارلان) مع 5 وحدة دولية من المصل جونادوتروبين فرس الحامل (PMSG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد جمع المتوسطة (MEM / PVP) (3 مل / الماوس) وذلك بإضافة إلى 2.5 ميكرومتر milrinone ودافئة أنه في 37 درجة مئوية. Milrinone هو المانع فسفودايستراز التي تحافظ على اعتقال الانتصافي مرة تتم إزالة البويضات من الحويصلات. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام - 3 - 1 - الاستيوفينون بالميثيل (IBMX) (0.2 مم) أو الأدينوزين الحلقي dibutyryl - الأدينوساين (dbcAMP) (100 ميكروغرام / مل). تحضير مستنبت بإضافة الجلوتامين (1 ملم) وmilrinone (2.5 ميكرومتر) إلى 1 مل من CZB والسماح لها للتوازن في الحاضنة لمدة ساعة على الأقل. إعداد microdrops كل في طبق بتري وتراكب مع الزيوت المعدنية. يوضع الطبق في حاضنة CZB بينما طبق MEM / PVP يبقى خارج على الشريحة الأكثر دفئا. وهناك أيضا مجموعة أخرى والمتوسطة الثقافة المتوفرة تجاريا (M2 و M16 من وسائل الاعلام المتخصصة أو سيجما) تستخدم بشكل روتيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حوالي 48 ساعة بعد PMSG فتيلة ، والتضحية الماوس باستخدام التخدير CO 2 تليها خلع عنق الرحم ، وتشريح المبيض ووضعها في watchglass تحتوي مسبقا تحسنت MEM / PVP + milrinone (MEM / PVP + M). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام حقنة الانسولين مل 1 ، مرساة المبيضين على الطبق والإفراج عن بصيلات غاري بواسطة ثقب لهم عدة مرات مع مقياس - 27 (أو الخياطة) الإبر التي يتم تثبيتها معا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما يبحث من خلال مجهر تشريح ، وجمع الركام ، باستخدام بويضة المجمعات التي تديرها الفم ماصة الزجاج. ومن المفيد أن يكون المجهر مع الكثير من التباين. بدلا من ذلك ، يمكن pipetted المتوسط ​​تحتوي على الأنسجة والخلايا على لغطاء طبق بيتري البلاستيك. جمع كبير فقط ، وليس بصيلات غاري أصغر قبل الجريبات الغارية أو البويضات الجرداء. جمعها مرة واحدة ، ونقل إلى أحد المجمعات microdrop من M + MEM / PVP موجود على الشريحة الأكثر دفئا وتحت النفط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة صغيرة (أكبر قليلا من قطر البويضة) ، ماصة صعودا وهبوطا في المجمعات لفصل الخلايا الركامية. نقل البويضات المعراة مع أكبر ماصة الى microdrop من CZB milrinone + (M + CZB) ووضعه في الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح البويضات لاسترداد ما لا يقل عن 1 ساعة في الحاضنة السابقة للتلاعب. </li></ol> 2. البويضة microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل ماصات حقن عن طريق سحب الزجاج البورسليكات الأنابيب الشعرية في مجتذب الميكانيكية. نستخدم يلهب براون micropipette مجتذب (النموذجي P - 97) مع الإعدادات التالية : P = 500 ، الحرارة = 300 ، سحب = 150 ، فيل = 100 ، الوقت = 150. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد النظام الأساسي microinjection عن طريق وضع قطرة 5 ميكرولتر من M + MEM / PVP أقرب وقت ممكن إلى انخفاض 0.5 ميكرولتر من المواد حقن الاختيار (مثل سيرنا ، كرنا ، morpholino قليل النوكليوتيد ، الخ) على شريحة الغرفة 1 - جيدا أن لديه غرفة وسائل الاعلام إزالتها. غلاف مع الزيوت المعدنية ومكان على المسرح المجهر (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن مكان وماصات عقد في وأصحاب الموقف في قطرة م + MEM / PVP بدوره على خزانات النتروجين التي ترتبط إلى picoinjector والجدول مضادة للاهتزاز. فتح غيض من ماصة الحقن بالضغط بلطف ضد ماصة في حين عقد ملئه مع المتوسط. إذا كانت الفتحة