This work was supported by the Swiss National Science Foundation grant 315230_156929/1. M.C.M. is a recipient of a fellowship (Beca Chile Postdoctorado from CONICYT, Ministerio de Educacion, Chile).

Tierversuche wurden vom lokalen Komitee des Kantons Bern Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinärdienst Bern (BE85 / 15) zugelassen. 1. Herstellung von Xenopus - Oozyten <ol><li> Pflegen Frösche (Xenopus laevis) auf einem 12 h / 12 h Hell / Dunkel - Zyklus in Wasser , das streng bei 20 ° C gehalten wird. </li><li> Entfernen Sie die Lappen der Ovarien von weiblichen Frösche 9. HINWEIS: Die Entfernung der Lappen ist ein Anreiz für die Regeneration und häufig die Qualität der Oozyten verbessert sich mit der Operation. Die Eizelle wird durch eine Dotterschicht, eine Schicht von Follikelzellen und Bindegewebe enthalten , die Blutgefäße 21 abgedeckt. Die gesamte Struktur ist die &quot;Follikel&quot; bezeichnet. </li><li> Legen Sie die Lappen der Ovarien , die dicht gepackt sind mit den Follikeln die Eizellen in sterilen Barth Saline 7 (MBS) , ergänzt mit Penicillin und Streptomycin (88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mMNaHCO 3, 0,82 mM MgSO 4, 0,41 mM CaCl 2, 0,33 mM Ca (NO 3) 2, 10 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure; HEPES (pH 7,5, NaOH), 100 ug / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin). </li><li> Einzel-out Stufe V-VI 21 Follikel. Halten Sie die Ovar Lappen mit einer Pinzette. Senken Sie die Platin - Schleife (Abbildung 1) über die Follikel und sanft die Schleife zurückziehen das Bindegewebe mit dem Follikel aus dem Eierstockgewebe zu zerstören. HINWEIS: Stufe V-VI 21 Follikel durch ihre Größe gekennzeichnet sind (1,0 bis 1,2 mm Durchmesser) und durch den guten Kontrast zwischen dem dunklen pigmentierten Tier Hemisphäre und der gelblichen pflanzlichen Hemisphäre. </li><li> Übertragen Sie nur gesund aussehende Follikel (dh perfekt sphärisch und mit intakten Pigmentierung) zu einem Durchmesser von 35 mm Petrischale mit Hilfe einer Plastik Pasteur - Pipette (schneiden Sie die zurück zu einem Öffnungsdurchmesser von 1,5 mm). </li></ol> Anmerkung: Die hier beschriebenen Mikroinjektionssystem von der durch Kressmann und Birnstiel 22 berichtet abgeleitet ist. <ol><li> Bereiten cRNAs von den entsprechenden cDNAs kodierend für die Untereinheiten der α 4 β 2 δ GABA A Rezeptor durch in vitro Transkription, die Zugabe eines Poly (A +) -Schwanz und RNA Quantifizierung durch Gelelektrophorese 23. </li><li> Bereiten Sie die Mikroinjektion Pipetten aus Borosilikatglas Kapillaren (1,0 mm Außendurchmesser (OD), 0,58 mm Innendurchmesser (ID), 100 mm Länge) mit einer Mikropipette Puller. Brechen Sie die Spitzen der Glaskapillaren unter einem Mikroskop mit einem Mikromanipulator und microfilament mit einem Spitzendurchmesser von 12 zu schaffen - 15 &amp; mgr; m mit einer abgeschrägten Spitze. </li><li> Verfüllen die Mikroinjektionspipette mit Paraffinöl mit einem 10-ml-Spritze und dann montieren Sie die Mikroinjektionspipette auf ein selbstgebautes microinjection Vorrichtung (Abbildung 2). HINWEIS: Die Selbstbau ölhydraulische Injektionsgerät besteht aus einem Grill Motor durch einen Fußschalter gesteuert. Ein zusätzlicher Schalter verändert den Drehbetrieb des Motors. Dieser Motor treibt eine Mikrometerschraube (0,5 mm / Umdrehung), die vor- oder zurückzieht, um den Kolben einer 10 &amp; mgr; l-Glasspritze. Die Injektion mit einer Geschwindigkeit von etwa 3 Upm und eine 0,5 wiederum entspricht einer 50 nL Injektion in einen Follikel. Die Spitze der Spritze verbunden ist dickwandig Polytetrafluorethylen Schlauch, der sich an der Injektionsnadel durch ein sehr kurzes Stück Tygon-Schlauch verbunden ist. Die Injektions Kapillare wird durch ein Bohrfutter gehalten, die von einem Mikromanipulator gesteuert wird. Das gesamte System wird mit Paraffinöl gefüllt. Luftblasen sollten vermieden werden, da sie das Injektionssystem beeinträchtigt. Die Einrichtung ist mit einer Kaltlichtquelle beleuchtet. Ein Stereomikroskop ist für die optische Kontrolle erforderlich. Follikeln unter kaltem Licht mit einer stereomicr sichtbar gemachtOscope (40-facher Vergrößerung). Leistung der Einspritzaufbau wird durch die Injektion von radioaktiven Tracers in Xenopus Oozyten getestet. Ein Volumen von 45 - 55 nL sollte pro Injektion geliefert werden. </li><li> Mit einer Pipette mit einem sterilen Kunststoffspitze, testen Sie die Konfiguration durch einen Tropfen steriles Wasser auf die saubere innerhalb eines feuchtigkeitsbeständigen thermoplastischen Platzierung (2 x 2 cm). Tauchen Sie die Spitze der Injektionspipette in diesem Tröpfchen, und dann den Motor drehen Sie den Kolben (Unterdruck im Inneren der Injektionspipette) zurückzuziehen. HINWEIS: Das Wasser sollte die Pipette eingeben und eine sichtbare Schnittstelle mit dem Öl bilden. </li><li> Ziehen Sie die Spitze der Pipette aus dem Tröpfchen und gelten Überdruck auf der Innenseite der Injektionspipette. Ein