نحن نعرب عن امتناننا للأطفال والأسر دراسة الأتراب كوبساك2010 لجميع الدعم والالتزام. نحن نعترف ونقدر جهود فريق البحث كوبساك ومساعدة تقنية من فني ليزبيث بووس روشولم، "جامعة الدنمارك التقنية"، لقياس السيتوكينات والمستقطبات فريدة من نوعها.

الدراسات التي أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية "إعلان هلسنكي". وتم الحصول على الموافقات من "لجنة الأخلاقيات" كوبنهاغن (KF 01-289/96 كوبساك2000 ) وحاء-ب-2008-093 كوبساك2010والوكالة الدانمركية لحماية البيانات، وتم الحصول على الموافقة الخطية من كلا الوالدين لكل موضوع قبل التسجيل.
1-الإعداد التجريبية
<ol>
	<li>استخدام أوراق التصفية (ألياف البوليستر الهيدروكسيلية أوراق، انظر الجدول للمواد)6،7.<ol>
		<li>قطع شرائح 3 × 15 ملم في الحجم لطفلة تبلغ من العمر 1 شهر وفي شكل L للأطفال الأكبر سنا والبالغين (5 × 20 × 10 مم (الذراع القصير للأم)).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>إدراج قطعة واحدة من ورق الترشيح في كل منخر الرضيع باستخدام الملقط. ضع ورق الترشيح في الجزء الأمامي من أدنى توربيناتي (حوالي 1 سم داخل الآنف الولدان و 1.5 سم لجميع الإعمار الأخرى).<ol>
		<li>ضع الولدان على سرير وإعطائهم الماء والسكر للراحة. ملاحظة: للأطفال من جميع الإعمار الأخرى، أخذ العينات يتم بسهولة مع هذا الموضوع جالساً على كرسي.</li>
		<li>للأطفال الأكبر سنا، إدراج الذراع الطويلة للورقة على شكل L عامل التصفية في كل منخر.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>تطبيق قصاصة آنف حول الخياشيم لتقليل عدم الراحة وتجنب فقدانها ورقة تصفية.</li>
	<li>إزالة أوراق التصفية بعد 2 دقيقة من الاستيعاب.</li>
	<li>وضع ورقات عامل التصفية في الأنابيب المسماة وتجميدها فورا في-80 درجة مئوية.</li>
	<li>دون ملاحظة عن أي من أعراض التهاب مجرى الهواء يبديه الطفل اليوم لأخذ العينات.</li>
	<li>تسجيل أي العطس، البكاء المستمر، أو رعاف يحدث خلال 2 دقيقة لأخذ العينات.</li>
</ol>
2-التحديد الكمي للمناعة-وسطاء الشحن الجوي
<ol>
	<li>أخذ عينات عشوائية تصل إلى 10 من الثلاجة. تسجيل أرقام تحديد الهوية. تبقى العينات على الجليد خلال كامل عملية العامل.</li>
	<li>بعد ذوبان الجليد على الجليد، تزج أوراق التصفية (لكل موضوع) من كلا الخياشيم في 300 ميليلتر من الطازجة المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد) التي تحتوي على مبطلات كاملة المانع قرص واحد (انظر الجدول للمواد) كل 25 مل من المخزن المؤقت.<ol>
		<li>ضبط حجم المخزن المؤقت وفقا لحجم الورق عامل التصفية.<ol>
			<li>استخدام 300 ميليلتر من المخزن المؤقت لتصفية ورقات 3 × 15 ملم في الحجم.</li>
			<li>إذا كان فقط واحد تصفية الورق المتوفرة، استخدم نصف حجم المخزن المؤقت (150 ميليلتر).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>نقل العينات لوحة شاكر (400 لفة في الدقيقة) لأدنى 5 استخدام جهاز ضبط وقت.</li>
	<li>نقل رطبة تصفية الأوراق والمقايسة المخزن المؤقت في كأس وعامل تصفية أنبوب خلات السليولوز (حجم المسام ميكرومتر 0.22) توضع داخل ميكروسينتريفوجي الأنبوبة (انظر الجدول للمواد).</li>
	<li>الطرد المركزي في 16,000 س ز لمدة 5 دقائق في أجهزة الطرد مركزي تبريد (عند 4 درجة مئوية) للحصول على استخراج الآنف التي تمت تصفيتها في الأنبوب.</li>
	<li>إزالة الكأس وإبقاء الأنابيب على الجليد بينما اليقوتينج استخراج الآنف في آبار ألواح التخزين ملزمة البروتين المنخفض (انظر الجدول للمواد).</li>
	<li>تخزين في-80 درجة مئوية حتى التحليل.</li>
	<li>تحديد تركيزات السيتوكينات والمستقطبات في المقتطفات الآنف باستخدام نظام صفيف متعدد عالية الحساسية، على أساس اليكتروتشيميلومينيسسي (انظر الجدول للمواد). ملاحظة: التحليل سيتوكين 2 1/تيحتيحالبشرية 10-من نوع plex، 9-من نوع plex chemokine المقايسة، وواحد-من نوع plex إيل-17A، TGF-β1، وتسلب أجريت هنا.<ol>
