우리는 어린이 가족 COPSAC2010 코 호트 연구의 그들의 지원 및 헌신에 대 한 우리의 감사를 표현 한다. 우리는 인정 하 고 COPSAC 연구 팀과 cytokines와 발산의 측정 기술자 Lisbeth Buus Rosholm, 덴마크의 기술 대학에서에서 기술 도움의 독특한 노력을 주셔서 감사 합니다.

헬싱키의 선언의 원칙에 따라 연구 했다. 코펜하겐 (KF 01-289/96 COPSAC2000 )와 H B-2008-093 COPSAC2010및 덴마크어 데이터 보호 기관에 대 한 윤리 위원회에서 승인, 확인 하 고 등록 하기 전에 각 과목의 두 부모 로부터 서 면된 동의 얻어.
1. 실험 설치
<ol>
	<li>필터 종이 시트를 사용 하 여 (섬유 hydroxylated 폴리에스터 시트 참조 테이블의 재료)6,7.<ol>
		<li>나이가 어린이 성인 (5 x 20 x 10 m m (L의 짧은 팔))에 대 한 스트립 3 x 15 m m 1 개월 된 아이 대 한 크기와 L-모양에 잘라.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>집게를 사용 하 여 유아의 각 콧구멍에 필터 종이의 한 조각을 삽입 합니다. 열 등 한 비 (신생아에 대 한 콧구멍 및 다른 모든 연령대에 1.5 cm 대략 1 cm)의 앞쪽 부분에 필터 종이 놓습니다.<ol>
		<li>신생아를 침대에 놓고 그들에 게 편안 함을 위해 설탕 물. 참고: 다른 모든 연령대의 어린이 위한 샘플링 수행 됩니다 가장 쉽게의 자에 앉아 주제.</li>
		<li>더 오래 된 아이 들에 대 한 각 콧구멍에 L 모양 필터 종이의 긴 팔을 삽입 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>불편을 최소화 하 고 필터 종이의 실수로 손실을 방지 하기 위해 콧구멍 주위 코 클립을 적용 합니다.</li>
	<li>흡수의 2 분 후 필터 종이 제거 합니다.</li>
	<li>레이블이 지정 된 튜브에 필터 종이 놓고-80 ° c.에 즉시 그들을 멈추게합니다</li>
	<li>샘플링의 날에는 아이 의해 표시 된 기도 감염의 증상의 기록을 합니다.</li>
	<li>어떤, 재채기, 지속적인 울고, 또는 샘플링의 2 분 동안 발생 하는 비 출혈을 기록 합니다.</li>
</ol>
2입니다. 기도 면역-중재자의 정량화
<ol>
	<li>냉동 실에서 10 무작위로 샘플을 가져가 라. Id 번호를 기록 합니다. 전체 작업 과정에서 얼음에 샘플을 유지.</li>
	<li>얼음에 녹고 후 담가 (주제) 당 필터 종이 양쪽 콧구멍에서 300 µ L 갓의 버퍼 ( 재료의 표참조) 포함 한 완전 한 protease 억제제 태블릿 ( 재료의 표참조) 버퍼의 25 mL 당.<ol>
		<li>필터 종이의 크기에 따라 버퍼의 볼륨을 조정 합니다.<ol>
			<li>버퍼의 300 µ L를 사용 하 여 필터 용지 크기에서 3 x 15 m m에 대 한.</li>
			<li>하나의 필터 종이 사용할 수 있는 경우에 절반 버퍼 볼륨 (150 µ L)을 사용 합니다.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>타이머를 5 분 사용에 대 한 접시 통 (400 rpm)에 샘플을 전송.</li>
	<li>전송 촉촉한 필터 서류 및 분석 결과 버퍼는 microcentrifuge 배치는 셀 루 로스 아세테이트 튜브 필터 (0.22 μ m 기 공 크기)의 컵으로 튜브 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>필터링 된 코 추출 튜브를 5 분 (4 ° C)에서 냉각된 원심 분리기에서 16000 x g에서 원심.</li>
	<li>컵을 제거 하 고 낮은 단백질 바인딩 스토리지 접시 ( 테이블의 자료를 참조)의 우물에 비 추출 물 aliquoting 동안 얼음에 튜브를 유지.</li>
	<li>분석까지-80 ° C에 저장 합니다.</li>
	<li>Cytokines와 높은 감도, electrochemiluminesce 기반 다중화 어레이 시스템을 사용 하 여 비 강 추출 물에 발산의 농도 결정 ( 재료의 표참조). 참고: 인간의 10-플렉스 TH1/TH2 cytokine 분석 결과, 9-플렉스 chemokine 분석 결과, 및 단일-플렉스 IL-17A, TGF-β1, 및 TSLP 수행 했다 여기.<ol>
		<li>분석, 대 한 코 추출 물 4 ° c.에 하룻밤을 품 어 ( 재료의 표참조) 프로토콜 표준 제조 업체 당으로 측정을 수행 합니다. 참고:는 immunoassays 1 사이 배열 하는 측정에 대 한 높은 동적 범위는 일반적으로 ( 테이블의 자료를 참조) &#38; 10000 pg/mL, 일부 분석에 대 한 100000 pg/mL 될 수 있습니다. 즉, 같은 희석, 따라서 건강 하 고 병에 걸린 주제에 서로 다른 희석의 영향을 제한 하는 다른 유사한 immunoassays에서 경우에서 모든 샘플을 실행할 수 있습니다. 모든 cytokines에 대 한 검색의 하한값 1 pg/mL 또는 1 사이 배열, 그리고 발산, &#38; 50 pg/mL. TSLP 나이의 1 달에서 샘플의 98%에서 감지 되지 않았습니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3입니다. 통계