Wassertröpfchen sollte an der Spitze der Injektionspipette bilden. </li><li> Vorbereitung für das Einspritzen der Follikel, indem sie sich mit den pflanzlichen Pole nach oben zeigend in den Zwischenräumen ein Nylonnetz (G: 0,8 mm) geklebt Futter auf den Boden eines Petri Schale (60 mm) mit MBS abgedeckt. </li><li> Dispense 2 &amp; mgr; l der mRNA eine Pipette mit einer sterilen Plastikspitze auf die saubere innerhalb eines thermoplastischen verwenden. Nehmen Sie die mRNA nach oben in die Injektionspipette durch Unterdruck auf der Innenseite der Injektionspipette aufgebracht wird. </li><li> Positionieren Sie die Injektionspipette über einen einzelnen Follikel mit dem Mikromanipulator. </li><li> Legen Sie die Injektionsnadel in der Mitte des vegetativen Pol und injizieren 50 nL der mRNA bei einer Flussrate von 0,6 &amp; mgr; l / min durch Überdruck auf der Innenseite der Pipette angelegt wird. Warten von 5 bis 10 s vor der Injektion Pipettenspitze aus dem Follikel zu entfernen mRNA Flucht zu verhindern. HINWEIS: Die mRNA sollte in das pflanzliche (gelblich) Pol injiziert werden, die Injektion in den Nucleus zu vermeiden, die in der Tier Hemisphäre befindet. </li><li> Übertragen Sie die injizierten Follikel auf eine neue Petrischale (35 mm), gefüllt mit 2 ml MBS. Die Schale in einen Weinkühler auf 18 ° C eingestellt. Inkubieren der injizierten Follikel für 1 -7 d vor der Aufnahme in Abhängigkeit von der Identität des neu exprimierten Proteins. </li></ol> 3. Abisolieren der Follikel (Figur 3) HINWEIS: Wie oben erwähnt, ist die Eizelle von einem vitelline Schicht Follikelzellen bedeckt und Bindegewebe, die die Blutgefäße 24 enthält, ist bekannt als &quot;Follikel.&quot; Alle Schichten mit Ausnahme der Dotterschicht, die ohne verhindert den Zugang von Lösungen an die Zelloberfläche mechanische Stabilität bietet, muss vor elektrophysiologischen Experimenten entfernt werden. Der Follikel ohne die umgebenden Zellschichten hat zuvor eine &quot;entblößten&quot; Eizelle 25 bezeichnet worden. Dieser Schritt wird in der Regel am selben Tag wie die elektrophysiologischen Experimenten durchgeführt. <ol><li> Transfer zehn injiziert Follikel mit einem Rohr Borosilicatglas 0,5 ml MBS, 1 mg / ml Kollagenase und 0,1 mg / ml Trypsin-Inhibitor enthält. Eintauchen des Rohres in ein Wasserbad bei 36 ° C gehalten. inkubieren derFollikel für 20 Minuten und schütteln gelegentlich die Rohre. </li><li> Spülen Sie die Follikel, indem sie in ein zweites Röhrchen, das 1 ml MBS bei RT übertragen. Lassen Sie sie für etwa 10 s in die Röhre. </li><li> Übertragung der Follikel mit einem dritten Rohr mit 0,5 ml doppelt konzentrierter MBS , enthaltend 4 mM Ethylenglycol-bis (2-aminoethylether) - N, N, N &#39;, N&#39;- tetraessigsäure (EGTA), und inkubiere sie für 4 min bei RT. Das Röhrchen wird gelegentlich. HINWEIS: Die hypertonischen Lösung (doppelt konzentriert MBS) wird verwendet, innerhalb Follikel Zellschichten Schrumpfung der Eizellen zu induzieren, wodurch follikulären Zellschichten von der Eizelle löst; EGTA zugegeben Kollagenase-Aktivität zu hemmen. </li><li> Spülen Sie die Follikel, indem sie in ein zweites Röhrchen, das 1 ml MBS bei RT übertragen. Lassen Sie sie für etwa 10 s in die Röhre. </li><li> Übertragen Sie die Eizellen in eine Petrischale (35 mm Durchmesser), die 2 ml MBS. Unter einem Stereomikroskop, trennen Sie die äußeren Hüllen aus den Follikeln voneinfaches Drücken die nackte Eizelle entfernt die Platin-Schleife. HINWEIS: Die äußeren Einhüllenden der Oozyten fest an der Kulturschale haften und leicht aus den Oozyten getrennt werden können. Einige Eizellen spontan ihre äußeren Hüllen verlieren und als entblößte Eizellen gewonnen werden. Dieses Verfahren führt zu einer relativ stabilen Präparation, die die kugelförmige Erscheinung der Oozyten hält. </li></ol> 4. Schnelle Lösung Ändern Sie rund um die Oozyten <ol><li> Führen Sie eine Spannungsklemm Experiment, wie 9,26 beschrieben. </li><li> Ändern, um die Lösung der Schwerkraft gespeisten Perfusionssystem durch die Perfusion Schalter drehen, wie durch den Versuch benötigt. <ol><li> Gelten die Perfusionslösung bei 6 ml / min durch eine Glaskapillare mit einem Innendurchmesser von 1,35 mm, die Mündung davon platziert ist etwa 0,4 mm von der Oberfläche der Oozyte, schnelle Veränderungen der Agonistenkonzentration zu erlauben um die Eizelle. HINWEIS: Die Änderungsrate war vorher Schätzungd als 70% in weniger als 0,5 s 27. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Die Methoden , die in diesem Artikel beschriebenen abweichen von denen traditionell 7-9 verwendet. Es ist Standard , um die Lappen der Ovarien auf eine 1 bis 2 h Kollagenasebehandlung 8 zu exponieren; isolieren unbeschädigte, entblößte Eizellen; und injizieren sie mit mRNA kommerzielle Injektionsgeräte verwenden. Dieses klassische Verfahren hat die folgenden Nachteile: 1) Die Oozyten werden wahrscheinlich durch die lange Exposition gegenüber hohen Konzentrationen von Kollagenase beschädigt we...