كبيرة جدا ، فإن متوسط ​​الدخول والخروج بسرعة والإبرة سوف تقتل الخلية. مع ماصات صغيرة جدا من الانفتاح في كثير من الأحيان تسد بسهولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البويضات (5-10) من الحاضنة إلى الانخفاض MEM / PVP M + على المنصة. قبل عن طريق الحقن ، والإعداد لpicoinjector. نحن نستخدم المعايير التالية على موقعنا picoinjector (النموذجي PLI - 100 جهاز من جامعة هارفارد) : PBal = 2،5-3،5 رطل ، PInj = 7.8 رطل ، 3S = = 10-12 رطل PClear والوقت. هذه النتائج في حجم حقن PL 5-10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما تضغط CLEAR ، حرك إبرة الحقن إلى انخفاض المواد والتعبئة. إعادتها إلى انخفاض المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدم ماصة عقد لالتقاط البويضة وحقن ابرة محاذاة ، البويضة وعقد ماصة على طول محور س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت التكبير العالي ودفع ماصة حقن البويضة من خلال الحرص على تجنب النواة. مرة واحدة اخترقت غشاء البلازما ، اضغط تحقنوا. بعد الحقن ، وسحب الإبرة. الافراج عن البويضة وتكرار. مرة واحدة يتم حقن جميع البويضات ، والعودة بهم إلى الحاضنة. عقد في CZB + M للمبلغ المطلوب من الزمن ، هذه المرة يتوقف على الهدف التجريبية (أي سيرنا وضربة قاضية morpholino (تصل إلى 24 ساعة) ، overexpression (12/03 ح)). يرجى ملاحظة أن حضانات أطول من 24 ساعة وسطا نضوج الانتصافي. </li></ol> 3. نضوج البويضة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل حضانة البويضات من خلال عدة قطرات من CZB (متوسطة النضج) ونقل إلى microdrop متوسطة النضج تحت النفطية ووضعه في الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 16 ساعة للسماح ر النضج الكامل<html> س الطورية الانقسام الاختزالي الثاني. </li></ol> 4. تحليل الصيغة الصبغية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد CZB + monastrol (100 ميكرون) ومكان 750 ميكروليتر إلى البئر من هيئة الثقافة الذي طبق الماء في المحيط الخارجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل البيض من خلال عدة قطرات من CZB + monastrol ونقلها إلى الجهاز طبق الثقافة. مكان في حاضنة للح 1 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح البيض بنقلهم الى watchglass بارافورمالدهيد تحتوي على 2 ٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل إلى أخرى watchglass مع حجب الحل. ويمكن تخزين هذا الطبق في 4 درجات مئوية حتى معالجتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل إلى حل permeabilization (PBS + 0.3 ٪ + TritonX BSA - 100 0.1 ٪ + 0.02 ٪ نان 3) في watchglass لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. شطف كميات كبيرة من خلال العديد من عرقلة الحل (PBS + 0.3 ٪ + 0.01 توين BSA - 20 + 0.02 ٪ نان 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تنفيذ بقية الإجراء على غطاء لوحة 96 - جيدا في غرفة ترطيب في درجة حرارة الغرفة والتي تكون محمية من الضوء. يتم وضع قطرات (~ 25 ميكرولتر) داخل الفتحات الدائرية. نقل البيض إلى عرقلة حل لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لcentromeres التسمية ، نقل البيض إلى قطرة من محلول يحتوي على حجب CREST المصل المضاد في 01:40. احتضان ما لا يقل عن 1 ساعة. تغسل من خلال 3 قطرات من محلول حظر تفرخ في كل 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البيض إلى قطرة من محلول يحتوي على حجب أو Cy5 اليكسا - 594 - ثر ، مترافق المضادة للمفتش الإنسان (1:200) ، واحتضان ل1H. تكرار الغسيل