		<li>لفحوصات، احتضان مقتطفات الآنف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. إجراء القياسات كما الواحد الصانع القياسية البروتوكول (انظر الجدول للمواد). ملاحظة: تحديدكم (انظر الجدول للمواد) وعادة ما يكون مجموعة ديناميكية عالية لقياس تتراوح ما بين 1 &#38; 10,000 بيكوغرام/مل، ولكن يمكن لبعض فحوصات، 100,000 بيكوغرام/مل. وهذا يعني أن جميع العينات التي يمكن تشغيلها في إضعاف نفسه، مما يحد من تأثير تخفيف متباينة في مواضيع صحية والمريضة، كما الحال في سائر تحديدكم مماثلة. وكان الحد الأدنى للكشف عن جميع السيتوكينات 1 بيكوغرام/مل أو أقل، والمستقطبات، تراوحت بين 1 &#38; 50 بيكوغرام/مل. تسلب لم يكن يمكن اكتشافها في 98 في المائة عينات خلال شهر واحد من العمر.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3-الإحصاءات
<ol>
	<li>سجل تحويل البيانات قبل تحليلها للحصول على البواقي توزع عادة على المستويين سيتوكين وتشيموكيني.</li>
	<li>إذا كان يتم تحليل العينات في دفعة واحدة أو أكثر، تصحيح بيانات سيتوكين وتشيموكيني باتشويسي تتمحور حول تحويل سجل البيانات.<ol>
		<li>إدراج يعني عموما وتحويل سجل المضادة للحصول على البيانات في وحدات القياس الأصلي. ملاحظة: لكل مجموعة من التحليلات التي فعلت، النظر في تعديل المتغيرات التي تؤثر في مستوى السيتوكينات والمستقطبات. وهذا يمكن أن تكون الأمهات التأثيرات (مثل تعاطي الكحول والتدخين أثناء الحمل)، والرضاعة الطبيعية، والآثار الضائرة أثناء أخذ العينات، الأخوة والأخوات، والحيوانات الأليفة في المنزل، إلخ</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bousquet, J., van Cauwenberge, P., Khaltaev, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergic+Rhinitis+and+Its+Impact+on+Asthma.">Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma.</a> J Allergy Clin Immunol. 108 (5), 147-334 (2001).</li><li>Howarth, P. H., Persson, C. G. A., Meltzer, E. O., Jacobson, M. R., Durham, S. R., Silkoff, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+monitoring+of+nasal+airway+inflammation+in+rhinitis.">Objective monitoring of nasal airway inflammation in rhinitis.</a> J Allergy Clin Immunol. 115 (3), 414-441 (2005).</li><li>Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cytokines+in+nasal+secretions+after+nasal+antigen+challenge:+lack+of+influence+of+antihistamines.">Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines.</a> Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).</li><li>Sussman, G. L., Mason, J., Compton, D., Stewart, J., Ricard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+and+safety+of+fexofenadine+HCl+and+pseudoephedrine,+alone+and+in+combination,+in+seasonal+allergic+rhinitis.">The efficacy and safety of fexofenadine HCl and pseudoephedrine, alone and in combination, in seasonal allergic rhinitis.</a> J Allergy Clin Immunol. 104 (1), 100-106 (1999).</li><li>Bisgaard, H., Robinson, C., R&#248;meling, F., Mygind, N., Church, M., Holgate, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukotriene+C4+and+histamine+in+early+allergic+reaction+in+the+nose.">Leukotriene C4 and histamine in early allergic reaction in the nose.</a> Allergy. 43 (3), 219-227 (1988).</li><li>Chawes, B. L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+assessing+unchallenged+levels+of+mediators+in+nasal+epithelial+lining+fluid.">A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid.</a> J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).</li><li>F&#0248;lsgaard, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+bacteria+colonizing+the+airways+in+asymptomatic+neonates+stimulates+topical+inflammatory+mediator+release.">Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release.