Xenopus Oozyten werden als Expressionssystem (- 3 und den darin References 2) weit verbreitet. Sie sind in der Lage, richtig montieren und funktionell aktiven Multiunter Proteine ​​in ihre Plasmamembranen integrieren. Mit diesem System ist es möglich, Membranproteine ​​allein oder in Kombination mit anderen Proteinen funktionell zu untersuchen, um die Eigenschaften von mutierten, chimäre oder verketteten Proteine ​​zu studieren, und potentielle Arzneimittel zu screenen. Vorteile von Oozyten über andere heterologe Expressionssysteme umfassen die einfache Handhabung der Riesenzellen, die hohen Anteil an Zellen, die fremde genetische Information, die einfache Steuerung der Umgebung der Oocyte durch Bad-Perfusion, und die Kontrolle des Membranpotentials mit Hilfe . Der Nachteil dieses Expressionssystem ist die saisonalen Schwankungen in vielen Laboratorien , 17-20. Der Grund für diese Variationbei weitem nicht klar ist. Zusätzlich wird die Qualität der Oozyten oft stark zu variieren beobachtet. Traditionelle Methoden 7-9 haben die Isolierung von Ovar Keulen, die Exposition von Ovar Keulen zu Kollagenase für einige Stunden, um die Auswahl von entblößte Eizellen und die Eizelle Mikroinjektions enthalten. Hier wird eine Reihe von alternativen, schnellen Verfahren berichtet, dass erlaubt haben, uns mit diesem Expressionssystem arbeiten, um für mehr als 30 Jahren ohne saisonale Schwankungen und eine geringe Variation in Oozytenqualität. Die modifizierten und verbesserten Methoden , die hier für die Isolierung von Oozyten beschrieben, die Mikroinjektion mit cRNA und Entfernung von follikulären Zellschichten können für die Expression von jedem Protein der Wahl in der Xenopus Oozyten verwendet werden. Die sehr einfache Methode für die schnelle Lösung Änderungen des Mediums, um die Eizelle kann auf die Untersuchung von jeder ligandengesteuerten Ionenkanal und von Trägern aufgetragen werden.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P-9541</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M-1880</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>223560</td><td></td></tr><tr><td>Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-148</td><td>100 &amp;mu;g penicillin/mL and 100 &amp;mu;g streptomycin/mL</td></tr><tr><td>Platinum wire loop</td><td>home-made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Zeitz-Instruments GmBH</td><td>DMZ</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe&amp;nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td>10 &amp;mu;L, Type 701N</td></tr><tr><td>Thick walled polytetrafluoroethylene tubing</td><td>Labmarket GmBH</td><td></td><td>1.0 mm OD&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Paraffin oil</td><td>Sigma</td><td>18512</td><td></td></tr><tr><td>Nylon net, G: 0.8 mm&amp;nbsp;</td><td>ZBF Z&amp;uuml;richer Beuteltuchfabrik AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass tube&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>99445-12</td><td>PYREX</td></tr><tr><td>Collagenase NB Standard Grade</td><td>SERVA</td><td>17454</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin inhibitor type I-S</td><td>Sigma</td><td>T-9003</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3389</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Jencons (Scientific ) LTD.</td><td>H15/10</td><td>1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0019</td><td>1.0 OD x&amp;nbsp; 0.58 ID x 100 Length mm (for microinjection)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0044</td><td>1.2 OD x 0.69 ID x 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp)</td></tr><tr><td>&amp;gamma;-Aminobutyric acid (GABA)</td><td>Sigma</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;alpha;,21-Dihydroxy-5&amp;alpha;-pregnan-20-one (THDOC)</td><td>Sigma</td><td>P2016</td><td></td></tr><tr><td>grill motor</td><td>Faulhaber&amp;nbsp;</td><td></td><td>DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2</td></tr><tr><td>micrometer screw</td><td>Kiener-Wittlin</td><td>10400</td><td>TESA, AR 02.11201</td></tr><tr><td>Sterile plastic transfer pipettes</td><td>Saint-Amand&amp;nbsp; Mfg.</td><td>222-20S</td><td></td></tr></tbody></table>