الخطوات المذكورة أعلاه ما عدا الخطوة الأخيرة ، وتشمل Sytox الأخضر (1:5،000) في عرقلة الحل للكشف عن الكروموزومات. جبل في 5 ميكرولتر من Vectashield. لمنع تكسير البيض ، وطرح 4 بقع صغيرة من الفازلين في زوايا حيث سيتم ساترة. ساترة وضع على رأس وختم بطلاء الأظافر. مخزن في مربع شريحة في 4 درجات مئوية حتى عبر تجهيز المجهري متحد البؤر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين التصوير مع هدف 100X ، والتقاط 0.4 ميكرومتر الخطوات في Z - الطائرة وصورة المنطقة برمتها من المغزل الطورية. العد centromeres باستخدام برنامج مثل التصوير J صورة (NIH). </li></ol> 5. ممثل النتائج : الرقم 2 هو الإسقاط Z - من البيض سوي الصيغة الصبغية. الطورية في صناعة المعلومات ، والبيض ، تحتوي الماوس سوي الصيغة الصبغية 20 زوجا من الصبغيات (الكروموسومات) وبالتالي centromeres 40. أحيانا تفشل الكروموسومات لنشر monastrol على الرغم من العلاج. هذا الوضع يجعل من الصعب إحصاء موثوق centromeres وبالتالي فإننا لا تشمل هذه البويضات في تحليلاتنا. أحيانا ، قد يكون تحديا لتحديد ما إذا كان CREST - مناعيا &quot;بقعة&quot; هو 1 أو 2 centromeres. استخدام برامج مثل J صورة مفيد لأن المرء لا يستطيع تحليل كل Z - القسم بينما تلاحظ بعناية التوجه للكروموسومات ، وعدد من المقاطع التي تم الكشف عن &quot;بقعة&quot; وكثافة بكسل &quot;النقاط&quot; لديك. تبعا حيث تم وضع المغزل الانتصافي النسبية للجسم القطبية ، يمكن للمناطق تداخل الحمض النووي ، وينبغي ألا تكون هذه العينات المدرجة في التحليل. Unmanipulated ، في بيض من الفئران الحية مبيض التناسل الشباب وانخفاض معدلات اختلال الصيغة الصبغية (~ 1-2 ٪). ومع ذلك ، يمكن لأسباب غير مفهومة ، microinjection والنضج في إجراءات زيادة هذا المختبر صعودا بنسبة 10 ٪. لذا ، فمن الأهمية بمكان أن يتم تضمين البويضات يحقن في أي دراسة microinjection. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. طبق Microinjection اقامة. شريحة الغرفة مع 5 قطرات ميكرولتر من MEM / PVP + M فقط فوق 0.5μl قطرات من محلول الحقن. مع تغطية الزيوت المعدنية. في هذا المثال هناك 3 قطرات لمدة 3 حقن الحلول المختلفة وشرائح يجلس على مرحلة المجهر. إلى اليسار هو إبرة microinjection والحق هو ماصة القابضة. علما بأن هناك انعكاس لأصحاب الإبرة. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. الصيغة الصبغية النتائج. A - Z إسقاط بيضة سوي الصيغة الصبغية الثاني الطورية. هو اللون الأخضر في الحمض النووي وkinetochores الملونة باللون الأحمر. الأسهم تشير إلى الأسلحة 2 الكروماتيدات متميزة مشيرا الى ان kinetochores (# # 17 و 18) التداخل. البيض يحتوي الماوس سوي الصيغة الصبغية 20 زوجا kinetochore (40 الإجمالي &quot;بقع&quot;). مختل الصيغة الصبغية وبيضة تحتوي على أي تغيير على هذا الرقم. إذا أجريت هذا الإجراء على البويضات MI الطورية ، سيكون هناك 40 زوجا kinetochore (80 الإجمالي &quot;بقع&quot;). <img src="/files/ftp_upload/2851/2851table1.jpg" alt="الجدول 1"/> الجدول 1. وصفة لجمع والمتوسطة microinjection (MEM / PVP + M). جميع المواد الجنين ، والرتبة ، والثقافة من سيغما الدريخ. التصفية من خلال مرشحات تعقيم PVDF 0.22μm (نستخدم Stericups Milipore) وتخزينها في 4 درجات مئوية. iles/ftp_upload/2851/2851table2.jpg &quot;بديل =&quot; الجدول 2 &quot;/&gt; الجدول 2. وصفة لCZB المتوسطة. جميع المواد الجنين ، والرتبة ، والثقافة من سيغما الدريخ. التصفية من خلال مرشحات تعقيم PVDF 0.22μm (نستخدم Stericups Milipore) وتخزينها في 4 درجات مئوية.