</a> Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).</li><li>F&#0248;lsgaard, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Cytokine+Profile+in+the+Airway+Mucosal+Lining+Fluid+Is+Skewed+by+Maternal+Atopy.">Neonatal Cytokine Profile in the Airway Mucosal Lining Fluid Is Skewed by Maternal Atopy.</a> Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).</li><li>Chawes, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Vitamin+D3+Supplementation+During+Pregnancy+on+Risk+of+Persistent+Wheeze+in+the+Offspring:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Effect of Vitamin D3 Supplementation During Pregnancy on Risk of Persistent Wheeze in the Offspring: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA. 315 (4), 353-361 (2016).</li><li>Bischoff, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Response+to+A(H1N1)pnd09+Vaccination+in+Pregnant+Women:+A+Single+Blinded+Randomized+Controlled+Trial.">Altered Response to A(H1N1)pnd09 Vaccination in Pregnant Women: A Single Blinded Randomized Controlled Trial.</a> PloS One. 8 (4), 56700 (2013).</li><li>Wolsk, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picornavirus-Induced+Airway+Mucosa+Immune+Profile+in+Asymptomatic+Neonates.">Picornavirus-Induced Airway Mucosa Immune Profile in Asymptomatic Neonates.</a> J Infect Dis. 213 (8), 1262-1270 (2016).</li><li>Wolsk, H. M., Chawes, B. L., F&#248;lsgaard, N. V., Rasmussen, M. A., Brix, S., Bisgaard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siblings+Promote+a+Type+1/Type+17-oriented+immune+response+in+the+airways+of+asymptomatic+neonates.">Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates.</a> Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).</li><li>Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+technique+for+recovery+of+cytokines+from+inflammatory+sites+in+situ.">Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ.</a> J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).</li><li>Ishizaka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+bronchoscopic+microsample+probe+to+measure+the+biochemical+constituents+in+epithelial+lining+fluid+of+patients+with+acute+respiratory+distress+syndrome.">New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome.</a> Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).</li><li>Ishizaka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevation+of+KL-6,+a+lung+epithelial+cell+marker,+in+plasma+and+epithelial+lining+fluid+in+acute+respiratory+distress+syndrome.">Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), 1088-1094 (2004).</li><li>Nakano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-1+level+in+epithelial+lining+fluid+of+patients+with+acute+respiratory+distress+syndrome.">Endothelin-1 level in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome.</a> Respirology. 12 (5), 740-743 (2007).</li><li>Komaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-mediated+xanthine+oxidase+upregulation+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease's+airways.">Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease's airways.</a> Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).</li><li>Moeller, A., Franklin, P., Hall, G. L., Horak, F., Wildhaber, J. H., Stick, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+exhaled+breath+condensates+in+infants.">Measuring exhaled breath condensates in infants.</a> Pediatr Pulmonol. 41 (2), 184-187 (2006).</li></ol>