xenopus oocytes: optimized methods for microinjection, removal of follicular cell layers, and fast solution changes in electrophysiological experiments

Die Xenopus Oozyten als heterologe Expressionssystem für Proteine, wurde zuerst von Gurdon et al. 1 und wurde seit seiner Entdeckung weit verbreitet (Referenzen 2 - 3 und Referenzen darin). Ein Merkmal, das die Eizelle attraktiv für ausländische -Kanalexpression macht , ist die schlechte Fülle von endogenen Ionenkanäle 4. Dieses Expressionssystem hat sich als nützlich für die Charakterisierung vieler Proteine ​​erwiesen, darunter Liganden-gesteuerte Ionenkanäle. Die Expression von GABA - A - Rezeptoren in Xenopus - Oozyten und ihre funktionelle Charakterisierung wird hier beschrieben, einschließlich der Isolierung von Oozyten, Mikroinjektionen mit cRNA, die Entfernung von follikulären Zellschichten und eine schnelle Lösung Veränderungen in elektrophysiologischen Experimenten. Die Verfahren wurden in diesem Labor 5,6 optimiert und weichen von den routinemäßig verwendeten 7-9 diejenigen. Traditionell werden entblößte Eizellen vorbereitetmit einer verlängerten Kollagenase Behandlung von Ovar Keulen bei RT und diese entblößte Oozyten werden mit mRNA mikroinjiziert. Verwendung der optimierten Methoden, diverse Membranproteine wurden mit diesem System exprimiert und untersucht, wie rekombinante GABA A -Rezeptoren 10-12, humanem rekombinantem Chloridkanäle 13, Trypanosom Kaliumkanäle 14 und eine myo - Inositol - Transporter 15, 16. Die Methoden , die hier beschrieben werden , können zur Expression jedes Proteins der Wahl in Xenopus Oozyten angewendet werden, und die schnelle Lösung Änderung verwendet werden kann andere Liganden-gesteuerte Ionenkanäle zu untersuchen.