<ol>
	<li>Hunt, P. A., Hassold, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science. 296 (5576), 2181-2181 (2002).</li><li>Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hum Mol Genet. 16 Spec No. 2, R203-R203 (2007).</li><li>Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Journal of reproduction and fertility. 86 (2), 679-679 (1989).</li><li>Schultz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Oogenesis and the control of meiotic maturation. , (1986).</li><li>Moore, G. P., Lintern-Moore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biol Reprod. 18 (5), 865-865 (1978).</li><li>Hodges, C. A., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chromosoma. 111 (3), 165-165 (2002).</li><li>Schindler, K., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Cycle. 8 (7), 1090-1090 (2009).</li><li>Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 20 (17), 1522-1522 (2010).</li><li>Mayer, T. U., Kapoor, T. M., Haggarty, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science. 286 (5441), 971-971 (1999).</li><li>Stein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2009 (1), pdb prot5135-pdb prot5135 (2009).</li><li>Stein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2009 (1), pdb prot5132-pdb prot5132 (2009).</li><li>Reis, A., Chang, H. Y., Levasseur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Cell Biol. 8 (5), 539-539 (2006).</li><li>Schuh, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell. 130 (4), 484-484 (2007).</li><li>Backs, J., Stein, P., Backs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (1), 81-81 (2010).</li><li>Schindler, K., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biol Reprod. 80 (4), 795-795 (2009).</li><li>Kudo, N. R., Wassmann, K., Anger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell. 126 (1), 135-135 (2006).</li><li>Shoji, S., Yoshida, N., Amanai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The EMBO Journal. 25 (4), 834-834 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Microinjection من البويضات وسيلة قوية لدراسة الآليات التي تنظم نضوج الانتصافي 10،11 ، 12 ، 13. هذا الأسلوب يوفر وسيلة اقتصادية لاختبار الفرضيات قبل اتخاذ أي استثمار كبير في تطوير نماذج الماوس المعدلة وراثيا وهادفة. جمع البويضة وتقنيات microinjection تتطلب المزيد من الوقت لاتقان نموذجية من الإجراءات بيولوجيا الخلية. عقبات محددة في مجال جمع وغالبا ما تشمل السيطرة على ماصة الفم ، وسحب الزجاج ماصة الحجم المناسب لجمع وتجريد من الخلايا الجسدية ، وزيادة سرعة جمع لتقليل الوقت الذي يتم البويضات خارج الحاضنة. نوصي ممارسة عدة مرات قبل القيام بتجارب. نقل البويضات بين microdrops مع الحفاظ على نفس العدد من الخلايا هو وسيلة رائعة لتصبح مريحة مع هذا الأسلوب. موت الخلية يحدث عادة حين تعلم microinjection. يمكن أن يحدث هذا لعدد من الأسباب ، بما في ذلك ضخ كبيرة جدا من حجم المواد (أي فتح إبرة حقن كبيرة جدا) ، لتصل إلى النواة مع إبرة الحقن ، وثقب في الجانب الآخر من البويضة ، أو أن حقن مادة هي سامة بالنسبة للبويضة. مع ممارسة حقن العازلة في البويضات معدل حسابك حتى البقاء على قيد الحياة 50 ٪ على الأقل هو المفتاح لاتقان هذه التقنية. إذا فشل البويضات الناضجة فمن المحتمل أن لا تضعف milrinone بما فيه الكفاية. نوصي بدهن البويضات من خلال العديد من قطرات كبيرة milrinone خالية CZB قبل النضج. تحليل الصيغة الصبغية التالية microinjection هي واحدة من العديد من فحوصات لتقييم النضج الانتصافي. التحليلات الروتينية الأخرى التي نستخدمها في المختبر وتشمل رصد حركية التي تقدم من خلال الانقسام الاختزالي البويضات ، المناعي لتحليل تشكيل المغزل والمحاذاة كروموسوم وتفعيل البيض أو التخصيب في المختبر لتقييم الآثار التنموية للتلاعب البويضة 14،15 ، 16 ، 17.