أن تعلن جميع المؤلفين أي تعارض المتصورة أو محتملاً أو حقيقيا في المصالح فيما يتعلق بمحتوى هذه المخطوطة. وكالات التمويل لم يكن أي دور في تصميم وإجراء الدراسة؛ جمع، وإدارة، وتفسير البيانات؛ أو إعداد ومراجعة والموافقة على المخطوطة. لا توجد شركة صيدلانية متورط في الدراسة.

مع تقنية المعروضة هنا، كنا قادرين على تحديد في فيفو مجرى الهواء العلوي المخاطية المناعي التشكيل الجانبي في الأطفال من أقرب شهر واحد من العمر، والتي لم يتم مسبقاً. ولاحظنا أن وجود البكتيريا مجرى الهواء محددة وبيكورنافيروسيس7،11، فضلا عن أخرى من قبل والت...

يجعل السائل البطانة المخاطية للأنف حتى الجزء السائل من النظام مجرى الهواء العلوي. وهو يتألف من مصفوفة معقدة من الوسطاء المستمدة من التفاعل بين ظهارة والخلايا المناعية التي تشكل الخط الأول للدفاع ضد غزو الكائنات الحية الدقيقة. الغشاء المخاطي للأنف يتم الوصول إليها بسهولة، وهناك علاقة وظيفية ومناعية قوية بين الآنف و القصبات الهوائية1. هذه المقصورة باهتمام خاص فيما يتعلق بمجرى الهواء من الأمراض الشائعة في الطفولة، مثل الربو وحساسية الآنف، ولكن أيضا إلى مجموعة من اضطرابات الجهاز التنفسي الأخرى أكثر انتشارا في وقت لاحق في الحياة.
وهنا يصف لنا تنفيذ أسلوب بعينه دون عائق المخاطية بطانة السائل من تجويف الآنف باستخدام تقنية التصفية الورقية، noninvasive، فضلا عن إجراءات استخراج لاحقة، تستخدم الوتي تحليلها على أساس البروتين من أوراق التصفية قبل كمياً. يمكن، على سبيل المثال، استخدام هذا الأسلوب للحصول على توقيعات محصنة ضد كل من الأشخاص الأصحاء والأفراد بمختلف أمراض الجهاز التنفسي في فيفو . وعلاوة على ذلك، فمن الممكن لدراسة حالات التعرض لأهمية لتوقيع المناعي محدد وتقييم إذا كان التوقع أو الوسيط لتطور المرض لاحق.
سائل البطانة المخاطية حصلت سابقا بالغسل الآنف2، الذي هو غالباً ما يسبقه اختبار تحدي الآنف، حيث أدخلت حساسية في المستويات العالية الحث استجابة التهابية3،4. ومع ذلك، تقنية الغسل الآنف ليس ممكناً في الأطفال الصغار ويدخل عامل إضعاف غير معروف، مما يفند النتائج، كوسيط المخفف يمكن أن تنخفض مستويات أقل من حد الكشف والرزن5. وعلاوة على ذلك، نظراً لعامل إضعاف غير معروف، ردود مدروسة أكثر من اختبارات التحدي الآنف ليست قابلة للمقارنة بين الأفراد، مما يحد من جدوى تقنية الغسل الآنف في مجموعة الإعداد. وأخيراً، التحدي حساسية لا ينطبق إلا في مواضيع توعية، والتحديات الأخرى، مثل الهستامين والتحدي، ليست فسيولوجيا ذات الصلة، يحتمل أن تسبب أثرا سقف على الإفراج عن الوسيط. يتم الالتفاف على هذه المشاكل في تقنية التصفية الورقية المقدمة لجمع السائل البطانة المخاطية، حيث يتم إفراز الفردية من السوائل ومستويات أكثر العوامل الوحيدة التي تؤثر على الفرق بين الفرد.
أثناء عملية الاستخراج، التيد تحليلها هي لجميع عينات من أوراق التصفية بعد إضافة كميات متماثلة من المخزن المؤقت. وهذا تفضل مماثلة السابقين فيفو تمييع جميع العينات. يتم استخدام مخزن مؤقت لاستخراج الحل الملح متساوي التوتر القائم على الزلال لخطوة الاستخراج؛ فهو يمكن استخراج الوسطاء القائم على البروتين وتستقر البروتينات إلى الحد من تمسخ أثناء تجميد اللاحقة من البروتينات الوتيد قبل التحديد الكمي. لتجنب تدهور البروتين خلال مرحلة الاستخراج، يتم إضافة خليط مثبطات البروتياز إلى المخزن المؤقت الاستخراج.