Xenopus - Oozyten wurden mit einer Platinöse mechanisch herausgehoben (Figur 1). 0,5: 2,5 fmol / Oocyte (Abbildung 2) Die Oozyten wurden mit mRNA kodierend für den GABA A -Rezeptor - Untereinheiten &amp; agr; 4 &amp; bgr; 2, δ, 0,5 mikroinjiziert. Nach 4 d wurden follicular Zellschichten entfernt werden (Abbildung 3). Oocyten wurden Spannung bei -80 mV eingespannt und ausgesetzt steigenden Kon...

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Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.

Xenopus Oozyten: Optimierte Methoden für die Mikroinjektion, Entfernen von Follicular Zellschichten und schnelle Lösung Änderungen in elektrophysiologischen Experimenten

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

20.1K Aufrufe.  University of Bern. Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented. 

Serie: Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

Manipulation und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ausbau der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eizellen, von Intrazytoplasmatische Spermieninjektion gefolgt, um embryonale Entwicklungsstudie

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Mittels konfokaler Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Um Modulatoren der Wnt und Shh Morphogen Gradienten Untersuchen

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where real-time measurements of fluorescence and currents simultaneously report on local rearrangements and global function, respectively1. While high-resolution structural techniques such as cryo-electron microscopy or X-ray crystallography provide static images of the proteins of interest, VCF provides dynamic structural data that allows us to link the structural rearrangements (fluorescence) to dynamic functional data (electrophysiology). Until recently, the thiol-reactive chemistry used for site-directed fluorescent labeling of the proteins restricted the scope of the approach because all accessible cysteines, including endogenous ones, will be labeled. It was thus required to construct proteins free of endogenous cysteines. Labeling was also restricted to sites accessible from the extracellular side. This changed with the use of Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) to specifically incorporate a small fluorescent probe in response to stop codon suppression using an orthogonal tRNA and tRNA synthetase pair2. The VCF improvement only requires a two-step injection procedure of DNA injection (tRNA/synthetase pair) followed by RNA/fUAA co-injection. Now, labelling both intracellular and buried sites is possible, and the use of VCF has expanded significantly. The VCF technique thereby becomes attractive for studying a wide range of proteins and &#8211; more importantly &#8211; allows investigating numerous cytosolic regulatory mechanisms.

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

This article describes an enhancement of conventional Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) where Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) are used instead of maleimide dyes, to probe structural rearrangements in ion channels. The procedure includes Xenopus oocyte DNA injection, RNA/fUAA coinjection, and simultaneous current and fluorescence measurements.

Spannklemme Fluorometrie in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oozyten mit fluoreszierenden unnatürlichen Aminosäuren

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Biochemie

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Functional Cloning Mit ein<em&gt; Xenopus</em&gt; Eizellen Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Biologie

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oozyten

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

Die Befruchtung der Xenopus Oozyten Über den Host-Transfer-Methode

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal communication. Therefore, alterations in their abundance, function, and relationships with other synaptic elements have been observed as a major correlate of alterations in brain function and cognitive impairment in neurodegenerative diseases and mental disorders. Understanding how the function of excitatory and inhibitory synaptic receptors is altered by disease is of critical importance for the development of effective therapies. To gain disease-relevant information, it is important to record the electrical activity of neurotransmitter receptors that remain functional in the diseased human brain. So far this is the closest approach to assess pathological alterations in receptors' function. In this work, a methodology is presented to perform microtransplantation of synaptic membranes, which consists of reactivating synaptic membranes from snap frozen human brain tissue containing human receptors, by its injection and posterior fusion into the membrane of Xenopus laevis oocytes. The protocol also provides the methodological strategy to obtain consistent and reliable responses of &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) and &#947;-aminobutyric acid (GABA) receptors, as well as novel detailed methods that are used for normalization and rigorous data analysis.

The protocol demonstrates that by performing microtransplantation of synaptic membranes into Xenopus laevis oocytes, it is possible to record consistent and reliable responses of &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid and &#947;-aminobutyric acid receptors.

Mikrotransplantation synaptischer Membranen zur Reaktivierung humaner synaptischer Rezeptoren für funktionelle Studien

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal ...

Neurowissenschaften

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis als Modell zur Übersetzung Impairment Identifizieren

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Xenopus Oozyten: Optimierte Methoden für die Mikroinjektion, Entfernen von Follicular Zellschichten und schnelle Lösung Änderungen in elektrophysiologischen Experimenten

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Manipulation und

Mittels konfokaler Analyse

Spannklemme Fluorometrie in

Functional Cloning Mit ein