جدول الكواشف محددة : <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم الكاشف </th><th> شركة </th><th> رقم كتالوج </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> Milrinone </td><td> سيغما الدريخ </td><td> M4659 </td><td> Resuspend في DMSO في 2.5mM </td></tr><tr><td> الزيوت المعدنية </td><td> سيغما الدريخ </td><td> M5310 </td><td> فقط استخدام الأجنة اختبار ، العقيمة ، التي تمت تصفيتها </td></tr><tr><td> CREST مصل ذاتي </td><td> Immunovision </td><td> HCT - 0100 </td><td></td></tr><tr><td> Sytox الخضراء </td><td> Invitrogen </td><td> 57020 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة الإنسان اليكسا 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A - 11014 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> ناقلات مختبرات </td><td> H - 100 </td><td></td></tr><tr><td> بارافورمالدهيد </td><td> Polysciences </td><td> 577773 </td><td></td></tr><tr><td> ألبومين المصل البقري من </td><td> سيغما الدريخ </td><td> A3294 </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> Monastrol </td><td> سيغما الدريخ </td><td> M8515 </td><td> Resuspend في DMSO في 100mM </td></tr><tr><td> توين - 20 </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 274348 </td><td></td></tr><tr><td> TritonX - 100 </td><td> سيغما الدريخ </td><td> X - 100 </td><td></td></tr></tbody></table> جدول معدات محددة : <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم المعدات </th><th> شركة </th><th> رقم كتالوج </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> الناطقة بلسان </td><td> Biodiseno </td><td> MP - 001 - Y </td><td></td></tr><tr><td> Watchglass </td><td> الإلكترون المجهر العلوم </td><td> 70543-30 </td><td></td></tr><tr><td> محقنة </td><td> دينار بحريني </td><td> 309623 </td><td> 1ml ، 27G 02/01 </td></tr><tr><td> 60 مم طبق بتري </td><td> صقر </td><td> 351007 </td><td></td></tr><tr><td> الزجاج باستور pipets </td><td> فيشر العلمية </td><td> 13-678-200 </td><td></td></tr><tr><td> الجانب الأكثر دفئا </td><td> فيشر العلمية </td><td></td><td> أي نموذج قياسي </td></tr><tr><td> تشريح المجهر </td><td></td><td></td><td> أي نموذج قياسي </td></tr><tr><td> غرفة الشرائح </td><td> نونك </td><td> 177372 </td><td></td></tr><tr><td> الأنابيب الشعرية </td><td> دروموند </td><td> 1-000-0500 </td><td> microcaps </td></tr><tr><td> ماصة بولير </td><td> المشتعلة براون micropipette مجتذب </td><td></td><td> نموذج P - 97 </td></tr><tr><td> مجهر مقلوب </td><td> نيكون </td><td></td><td> أي نموذج قياسي </td></tr><tr><td> Micromanipulators </td><td> إيبندورف </td><td></td><td> أي نموذج قياسي </td></tr><tr><td> Picoinjector </td><td> جهاز هارفارد </td><td> نموذج PLI - 100 </td><td> أي نموذج قياسي </td></tr><tr><td> CO 2 الدبابات </td><td></td><td></td><td> لحاضنة </td></tr><tr><td> خزان N2 </td><td></td><td></td><td> عن الطاولة وحاقن </td></tr><tr><td> مضادة للاهتزاز الطاولة </td><td> تقنية التصنيع </td><td></td><td> أي نموذج قياسي </td></tr><tr><td> حاضنة </td><td></td><td></td><td> أي نموذج قياسي </td></tr><tr><td> عقد ماصات </td><td> إيبندورف </td><td> 930001015 </td><td> Vacutip </td></tr><tr><td> مبائر المجهر </td><td> لايكا </td><td></td><td> أي نموذج قياسي </td></tr><tr><td> أدوات تشريح </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td></td><td> أي نموذج قياسي </td></tr><tr><td> ترطيب الغرفة </td><td></td><td></td><td> نستخدم تثبرور </td></tr><tr><td> غطاء من 96 لوحة جيدا </td><td> نونك </td><td> 263339 </td><td></td></tr><tr><td> المجهر الشرائح </td><td> فيشر العلمية </td><td> 12-544-3 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> توماس العلمية </td><td> 6663 - F10 </td><td> وسوف تختلف عن سماكة معينة المجاهر </td></tr><tr><td> مركز الثقافة الجهاز جيدا الطبق </td><td> فيشر العلمية </td><td> 353037 </td><td> 60 X 15mm </td></tr></tbody></table>

mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment

أخطاء في العزل الصبغي تؤدي إلى خلايا مختل الصيغة الصبغية. في الخلايا الجسمية ، ويرتبط مع سرطان ولكن عدم توازن الصبغيات في الأمشاج ، عدم توازن الصبغيات يؤدي الى الاجهاض والعقم أو اضطرابات النمو مثل متلازمة داون. الأمشاج فرداني النموذج من خلال أنواع محددة من البرامج الإنمائية التي تقترن إلى الانقسام الاختزالي. دوري الدرجة الاولى الانتصافي (MI) هي فريدة من نوعها لأن الانقسام الاختزالي تظل تعلق شقا الصبغي المتآخيان بينما يتم فصل الكروموزومات المتماثلة. لأسباب غير مفهومة تماما ، وهذا التقسيم هو reductional عرضة للأخطاء والأكثر شيوعا هو مصدر عدم توازن الصبغيات من الأخطاء في الانقسام الاختزالي الثاني (MII) أو من أخطاء في الانقسام الاختزالي 1،2 الذكور. في الثدييات ، في الطور الأول اعتقال البويضات من MI مع حويصلة كبيرة ، جرثومي سليمة (GV ؛ النواة) واستئناف الانقسام الاختزالي فقط عندما تتلقى إشارات التبويض. يستأنف الانقسام الاختزالي مرة واحدة ، البويضات MI الكامل والخضوع لانقسام الخلايا غير المتماثلة ، واعتقلت مرة أخرى في الطورية صناعة المعلومات. وسوف يتم إكمال MII البيض حتى يتم تخصيبها من قبل الحيوانات المنوية. البويضات يمكن أيضا أن يخضع نضوج الانتصافي باستخدام أنشئت في ظروف المختبر الثقافة 3. لأن جيل من المسوخ الماوس المعدلة وراثيا والجينات المستهدفة ، غير مكلفة ويمكن أن يستغرق فترات طويلة من الزمن ، والتلاعب في الأمشاج الإناث في المختبر هي استراتيجية أكثر اقتصادا وتوفير الوقت. هنا ، نحن تصف وسائل لعزل الطور الأول اعتقال البويضات من الفئران وmicroinjection. ويمكن إدخال أي مواد من خيار في البويضة ، ولكن لأن meiotically - المختصة البويضات صامتون transcriptionally كرنا 4،5 ، وليس الحمض النووي ، يجب أن يتم حقنه للدراسات التعبير خارج الرحم. لتقييم الصيغة الصبغية ، ونحن لدينا وصف الظروف في نضوج البويضات في المختبر من البيض MII. تاريخيا ، تستخدم كروموسوم نشر تقنيات لفرز عدد الكروموسوم 6. هذا الأسلوب يمثل تحديا تقنيا ويقتصر على تحديد hyperploidies فقط. هنا ، نحن تصف طريقة لتحديد قصور وhyperploidies باستخدام بويضات سليمة 7-8. يستخدم هذا الأسلوب monastrol ، مثبط kinesin - 5 ، أن تنهار المغزل المغزل القطبين إلى القطب 9 فصل الصبغيات (الكروموسومات) وبالتالي يمكن بسهولة أن مثل هذه kinetochores الفردية يتم الكشف عن وعدها باستخدام المصل المضاد للCREST الذاتية. لأن يتم تنفيذ هذه الطريقة في البيض على حالها ، لا تضيع الكروموسومات بسبب خطأ المشغل.

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment at JoVE.com

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

البويضات عرضة لعدم توازن الصبغيات بسبب أخطاء في العزل الصبغي خلال نضوج الانتصافي. البيض يمكن أن تسبب العقم مختل الصيغة الصبغية ، والإجهاض ، أو اضطرابات النمو مثل متلازمة داون. هنا ، نحن تصف طرق لإدخال المواد المختارة في البويضات وأساليب لدراسة وتقييم النضج الانتصافي الصيغة الصبغية.

الماوس Microinjection سيت ، والنضج وتقييم الصيغة الصبغية

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

mouse-oocyte-microinjection-maturation-and-ploidy-assessment

Research

JoVE Journal

Biology

29.6K Views.  University of Pennsylvania. البويضات عرضة لعدم توازن الصبغيات بسبب أخطاء في العزل الصبغي خلال نضوج الانتصافي. البيض يمكن أن تسبب العقم مختل الصيغة الصبغية ، والإجهاض ، أو اضطرابات النمو مثل متلازمة داون. هنا ، نحن تصف طرق لإدخال المواد المختارة في البويضات وأساليب لدراسة وتقييم النضج الان...