تنفيذ التقنيات التي تسمح للتقدير الكمي من دون عائق، في فيفو-الوسطاء المناعية التي تم إنشاؤها في مواقع المخاطية من الأهمية بمكان. أولاً، تشكل الموقع المخاطية أكبر جهاز المناعة في الجسم. ثانيا، موقع الآنف هو الموقع الرئيسي للتعرض المحمولة جوا وأحكام متصلة إلى حجرة المناعية التنفسية ل الرئتين1. ثالثا، يفتح إمكانية مسح هذا الجهاز الهام مع تقنية موسع في إمكانية توفير عدد كبير معلومات على محور التفاعل المناعي ميكروب هامة فيما يتعلق بالصحة والمرض في الخطوط الجوية. رابعا، هناك العديد من التطبيقات الممكنة الأخرى لهذه التقنية، مثل دراسة التعديلات المناعية المحلية في تجارب معشاة ذات شواهد، رقابة الأدوية والمغذيات الدقيقة.
في البداية نفذنا التقنية في "الدراسات المستقبلية" كوبنهاغن على الربو في الطفولة فوج2000 (كوبساك2000)، حيث عقدنا العزم الشخصية محصنة من السوائل البطانة المخاطية لدى الأطفال عمرها 7 سنوات مع حساسية الآنف مقابل ضوابط صحية13. فيما بعد، نحن طبقت بنجاح هذا الأسلوب إلى الفوج2010 كوبساك الطولي والملامح المناعية مجرى الهواء المقررة في شهر 1, 2 سنة، و 6 سنوات من العمر، وفي حالات من الأعراض التنفسية الحادة. أظهرت نتائج من الولدان 1 أشهر الجمعيات الهامة بين توقيع المناعي والتعرض البيئي المبكر الحياة7،،من89،10،11،12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1688">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Fibrous hydroxylatedpolyester sheets</td>
			<td style="width:103px;">Accuwik Ultra&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SPR0730</td>
			<td style="width:1084px;">Filter paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Milliplex Assay Buffer&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>L-AB</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">low-protein binding storage plates&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CLS8161</td>
			<td>Plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:103px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11873580001</td>
			<td>complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Reader of multi-spot plates</td>
			<td style="width:103px;">Mesoscale</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Sector imager 6000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Assays&#160;</td>
			<td style="width:103px;">Mesoscale</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-&#946;1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

noninvasive sampling of mucosal lining fluid for the quantification of in vivo upper airway immune-mediator levels

ويصف هذا البروتوكول موسع لأخذ العينات من مجرى الهواء العلوي دون عائق البطانة المخاطية السائل. أنها أيضا تفاصيل إجراءات استخراج المستخدمة قبل تحليل الوسطاء محصنة في السوائل الواتس لدراسة التوقيع المناعية الموضعية مجرى الهواء، دون الحاجة لإجراءات التحفيز (غالباً ما تستخدم بتقنيات أخرى). يتم أخذ عينات السوائل البطانة المخاطية على شريط من ورق الترشيح وضعت في الجزء الأمامي من أدنى توربيناتي وتترك لمدة 2 دقيقة للاستيعاب. تحليلها هي التيد من أوراق التصفية، ويتم تحليل الواتس على أساس البروتين المستخرج من المناعة المستندة إلى اليكتروتشيميلومينيسسينسي، مما يسمح لحساسية عالية التحديد الكمي لتحليلها منخفضة ورفيع المستوى في نفس العينة. قمنا بقياس المستويات في فيفو 20 الوسطاء المناعية المختارة المتعلقة بالمناعة محددة مما يشير إلى مسارات في الغشاء المخاطي مجرى الهواء العلوي، ولكن هذا الأسلوب لا يقتصر على ذلك لوحة محددة أو موقع أخذ العينات. الأسلوب الذي نفذ أولاً في الأطفال عمرها 7 سنوات من "الدراسات المستقبلية" كوبنهاغن على الربو في الطفولةعام 2000 (كوبساك2000) الفوج مع حساسية الآنف. وبعد ذلك استخدامه في كوبساك طولية2010 الولادي، عينات في الشهر 1، 2 سنة، و 6 سنوات من العمر، وفي حالات من الأعراض التنفسية الحادة. نحن التي تم الحصول عليها بنجاح، وتحليل عينات من 620 (89 في المائة) من 700 1 شهرا الأطفال؛ وكانت عينات قليلة أقل من حد الكشف والرزن (ذكرت كالوسيط (ربعي بين مجموعة (IQR)). وكان العدد العينات الكشف عن الحد الأدنى (أي من 0 إلى النقطة المحددة للحد الأدنى للكشف) لكل وسيط 29 (7.25-119.5). هذا الأسلوب يتيح التحديد الكمي للشخصية فيفو في المناعة المخاطية مجرى الهواء من الولادة ويمكن تطبيقها طوليا، ويمكن تطبيقها على دراسات بشأن تأثير الوراثة والتعرض البيئي المبكر الحياة والفيزيولوجيا المرضية، اندوتيبينج، ورصد أمراض الجهاز التنفسي، وتطوير وتقييم للمداواة الرواية.

Baseline Characteristics of the Airway Immune Profiles: 
Complete data on upper airway mucosal immune mediator levels at 1 month of age was obtained in 620 (89%) of the 700 children enrolled in the COPSAC2010 cohort. Ten neonates were enrolled before the technique was established, and 19 did not attend the 1-month visit. Additionally, 47 samples were excluded because they were extracted and measured in another laboratory used in a pilot study, and 4 sample...

Watch this Scientific Journal Video about Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels at JoVE.com

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

ويصف هذا البروتوكول تقنية موسع لأخذ عينات السوائل البطانة المخاطية دون عائق من الخطوط الجوية العليا. ويمكن استخدامه لإجراء التقدير الكمي في فيفو مستويات البروتين الوسطاء، مثل السيتوكينات والمستقطبات، في موضوعات في جميع الإعمار.

موسع لأخذ العينات من السوائل البطانة المخاطية للتحديد الكمي للمناعة-الوسيط في فيفو مجرى الهواء العلوي في مستويات

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

noninvasive-sampling-mucosal-lining-fluid-for-quantification-vivo

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Immunology and Infection

Unit 1

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Upper Respiratory Tract Infections

SCIENTISTS IN ACTION

10.1K Views.  University of Copenhagen. ويصف هذا البروتوكول تقنية موسع لأخذ عينات السوائل البطانة المخاطية دون عائق من الخطوط الجوية العليا. ويمكن استخدامه لإجراء التقدير الكمي في فيفو مستويات البروتين الوسطاء، مثل السيتوكينات والمستقطبات، في موضوعات في جميع الإعمار.

Video: Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

في المختبر المقايسة المشتركة لتقييم الهجرة العدلية المستحثة المسببة للأمراض عبر الظهارية

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

تشريح الفطري اشارة المناعة في التهرب الفيروسية من الإنتاج خلوى

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

إدارة الأنف المؤتلف لقاحات الأنفلونزا في همي ماوس نماذج لدراسة الأغشية المخاطية الحصانة

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the correct determination of a peptide&#39;s concentration, it should be stable during blood processing. However, this is not the case for several peptides which are quickly degraded by endogenous peptidases. Recently, we developed a blood processing method employing Reduced temperatures, Acidification, Protease inhibition, Isotopic exogenous controls and Dilution (RAPID) for the use in rats. Here, we have established this technique for the use in humans and investigated recovery, molecular form and circulating concentration of food intake regulatory hormones. The RAPID method significantly improved the recovery for 125I-labeled somatostatin-28 (+39%), glucagon-like peptide-1 (+35%), acyl ghrelin and glucagon (+32%), insulin and kisspeptin (+29%), nesfatin-1 (+28%), leptin (+21%) and peptide YY3-36 (+19%) compared to standard processing (EDTA blood on ice, p&#160;&#60;0.001). High performance liquid chromatography showed the elution of endogenous acyl ghrelin at the expected position after RAPID processing, while after standard processing 62% of acyl ghrelin were degraded resulting in an earlier peak likely representing desacyl ghrelin. After RAPID processing the acyl/desacyl ghrelin ratio in blood of normal weight subjects was 1:3 compared to 1:23 following standard processing (p&#160;= 0.03). Also endogenous kisspeptin levels were higher after RAPID compared to standard processing (+99%, p&#160;= 0.02). The RAPID blood processing method can be used in humans, yields higher peptide levels and allows for assessment of the correct molecular form.

The RAPID blood processing method can be used in humans and yields higher peptide levels as well as allows for assessment of the correct molecular form. Therefore, this method will be a valuable tool in peptide research.

طريقة سريعة لمعالجة الدم إلى زيادة الغلة من مستويات البلازما الببتيد في الدم البشري

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We demonstrate the procedure for preparing H. influenzae inoculum, intra-tracheal instillation of H. influenzae into the lung, collection of broncho-alveolar lavage fluid (BALF), analysis of immune cells in the BALF, and RNA isolation for differential gene expression analysis. This procedure can be used to study the lung inflammatory response to any bacteria, virus or fungi. Direct tracheal instillation is mostly preferred over intranasal or aerosol inhalation procedures because it more efficiently delivers the bacterial inoculum into the lower respiratory tract with less ambiguity.

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

الإدارة داخل القصبة الهوائية لل<em&gt; المستدمية النزلية</em&gt; في نماذج الماوس لدراسة التهاب الشعب الهوائية

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

مسحة طريقة أخذ العينات للكشف عن نوروفيروس الإنسان على السطوح

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, a significant stress response is induced during gastrointestinal transit and upon bile exposure, a normal component of human digestion. To overcome the bactericidal effects of bile, many enteric pathogens form a biofilm hypothesized to permit survival when transiting through the small intestine. Here we present methodologies to define biofilm formation through solid-phase adherence assays as well as extracellular polymeric substance (EPS) matrix detection and visualization. Furthermore, biofilm dispersion assessment is presented to mimic the analysis of events triggering release of bacteria during the infection process. Crystal violet staining is used to detect adherent bacteria in a high-throughput 96-well plate adherence assay. EPS production assessment is determined by two assays, namely microscopy staining of the EPS matrix and semi-quantitative analysis with a fluorescently-conjugated polysaccharide binding lectin. Finally, biofilm dispersion is measured through colony counts and plating. Positive data from multiple assays support the characterization of biofilms and can be utilized to identify bile salt-induced biofilm formation in other bacterial strains.

This protocol enables the reader to analyze bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens using a multifaceted approach to capture the dynamic nature of bacterial biofilms by assessing adherence, extracellular polymeric substance matrix formation, and dispersion.

تشكيل بيوفيلم التي يسببها الملح الصفراوية في مسببات الأمراض المعوية: تقنيات لتحديد وتقدير حجم

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Quantification of Atherosclerosis in Mice

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic inflammatory disease. Experimental atherosclerosis studies have elucidated the role of cholesterol and inflammation in the disease process. This has led to successful clinical trials with pharmaceutical agents that reduce clinical manifestations of atherosclerosis. Careful and well-controlled experiments in mouse models of the disease could further elucidate the pathogenesis of the disease, which is not fully understood. Standardized lesion analysis is important to reduce experimental variability and increase reproducibility. Determining lesion size in aortic root, aortic arch, and brachiocephalic artery are common endpoints in experimental atherosclerosis. This protocol provides a technical description for evaluation of atherosclerosis at all these sites in a single mouse. The protocol is particularly useful when material is limited, as is frequently the case when genetically modified animals are being characterized.

Murine models of atherosclerosis are useful tools to investigate pathogenic pathways on a molecular level, but require standardized quantification of lesion development. This protocol describes an optimized method to determine lesion size in the major arterial vessels including the aortic root, aortic arch, and brachiocephalic artery.

القياس الكمي لتصلب الشرايين في الفئران

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic ...

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal immunity, because they can model host-pathogen interactions in the tissue. While isolated cells derived from tissues were the first cell culture model, their use has been neglected because tissue can be hard to obtain. In the present protocol, we explain how to easily process and culture tonsillar mononuclear cells (TMCs) from healthy human tonsils to study innate immune responses upon activation, mimicking viral infection in mucosal tissues. Isolation of TMCs from the tonsils is quick, because the tonsils barely have any epithelium and yield up to billions of all major immune cell types. This method allows detection of cytokine production using several techniques, including immunoassays, qPCR, microscopy, flow cytometry, etc., similar to the use of peripheral mononuclear cells (PBMCs) from blood. Furthermore, TMCs show a higher sensitivity to drug testing than PBMCs, which needs to be considered for future toxicity assays. Thus, ex vivo TMCs cultures are an easy and accessible mucosal model.

In the present protocol, we explain how to easily process and culture tonsillar mononuclear cells from healthy humans undergoing partial surgical tonsillectomy to study innate immune responses upon activation, mimicking viral infection in mucosal tissues.

عزل الخلايا أحادية النوى اللوزتين لدراسة استجابات المناعة الفطرية Ex Vivo في الأنسجة اللمفاوية المخاطية البشرية

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response without any interference such as low protein expression, enzyme inactivity, or structural changes. This makes APN an attractive candidate in the development of vaccines that selectively target the mucosal epithelium. Previous studies have shown that APN is a receptor protein for both enterotoxigenic Escherichia coli (E. coli) F4 and transmissible gastroenteritis virus. Thus, APN shows promise in the development of antibody-drug conjugates or novel vaccines based on APN-specific antibodies. In this study, we compared production of APN-specific monoclonal antibodies (mAbs) using traditional hybridoma technology and recombinant antibody expression method. We also established a stably transfected Chinese hamster ovary (CHO) cell line using pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN and an E. coli expression BL21(DE3) strain harboring the pET28a (+)-rAbs-APN vector. The results show that antibodies expressed in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO cells and mAbs produced using hybridomas could recognize and bind to the APN protein. This provides the basis for further elucidation of the APN receptor function for the development of therapeutics targeting different APN-specific epitopes.

The recombinant antibody protein expressed in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO cells and monoclonal antibodies produced using traditional hybridoma technology can recognize and bind to the porcine aminopeptidase N (APN) protein.

إنتاج أجسام مضادة وحيدة النسيلة تستهدف أمينوببتيداز N في ظهارة الغشاء المخاطي المعوي الخنازير

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response ...