<ol>
	<li>로그 변환 cytokine 및 chemokine 레벨의 일반적으로 분산된 오차를 분석 하기 전에 데이터입니다.</li>
	<li>샘플 하나 이상의 일괄 처리에서 분석 되는 경우 batch-wise 로그 변환 데이터 중심으로 대 한 cytokine 및 chemokine 데이터를 수정 합니다.<ol>
		<li>전체 평균 및 안티 로그 변환 원래 측정 단위로 데이터를 통합 합니다. 참고: 분석 완료의 모든 집합에 대 한 cytokines 및 발산의 수준에 영향을 주는 변수를 조절 보십시오. 이 샘플링, 형제, 가정, 등등 있는 애완 동물 중 모성 영향 (예를 들어, 알코올 소비와 흡연 임신 중), 모유 수 유, 불리 한 이벤트 수 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bousquet, J., van Cauwenberge, P., Khaltaev, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergic+Rhinitis+and+Its+Impact+on+Asthma.">Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma.</a> J Allergy Clin Immunol. 108 (5), 147-334 (2001).</li><li>Howarth, P. H., Persson, C. G. A., Meltzer, E. O., Jacobson, M. R., Durham, S. R., Silkoff, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+monitoring+of+nasal+airway+inflammation+in+rhinitis.">Objective monitoring of nasal airway inflammation in rhinitis.</a> J Allergy Clin Immunol. 115 (3), 414-441 (2005).</li><li>Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. 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L., Mason, J., Compton, D., Stewart, J., Ricard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+and+safety+of+fexofenadine+HCl+and+pseudoephedrine,+alone+and+in+combination,+in+seasonal+allergic+rhinitis.">The efficacy and safety of fexofenadine HCl and pseudoephedrine, alone and in combination, in seasonal allergic rhinitis.</a> J Allergy Clin Immunol. 104 (1), 100-106 (1999).</li><li>Bisgaard, H., Robinson, C., R&#248;meling, F., Mygind, N., Church, M., Holgate, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukotriene+C4+and+histamine+in+early+allergic+reaction+in+the+nose.">Leukotriene C4 and histamine in early allergic reaction in the nose.</a> Allergy. 43 (3), 219-227 (1988).</li><li>Chawes, B. L. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Cytokine+Profile+in+the+Airway+Mucosal+Lining+Fluid+Is+Skewed+by+Maternal+Atopy.">Neonatal Cytokine Profile in the Airway Mucosal Lining Fluid Is Skewed by Maternal Atopy.</a> Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).</li><li>Chawes, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Vitamin+D3+Supplementation+During+Pregnancy+on+Risk+of+Persistent+Wheeze+in+the+Offspring:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Effect of Vitamin D3 Supplementation During Pregnancy on Risk of Persistent Wheeze in the Offspring: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA. 315 (4), 353-361 (2016).</li><li>Bischoff, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Response+to+A(H1N1)pnd09+Vaccination+in+Pregnant+Women:+A+Single+Blinded+Randomized+Controlled+Trial.">Altered Response to A(H1N1)pnd09 Vaccination in Pregnant Women: A Single Blinded Randomized Controlled Trial.</a> PloS One. 8 (4), 56700 (2013).</li><li>Wolsk, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picornavirus-Induced+Airway+Mucosa+Immune+Profile+in+Asymptomatic+Neonates.">Picornavirus-Induced Airway Mucosa Immune Profile in Asymptomatic Neonates.</a> J Infect Dis. 213 (8), 1262-1270 (2016).</li><li>Wolsk, H. M., Chawes, B. L., F&#248;lsgaard, N. V., Rasmussen, M. A., Brix, S., Bisgaard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siblings+Promote+a+Type+1/Type+17-oriented+immune+response+in+the+airways+of+asymptomatic+neonates.">Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates.</a> Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).</li><li>Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+technique+for+recovery+of+cytokines+from+inflammatory+sites+in+situ.">Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ.</a> J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).</li><li>Ishizaka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+bronchoscopic+microsample+probe+to+measure+the+biochemical+constituents+in+epithelial+lining+fluid+of+patients+with+acute+respiratory+distress+syndrome.">New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome.</a> Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).</li><li>Ishizaka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevation+of+KL-6,+a+lung+epithelial+cell+marker,+in+plasma+and+epithelial+lining+fluid+in+acute+respiratory+distress+syndrome.">Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), 1088-1094 (2004).</li><li>Nakano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-1+level+in+epithelial+lining+fluid+of+patients+with+acute+respiratory+distress+syndrome.">Endothelin-1 level in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome.</a> Respirology. 12 (5), 740-743 (2007).</li><li>Komaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-mediated+xanthine+oxidase+upregulation+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease's+airways.">Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease's airways.</a> Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).</li><li>Moeller, A., Franklin, P., Hall, G. L., Horak, F., Wildhaber, J. H., Stick, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+exhaled+breath+condensates+in+infants.">Measuring exhaled breath condensates in infants.</a> Pediatr Pulmonol. 41 (2), 184-187 (2006).</li></ol>

모든 저자는 아무 잠재적인, 인식, 또는 진짜 상충이이 원고 내용에 관한 선언합니다. 자금 지원 기관 설계 및 연구;의 행위에 어떤 역할을 없 었 어 요 수집, 관리, 및 해석 데이터; 나는 준비 검토을 원고의 승인. 제약 회사는 연구에 참여 했다.

여기에 제시 된 기술로, vivo에서 위 기도 점 막 면역 프로필 1 개월 이전 완료 하지 않은 나이 일찍부터 어린이 확인할 수 있었습니다. 우리는 신생아의 기도 면역 프로필에 특정 기도 박테리아의 그 존재와 感7,11, 뿐 아니라 다른 전과 perinatal 노출, 미러 했다 관찰 했다. 또한, 우리는 높은 복용량 비타민 d의 무작위 미 량 재판의 행동의 메커니즘을...

코의 점 막 내벽 액체 위 기도 시스템의 액체 부분을 게. 복잡 한 매트릭스 상피와 미생물 침입에 대 한 방어의 첫 번째 라인을 구성 하는 면역 세포 사이 상호 작용에서 파생 하는 중재자의 그것에 의하여 이루어져 있다. 비 강 점 막이 쉽게 접근할 수 있는, 그리고 코와 기관지1사이의 강력한 기능과 면역 관계 있다. 이 구획은 어린 시절에, 인생에서 나중에 더 널리 다른 호흡기 질환의 범위 뿐만 아니라 천식과 알레르기 비 염 등 일반적인 기도 질병에 관하여 특별 한 관심의 이다.
여기, 우리는 샘플 그대로 점 막 비 강에서 액체를 안 감 후속 추출 절차 뿐 아니라 필터 종이, 비 침 투 적인 기법을 사용 하 여, 하는 데 사용 그들의 정량화 하기 전에 필터 논문에서 단백질 기반 analytes elute 메서드의 구현을 설명 합니다. 이 기술은 예를 들어 vivo에서 모두 건강 한 개인과 다양 한 호흡기 질환과 개인의 면역 시그니처를 사용할 수 있습니다. 또한, 특정 면역 서명에 대 한 중요성의 노출을 확인 하 고 예측 또는 중재자 나중 질병 개발의 경우 평가를 가능 하다.
점 막 내벽 액체 이전 코 게2는 종종 앞 코 도전 테스트는 알레르기 염증 반응을3,4자극을 높은 수준에서 소개 된다에 의해 획득 되었습니다 했다. 그러나, 코 게 기술은 어린 아이에서 가능 하지 않습니다 하 고 수준 분석 결과5의 검출 한계 보다 낮을 수 있습니다 희석된 중재자로 서, 결과 혼동 한다 한 알 수 없는 희석 요소를 소개 합니다. 또한,이 알 수 없는 희석 요인 때문 코 도전 테스트에서 측정 된 실정이 응답 설정 일대에 코 게 기술의 유용성을 제한 함으로써 개인 간의 비교 되지 않습니다. 마지막으로, 알레르기 도전만 민감하게 과목에 적용 이며 히 스타 민 도전 등 기타 문제는 순수, 잠재적으로 중재자 릴리스에 천장 효과 일으키는. 이러한 문제는 어디 체액과 분석 수준을 개별 분 비 간 개별 분산에 영향을 주는 유일한 요소는 점 막 내벽 유체 컬렉션에 대 한 표시 필터 종이 기반 기술에서 피할.
추출 프로시저 동안 analytes는 eluted 필터 논문에서 버퍼의 동일한 볼륨의 추가 후 모든 샘플. 이 모든 샘플의 비슷한 비보 전 희석 하시 더군요. 알 부 민-기반 isotonic 소금 솔루션의 추출 버퍼 추출 단계;에 사용 그것은 단백질 기반 중재자의 추출 가능 하 게 하 고 단백질 제한 이후 동결 중 정량화 이전 eluted 단백질의 변성을 안정 시킨다. 추출 단계 단백질 저하를 방지 하려면 protease 억제제의 칵테일 추출 버퍼에 추가 됩니다.
그대로, vivo에서정량화를 허용 하는 기술의 구현-점 막 사이트에서 생성 된 면역 중재자는 최대 중요성 이다. 첫째, 점 막 사이트는 신체에서 가장 큰 면역 기관 최대 수 있습니다. 둘째, 코 위치 공중 노출의 주 사이트 이며1폐 호흡기 면역 구획에 밀접 하 게 연결 된. 셋째, 비 침 투 적인 기법으로이 중요 한 장기를 측량의 가능성 건강과 질병 기도에 관하여 중요 한 미생물 면역 상호 작용 축에 과다 한 정보를 제공 하는 가능성을 엽니다. 넷째, 약물과 미 량 영양소의 무작위로 고르 곤, 통제 된 실험에서 로컬 면역학 변경 공부 등이 기술의 다른 많은 가능한 응용 프로그램 있다.
우리 처음 우리 7 세 어린이 건강 한 컨트롤13대 알레르기 비 염으로 점 막 내벽 액체의 면역 프로필을 결정 하는 어린 시절2000 (COPSAC2000) 일대에에 코펜하겐 예비 연구에의 기술 구현. 그 후, 우리가 성공적으로 적용이 기술을 경도 COPSAC2010 코 호트 및 평가 기도 면역 프로필에 1 달, 2 년, 그리고 나이의 6 년 및 급성 호흡기 증상의 인스턴스. 1 개월 된 신생아 결과 면역 서명 및 초기 생활 환경 노출7,8,9,10,,1112사이 중요 한 연결을 설명 했다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1688">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Fibrous hydroxylatedpolyester sheets</td>
			<td style="width:103px;">Accuwik Ultra&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SPR0730</td>
			<td style="width:1084px;">Filter paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Milliplex Assay Buffer&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>L-AB</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">low-protein binding storage plates&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CLS8161</td>
			<td>Plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:103px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11873580001</td>
			<td>complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Reader of multi-spot plates</td>
			<td style="width:103px;">Mesoscale</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Sector imager 6000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Assays&#160;</td>
			<td style="width:103px;">Mesoscale</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-&#946;1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

noninvasive sampling of mucosal lining fluid for the quantification of in vivo upper airway immune-mediator levels

이 프로토콜 설명 그대로 상부 기도 점 막 안 대기의 비 침범 성 샘플링을 합니다. 그것은 또한 기도 국 소 면역 서명, 자극 절차 (종종 다른 기술에서 사용)에 대 한 필요 없이 연구에 대 한 유체 있다 면역 중재자의 분석 전에 사용 추출 절차를 자세히 설명 합니다. 점 막 내벽 액체 필터 종이의 스트립에 샘플링 비와 흡수의 2 분 왼쪽 열 등의 앞쪽 부분에 배치. Analytes는 eluted 필터 논문에서 그리고 추출 된 단백질 기반 있다 동일한 샘플에 낮은 및 높은 레벨 analytes의 높은 감도 정량화에 대 한 수는 electrochemiluminescence 기반 immunoassay에 의해 분석 된다. 상부 기도 점 막에 통로 신호 하는 특정 면역에 관련 된 20 미리 면역 중재자의 비보에 레벨 측정 하지만 기술은 그 특정 패널 또는 샘플링 사이트에 국한 되지 않습니다. 기술은 처음 알레르기 비 염으로 어린 시절2000 (COPSAC2000) 일대에 7 세 어린이 천식에 코펜하겐 예비 연구에서 구현 되었습니다. 그것은 그 후 경도 COPSAC2010 출생 코 호트, 1 달, 2 년, 그리고 나이의 6 년에와에서 급성 호흡기 증상의 경우에에서 사용 되었다. 우리는 성공적으로 얻은 및 700 1 개월 어린이의 620 (89%)에서 샘플을 분석; (중간값 (간 사분 위 수 범위 (IQR))로 보고 분석 결과 검출 한계 아래 몇 가지 샘플 했다 합니다. 각 중재자에 대 한 검출 한계 (즉, 0에서 탐지의 낮은 제한 세트 포인트를) 아래에 샘플의 번호 29 (7.25-119.5) 이었다. 이 기술은 수 에 비보 기도 점 막 면역 프로 파일의 출생에서 정량화, 경도, 적용 될 수 있다 그리고 유전학 및 초기 생활 환경 노출, 이상, endotyping, 및 호흡기 질환, 그리고 개발 및 새로운 치료제의 평가의 효과 대 한 연구에 적용할 수 있습니다.

Baseline Characteristics of the Airway Immune Profiles: 
Complete data on upper airway mucosal immune mediator levels at 1 month of age was obtained in 620 (89%) of the 700 children enrolled in the COPSAC2010 cohort. Ten neonates were enrolled before the technique was established, and 19 did not attend the 1-month visit. Additionally, 47 samples were excluded because they were extracted and measured in another laboratory used in a pilot study, and 4 sample...

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Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

이 프로토콜에서는 위 항공에서 그대로 점 막 안 대기의 샘플링에 대 한 비 침 투 적인 기법을 설명합니다. 그것은 모든 연령대의 주제에 vivo에서 단백질 중재자, cytokines, 발산, 등의 레벨의 정량화를 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다.

상부 기도 면역 중재자 수준 Vivo에서 의 정량화에 대 한 점 막 안 대기의 비 침범 성 샘플링

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

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Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

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10.2K 조회수.  University of Copenhagen. 이 프로토콜에서는 위 항공에서 그대로 점 막 안 대기의 샘플링에 대 한 비 침 투 적인 기법을 설명합니다. 그것은 모든 연령대의 주제에 vivo에서 단백질 중재자, cytokines, 발산, 등의 레벨의 정량화를 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다.

비디오: Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

시험관 내 병원균 유도 호중구 트랜스 상피 이동을 평가하는 공동 문화 분석

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

연구

면역학 및 감염병학

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

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In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their intercommunication, are paramount for the protection against infections. The interactions of epithelial and innate immune cells with a pathogen are best investigated in vivo, where complex behavior unfolds over time and space. However, existing models do not allow for easy spatio-temporal imaging of the battle with pathogens at the mucosal level.
The model developed here creates a mucosal infection by direct injection of the fungal pathogen, Candida albicans, into the swimbladder of juvenile zebrafish. The resulting infection enables high-resolution imaging of epithelial and innate immune cell behavior throughout the development of mucosal disease. The versatility of this method allows for interrogation of the host to probe the detailed sequence of immune events leading to phagocyte recruitment and to examine the roles of particular cell types and molecular pathways in protection. In addition, the behavior of the pathogen as a function of immune attack can be imaged simultaneously by using fluorescent protein-expressing C. albicans. Increased spatial resolution of the host-pathogen interaction is also possible using the described rapid swimbladder dissection technique.
The mucosal infection model described here is straightforward and highly reproducible, making it a valuable tool for the study of mucosal candidiasis. This system may also be broadly translatable to other mucosal pathogens such as mycobacterial, bacterial or viral microbes that normally infect through epithelial surfaces.

In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

Swimbladder 주입에 의해 애벌레 Zebrafish의 점막 칸디다증 모델링

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

키메라 마우스 모델에서 재조합 인플루엔자 백신의 비강 관리는 점막 면역을 연구하기 위해

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We demonstrate the procedure for preparing H. influenzae inoculum, intra-tracheal instillation of H. influenzae into the lung, collection of broncho-alveolar lavage fluid (BALF), analysis of immune cells in the BALF, and RNA isolation for differential gene expression analysis. This procedure can be used to study the lung inflammatory response to any bacteria, virus or fungi. Direct tracheal instillation is mostly preferred over intranasal or aerosol inhalation procedures because it more efficiently delivers the bacterial inoculum into the lower respiratory tract with less ambiguity.

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

의 내부 기관 관리<em&gt; 헤모필루스 인플루엔자</em&gt; 마우스 모델에서기도 염증을 연구하는

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

표면에 인간의 노로 바이러스의 검출을위한 면봉 표본 추출 방법

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, a significant stress response is induced during gastrointestinal transit and upon bile exposure, a normal component of human digestion. To overcome the bactericidal effects of bile, many enteric pathogens form a biofilm hypothesized to permit survival when transiting through the small intestine. Here we present methodologies to define biofilm formation through solid-phase adherence assays as well as extracellular polymeric substance (EPS) matrix detection and visualization. Furthermore, biofilm dispersion assessment is presented to mimic the analysis of events triggering release of bacteria during the infection process. Crystal violet staining is used to detect adherent bacteria in a high-throughput 96-well plate adherence assay. EPS production assessment is determined by two assays, namely microscopy staining of the EPS matrix and semi-quantitative analysis with a fluorescently-conjugated polysaccharide binding lectin. Finally, biofilm dispersion is measured through colony counts and plating. Positive data from multiple assays support the characterization of biofilms and can be utilized to identify bile salt-induced biofilm formation in other bacterial strains.

This protocol enables the reader to analyze bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens using a multifaceted approach to capture the dynamic nature of bacterial biofilms by assessing adherence, extracellular polymeric substance matrix formation, and dispersion.

담 즙 소금 유도 Biofilm 형성 장 병원 체에서: 식별 및 정량화 기술

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.

생체 내에서 단핵구 화학 적 활동의 정량화 및 혈액 단핵구 유래 대식세포의 특성화

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

Quantification of Atherosclerosis in Mice

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic inflammatory disease. Experimental atherosclerosis studies have elucidated the role of cholesterol and inflammation in the disease process. This has led to successful clinical trials with pharmaceutical agents that reduce clinical manifestations of atherosclerosis. Careful and well-controlled experiments in mouse models of the disease could further elucidate the pathogenesis of the disease, which is not fully understood. Standardized lesion analysis is important to reduce experimental variability and increase reproducibility. Determining lesion size in aortic root, aortic arch, and brachiocephalic artery are common endpoints in experimental atherosclerosis. This protocol provides a technical description for evaluation of atherosclerosis at all these sites in a single mouse. The protocol is particularly useful when material is limited, as is frequently the case when genetically modified animals are being characterized.

Murine models of atherosclerosis are useful tools to investigate pathogenic pathways on a molecular level, but require standardized quantification of lesion development. This protocol describes an optimized method to determine lesion size in the major arterial vessels including the aortic root, aortic arch, and brachiocephalic artery.