Video: Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinjection الجنين بعوض ألف الحصول على البعوض المعدلة وراثيا

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

في الجسم الحي التصوير والعلاجات العلاجية في الفأر نموذج مثلي من سرطان المبيض

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

جيل من الفئران المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for regulating gene transcription1. DNA methylation is an epigenetic modification that acts predominantly as a repressive mark. Through the covalent addition of a methyl group onto cytosines in CpG dinucleotides, it can recruit additional repressive proteins and histone modifications to initiate processes involved in condensing chromatin and silencing genes2. DNA methylation is essential for normal development as it plays a critical role in developmental programming, cell differentiation, repression of retroviral elements, X-chromosome inactivation and genomic imprinting.
One of the most powerful methods for DNA methylation analysis is bisulfite mutagenesis. Sodium bisulfite is a DNA mutagen that deaminates cytosines into uracils. Following PCR amplification and sequencing, these conversion events are detected as thymines. Methylated cytosines are protected from deamination and thus remain as cytosines, enabling identification of DNA methylation at the individual nucleotide level3. Development of the bisulfite mutagenesis assay has advanced from those originally reported4-6 towards ones that are more sensitive and reproducible7. One key advancement was embedding smaller amounts of DNA in an agarose bead, thereby protecting DNA from the harsh bisulfite treatment8. This enabled methylation analysis to be performed on pools of oocytes and blastocyst-stage embryos9. The most sophisticated bisulfite mutagenesis protocol to date is for individual blastocyst-stage embryos10. However, since blastocysts have on average 64 cells (containing 120-720 pg of genomic DNA), this method is not efficacious for methylation studies on individual oocytes or cleavage-stage embryos.
Taking clues from agarose embedding of minute DNA amounts including oocytes11, here we present a method whereby oocytes are directly embedded in an agarose and lysis solution bead immediately following retrieval and removal of the zona pellucida from the oocyte. This enables us to bypass the two main challenges of single oocyte bisulfite mutagenesis: protecting a minute amount of DNA from degradation, and subsequent loss during the numerous protocol steps. Importantly, as data are obtained from single oocytes, the issue of PCR bias within pools is eliminated. Furthermore, inadvertent cumulus cell contamination is detectable by this method since any sample with more than one methylation pattern may be excluded from analysis12. This protocol provides an improved method for successful and reproducible analyses of DNA methylation at the single-cell level and is ideally suited for individual oocytes as well as cleavage-stage embryos.

Bisulfite mutagenesis is the gold standard for analyzing DNA methylation. Our modified protocol allows for DNA methylation analysis at the single-cell level and was specifically designed for individual oocytes. It can also be used for cleavage-stage embryos.

وحيد الطفرات سيت بيسلفيت

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

في فيفو حقن مكروي و Electroporation ماوس الخصية

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

جيل المعدلة وراثيا<em&gt; حيدرة</em&gt; من جانب الأجنة حقن مكروي

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

تقييم المغزل الانتصافي في ماوس البويضات التي كتبها بوساطة سيرنا إسكات

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

تعيين بروتوكول لاستخدام الجينات إثراء التحليل لتحديد نموذج الحيوان المناسب للبحوث متعدية

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

حقن الخلية الداخلية عبر كتلة من الخلايا الجذعية الجنينية يؤدي إلى ارتفاع في أسعار تشيميريسم

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation of Cardiomyocytes from Fixed Hearts for Immunocytochemistry and Ploidy Analysis

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably identify nuclei of cardiomyocytes on histological sections, many groups rely on isolating viable cardiomyocytes prior to fixation to perform immunostaining. However, these live cardiomyocyte isolation techniques require optimization to maximize the yield, viability and quality of the samples, with inherent fluctuations from sample to sample despite maximum optimization. Here, we report a reproducible protocol, involving fixation prior to enzymatic digestion of the heart, which leads to maximum yield while preserving the in vivo morphology of individual cardiomyocytes. We further developed an automated analysis platform to determine the number of nuclei and DNA content per nucleus for individual cardiomyocytes. After exposing the chest cavity, the heart was arrested in diastole by perfusion with 60 mM KCl in PBS. Next, the heart was fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) solution, and then digested with 60 mg/mL collagenase solution. After digestions, cells were singularized by trituration, and the cardiomyocyte fraction was enriched via differential centrifugation. Isolated cardiomyocytes were stained for Troponin T and &#945;-actinin to assess purity of the obtained population. Furthermore, we developed an image analysis platform to determine cardiomyocyte nucleation and ploidy status following DAPI staining. Image based ploidy assessments led to consistent and reproducible results. Thus, with this protocol, it is possible to preserve native morphology of individual cardiomyocytes to allow immunocytochemistry and DNA content analysis while achieving maximum yield.

The goal of this work is to develop a method to reproducibly isolate cardiomyocytes from the adult heart and measure DNA content and nucleation.

عزل القلب من القلب الثابتة للكيمياء المناعية وتحليل بلودي

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably ...