אנו מביעים את הכרת התודה שלנו ילדים ומשפחות של מחקר עוקבה2010 COPSAC עבור כל התמיכה והמחויבות שלהם. אנו להכיר, להעריך את המאמצים ייחודי של צוות המחקר COPSAC ואת עזרת טכני טכנאי ליסבת Buus Rosholm, האוניברסיטה הטכנית של דנמרק, לשקילת ציטוקינים ו נוגדנים.

המחקרים נערכו בהתאם לעקרונות המנחים הצהרת הלסינקי. התקבלו האישורים של ועדת האתיקה קופנהגן (KF 01-289/96 COPSAC2000 ) ו- H-B-2008-093 COPSAC2010, הסוכנות להגנת נתונים דנית, בכתב הסכמה מדעת הושג משני ההורים של כל נושא לפני ההרשמה.
1. הגדרת הניסוי
<ol>
	<li>השתמש גיליונות של נייר סינון (סיבי פוליאסטר hydroxylated גליונות, ראה את הטבלה של חומרים)6,7.<ol>
		<li>לגזור רצועות 3 x 15 מ"מ גודל עבור ילד בן חודש 1, צורת L מבוגרים לילדים ומבוגרים (5 x 20 x 10 מ מ (הזרוע הקצרה של בחיצים)).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>להוסיף חתיכת נייר סינון לנחיר אחד של התינוק באמצעות מלקחיים. מניחים נייר הסינון בחלק הקדמי של נחותים turbinate (כ 1 ס מ בתוך הנחיר עבור neonates ו- 1.5 ס מ לכל הגילאים אחרים).<ol>
		<li>במקום neonates על מיטה ולתת להם סוכר לנוחות. הערה: לילדים בכל הגילאים אחרים, שהדגימה מבוצעת בקלות הרבה ביותר בנושא ישובה על כיסא.</li>
		<li>ילדים בוגרים, להוסיף הזרוע הארוכה של נייר הסינון בצורת L לנחיר אחד.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>החל מסרטון האף נחיריו של כדי למזער את אי הנוחות, כדי להימנע מאובדן מקרי של נייר הסינון.</li>
	<li>הסר את הניירות המסנן לאחר 2 דקות של ספיגת.</li>
	<li>למקם את הניירות מסנן צינורות שכותרתו ולהקפיא אותן באופן מיידי ב- 80 ° c</li>
	<li>רשום של תסמינים של זיהום דרכי הנשימה שמוצג על ידי הילד ביום של הדגימה.</li>
	<li>לתעד את כל התעטשות, בכי מתמשך או epistaxis המתרחשת במהלך 2 דקות של הדגימה.</li>
</ol>
2. כימות של דרכי הנשימה החיסון-מתווכים
<ol>
	<li>סעו עד 10 מדגמים רנדומליים במקפיא. להקליט את מספרי הזיהוי. שומרים את הדגימות על קרח בכל תהליך העבודה.</li>
	<li>לאחר מפשיר על קרח, לטבול את הניירות מסנן (לכל נושא) מהנחיריים שני 300 µL של טריות מאגר (ראה הטבלה של חומרים) המכיל פרוטאז מלאה מעכב טבליה אחת (ראה את הטבלה של חומרים) לכל 25 מ של המאגר.<ol>
		<li>להתאים את עוצמת הקול של מאגר לפי גודל נייר הסינון.<ol>
			<li>השתמש µL 300 מאגר עבור מסנן המסמכים 3 x 15 מ"מ גודל.</li>
			<li>אם רק אחד נייר סינון זמין, השתמש חצי מאגר אמצעי האחסון (150 µL).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>העברת הדגימות מטרף צלחת (400 סל ד) עבור 5 דק שימוש שעון עצר.</li>
	<li>העברת מאגר assay והמסמכים מסנן לח לתוך הכוס של מסנן צינור אצטט תאית (0.22 µm גודל הנקבוביות) ממוקם בתוך microcentrifuge צינור (ראה את הטבלה של חומרים).</li>
	<li>צנטריפוגה-16,000 g x עבור 5 דקות ומפרידה מקורר (ב 4 ° C) כדי להשיג תמצית האף מסוננים בצינור.</li>
	<li>להסיר את הגביע ולשמור הצינורות על קרח בזמן aliquoting את תמצית האף לתוך הבארות של דל חלבון מחייב אחסון צלחות (ראה את הטבלה של חומרים).</li>
	<li>לאחסן ב- 80 ° C עד הניתוח.</li>
	<li>לקבוע את ריכוזי ציטוקינים נוגדנים בתמציות האף באמצעות מערכת רגישות גבוהה, המבוססים על electrochemiluminesce מערך מרובבת (ראה את הטבלה של חומרים). הערה: אדם 10-פלקס TH1/THציטוקינים 2 assay, 9-פלקס כימוקין assay, יחיד-פלקס IL-17A, TGF-β1 ואת TSLP בוצעו כאן.<ol>
		<li>עבור מבחני, דגירה תמציות באף בן לילה ב 4 º C. לנהל את המידות כמו לאדם רגיל היצרן פרוטוקול (ראה את הטבלה של חומרים). הערה: immunoassays (ראה טבלה של חומרים) בדרך כלל יש טווח דינמי גבוה למדידה הנעים בין 1 &#38; 10,000 pg/mL, אבל עבור כמה מבחני, זה יכול להיות 100,000 pg/mL. משמעות הדבר היא שלא ניתן להפעיל כל דוגמאות-דילול אותו, ובכך יגביל את ההשפעה של דילולים שונים במקצועות בריאים וחולים, כמו במקרה של immunoassays דומים אחרים. הגבול התחתון של זיהוי עבור כל ציטוקינים היה 1 pg/mL או פחות, ובשביל נוגדנים, זה נע בין 1 &#38; 50 pg/mL. TSLP לזיהוי ב- 98% של דגימות לא היה באותו חודש של גיל.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. נתונים סטטיסטיים
<ol>
	<li>הנתונים לפני ניתוח כדי לקבל תמלוגים בדרך כלל מבוזרת של רמות ציטוקינים ו כימוקין יומן-שינוי צורה.</li>
	<li>אם הדגימות מנותחים אצווה אחד או יותר, לתקן את הנתונים ציטוקינים ו כימוקין למרכוז batch-wise על נתוני יומן-טרנספורמציה.<ol>
		<li>לשלב אומר הכוללת וטרנספורמציה אנטי-יומן כדי לקבל נתונים ביחידות המידה המקורית. הערה: עבור כל ערכה של ניתוחים עשית, שקול לכוונן משתנים המשפיעים על רמת ציטוקינים נוגדנים. זה יכול להיות השפעות אימהי (למשל, צריכת אלכוהול ועישון במהלך ההריון), הנקה, אירועים קשים במהלך דגימה, אחים, לבעלי-חיים הבית, וכו</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bousquet, J., van Cauwenberge, P., Khaltaev, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergic+Rhinitis+and+Its+Impact+on+Asthma.">Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma.</a> J Allergy Clin Immunol. 108 (5), 147-334 (2001).</li><li>Howarth, P. H., Persson, C. G. A., Meltzer, E. O., Jacobson, M. R., Durham, S. R., Silkoff, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+monitoring+of+nasal+airway+inflammation+in+rhinitis.">Objective monitoring of nasal airway inflammation in rhinitis.</a> J Allergy Clin Immunol. 115 (3), 414-441 (2005).</li><li>Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cytokines+in+nasal+secretions+after+nasal+antigen+challenge:+lack+of+influence+of+antihistamines.">Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines.</a> Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).</li><li>Sussman, G. L., Mason, J., Compton, D., Stewart, J., Ricard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+and+safety+of+fexofenadine+HCl+and+pseudoephedrine,+alone+and+in+combination,+in+seasonal+allergic+rhinitis.">The efficacy and safety of fexofenadine HCl and pseudoephedrine, alone and in combination, in seasonal allergic rhinitis.</a> J Allergy Clin Immunol. 104 (1), 100-106 (1999).</li><li>Bisgaard, H., Robinson, C., R&#248;meling, F., Mygind, N., Church, M., Holgate, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukotriene+C4+and+histamine+in+early+allergic+reaction+in+the+nose.">Leukotriene C4 and histamine in early allergic reaction in the nose.</a> Allergy. 43 (3), 219-227 (1988).</li><li>Chawes, B. L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+assessing+unchallenged+levels+of+mediators+in+nasal+epithelial+lining+fluid.">A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid.</a> J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).</li><li>F&#0248;lsgaard, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+bacteria+colonizing+the+airways+in+asymptomatic+neonates+stimulates+topical+inflammatory+mediator+release.">Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release.</a> Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).</li><li>F&#0248;lsgaard, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Cytokine+Profile+in+the+Airway+Mucosal+Lining+Fluid+Is+Skewed+by+Maternal+Atopy.">Neonatal Cytokine Profile in the Airway Mucosal Lining Fluid Is Skewed by Maternal Atopy.</a> Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).</li><li>Chawes, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Vitamin+D3+Supplementation+During+Pregnancy+on+Risk+of+Persistent+Wheeze+in+the+Offspring:+A+Randomized+Clinical+Trial.">Effect of Vitamin D3 Supplementation During Pregnancy on Risk of Persistent Wheeze in the Offspring: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA. 315 (4), 353-361 (2016).</li><li>Bischoff, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Response+to+A(H1N1)pnd09+Vaccination+in+Pregnant+Women:+A+Single+Blinded+Randomized+Controlled+Trial.">Altered Response to A(H1N1)pnd09 Vaccination in Pregnant Women: A Single Blinded Randomized Controlled Trial.</a> PloS One. 8 (4), 56700 (2013).</li><li>Wolsk, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picornavirus-Induced+Airway+Mucosa+Immune+Profile+in+Asymptomatic+Neonates.">Picornavirus-Induced Airway Mucosa Immune Profile in Asymptomatic Neonates.</a> J Infect Dis. 213 (8), 1262-1270 (2016).</li><li>Wolsk, H. M., Chawes, B. L., F&#248;lsgaard, N. V., Rasmussen, M. A., Brix, S., Bisgaard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siblings+Promote+a+Type+1/Type+17-oriented+immune+response+in+the+airways+of+asymptomatic+neonates.">Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates.</a> Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).</li><li>Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+technique+for+recovery+of+cytokines+from+inflammatory+sites+in+situ.">Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ.</a> J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).</li><li>Ishizaka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+bronchoscopic+microsample+probe+to+measure+the+biochemical+constituents+in+epithelial+lining+fluid+of+patients+with+acute+respiratory+distress+syndrome.">New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome.</a> Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).</li><li>Ishizaka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevation+of+KL-6,+a+lung+epithelial+cell+marker,+in+plasma+and+epithelial+lining+fluid+in+acute+respiratory+distress+syndrome.">Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), 1088-1094 (2004).</li><li>Nakano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-1+level+in+epithelial+lining+fluid+of+patients+with+acute+respiratory+distress+syndrome.">Endothelin-1 level in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome.</a> Respirology. 12 (5), 740-743 (2007).</li><li>Komaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-mediated+xanthine+oxidase+upregulation+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease's+airways.">Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease's airways.</a> Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).</li><li>Moeller, A., Franklin, P., Hall, G. L., Horak, F., Wildhaber, J. H., Stick, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+exhaled+breath+condensates+in+infants.">Measuring exhaled breath condensates in infants.</a> Pediatr Pulmonol. 41 (2), 184-187 (2006).</li></ol>

כל המחברים מצהירים אין פוטנציאל, נתפס או אמיתי ניגוד עניינים לגבי התוכן של כתב היד הזה. סוכנויות מימון לא היה כל תפקיד העיצוב ואת ההתנהגות של המחקר; אוסף, ניהול של פרשנות הנתונים; או אופן ההכנה, סקירה, אישור של כתב היד. חברת התרופות לא היה מעורב במחקר.

עם הטכניקה המובאת כאן, הצלחנו לקבוע את ויוו דרכי הנשימה העליונה הרירית פרופיל החיסונית אצל ילדים מוקדם ככל חודש של גיל, אשר לא נעשה בעבר. . הבחנו שהנוכחות של חיידקים מסוימים את דרכי הנשימה, picornaviruses7,11, כמו גם אחרים טרום, חשיפות הלידה, היו שיקוף בפרופיל המערכת החיסונית דרכי הנשימה neonates. יתר על כן, נהגנו נתוני הפרופיל החיסונית אלה דרכי הנשימה ללמוד את מנגנון הפעולה של משפט אקראי micronutrient של ויטמין d במינון גבוה תוצאות אלו מדגישים את תוקפו ואת התועלת של הטכניקה נוזלים שורות mucosal כמו טכניקה דגימה לא פולשנית עבור הבאים ויוו כימות של מתווכים חיסוניים דרכי הנשימה.
הנקודות הבאות ששווים לפני יישום השיטה: כדי למדוד ציטוקינים במטריצת שורות mucosal נוזלים, חשוב להשתמש מתכלה גבוהה-רגישות מבוססי מתודולוגיות, כמו זה המסופק באמצעות פרוטוקולים electrochemiluminescence. השימוש immunoassays מקושרים-אנזים יכול להוביל מסקנה במדידה ספיגת. יתר על כן, למרות שיש קשר חזק בין האף הסמפונות, המדידה של הפרופיל החיסונית את דרכי הנשימה העליונות הוא עדיין מגבלה. דגימה בוצעה על החלק העליון של השכבה הרירית; לכן, אנו מצפים כי הנוזל בעיקר מייצג את ההרכב של שכבת ג'ל, לא השכבה סול. אנחנו לא למדוד שכבה ריריות סמנים כדי לאמת את זה, זו מגבלה. בודדים בווריאציות האף הפרשת נוזלים עשויים בתיאוריה להשפיע הרמות שאותרו של ציטוקינים ו נוגדנים. עם זאת, הצלחנו לזהות משתנים וברורה פנוטיפים אימונולוגי בתגובה חשיפות שונות7,8,9,10,11,12, המציין כי הבין-אישית בווריאציות הפרשת האף דינמיקה לא ייתכן מכשול גדול עבור טכניקה זו. תוך כדי ביצוע הטכניקה, חשוב לבצע את כל ההליכים בטמפרטורות נמוכות (מקורר קרח) כדי למנוע השפלה חלבון במהלך העיבוד. השפלה חלבון יכול להיות מופחת עוד יותר על-ידי הוספה של מעכבי פרוטאז חלבון מומלצים למאגר מיצוי חלבונים.
למרות זאת, הכוח של טכניקה זו היא שזה לא פולשנית ולא קל לביצוע, הפעלת הערכות האורך של דרכי הנשימה הרירית החתימה המערכת החיסונית מהתקופה neonatal ו ואילך. מידע כזה יכול לספק פוטנציאל הידע על איך המערכת החיסונית המקומית דרכי הנשימה מבשיל ומפתחת לאורך כל הילדות לבגרות. יתר על כן, הטכניקה הדגימה מתבצעת ללא הפרעה, בתוך vivo -באופן רלוונטי, לא מדולל, שאיפשר את הגילוי של מתווכים חיסוניים זה היה לגילוי עם טכניקה שטיפה של חלל האף, שבו גורם לא ידוע דילול מפחית את תוקפו של ממצאים13. השתמשנו מדיום סינתטי, סיבית, hydroxylated-פוליאסטר זמינים מסחרית (ראה הטבלה של חומרים) והוא מיועד עבור מדגם איסוף, אחסון, ושחרור תרכיב. החומר הוא הידרופיליות, עם קשירה נמוכה למערכות ביולוגיות, דגימות המכילים חלבונים יציבים במהלך האחסון ב- 80 ° c החומר סופג מאוד, משטחים סיבים שונו כדי לשפר את המים wettability.
במחקר2010 COPSAC, בחרנו פאנל של 21 ציטוקינים, נוגדנים אשר נבחרו מראש כדי לייצג מסלולים פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר העיקריים של המערכת החיסונית מתנהג באופן מקומי את דרכי הנשימה. היחידה של אלה מגשרים, גישור, TSLP, איננה לזיהוי ב חודש אחד של גיל.
יישום חשוב לעתיד יהיה לאסוף שורות mucosal נוזל מן הנשימה התחתונה (למשל, על-ידי שימוש בטכניקה bronchoscopic microsampling) כדי להעריך את דרכי הנשימה התחתונה אימונולוגיה. Bronchoscopic microsampling זה הליך חדש לאבחון bronchoscopic, יכולת איסוף נוזל מקומי הסמפונות האפיתל המצפים; הוא מנצל בדיקה בנדן סיבי פוליאסטר14. כאשר דרכי הנשימה דיסטלי נגישים, החללית הוא דחף החוצה הקצה נדן כדי לספוג את הנוזל אפיתל הסמפונות נוכח לומן הסמפונות. Bronchoscopic microsampling כבר בשימוש תסמונת מצוקה נשימתית חריפה14,15,16 ומחלת ריאות חסימתית כרונית17. אולם, באסטמה, בעיה קיימת היא כי המכשיר עלולה לגרום דימום עקב מחלה-induced השבריריות אפיתל, vascularization מוגבר. החלת טכניקת נוזלים שורות mucosal ההליך bronchoscopic microsampling עשויות להיות השלכות חשובים קלינית ביחס להבנת הפתופיזיולוגיה, וכן ניטור, בטיפול של חיזוי התוצאה של מספר אקוטי וכרוני ריאתי מחלות אצל ילדים ומבוגרים.
כל סוגי מגשרים תיאורטית ניתן למדוד באמצעות פלטפורמת מתכלה מולטיפלקס של מערכת מסחרי המשמש כאן (ראה את הטבלה של חומרים). הפלטפורמה מאפשרת כימות רגישות גבוהה ומדויקת של כל מתווך אשר ניתן להשיג זוג של נוגדנים חד-שבטיים החלים התפתחות מתכלה. פלטפורמה זו גם מביאה עמה ברמת דיוק גבוהה, פחות רגישות וריאציות pH, טמפרטורה, צמיגות נוזלים כדי להיות מנותח.
בעתיד מחקרים, שיהיה בעל ערך רב להרחיב את הפאנל הנוכחי של מתווכים חיסוניים למדידה, לדוגמה: פפטידים מיקרוביאלית; איגה הכולל וספציפיות; המגיבים שלב חריפה, כגון חלבון מגיב C; מגשרים השומנים, כגון פרוסטגלנדינים; מגשרים נוירולוגיות, כגון neurotrophic המוח-derived factor (BDNF). זה יכול לספק תצוגה מפורטת יותר של מהות מערכת התגובה הרירית באתר הגוף עם חשיפה נרחבת באוויר. המתווכים המוצע עשוי גם ניתן למדוד באמצעות יישוב immunoassays רגישות גבוהה כמותית, כגון הכיוונון הנוכחי, או על ידי יישוב או untargeted תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה - או כרומטוגרפיה נוזלית מסות (LC-MS)-מבוסס גליקומיקס טכניקות. הגישה השנייה כבר יושם במידה מסוימת בשיטת העיבוי והבל הפה, שבו יש מספר חסרונות מתודולוגיים ביחס הדוגמאות של biofluid18 שאינם לכאורה שורות mucosal הטכניקה נוזלים.
האורך דגימה מן התקופה neonatal לבגרות, כפי שבוצע במדגם2010 COPSAC, יגדל באופן ניכר את ההבנה שלנו של גורמים אימונולוגי בבסיס הקודם או מתנהג/ת עם מחלות דרכי הנשימה כגון אסטמה או אלרגיה. ממצאים כאלה עשוי להיות חשוב להתפתחות של הריפוי מיקוד endotypes מחלות ספציפיות וכדי החקירה של micronutrient, סמים מנגנוני הפעולה אקראי ניסויים קליניים.

הנוזל שורות mucosal של האף מפצה את החלק הנוזלי של מערכת הנשימה העליונה. זה מורכב של מטריצה מורכבת של מגשרים נגזר הגומלין בין האפיתל תאים חיסוניים המרכיבות את השורה הראשונה של הגנה מפני פולשים מיקרואורגניזמים. רירית האף הינו נגיש בקלות, ויש קשר פונקציונלי ו חזק בין האף של הסמפונות1. את התא הוא בעל עניין מיוחד ביחס למחלות דרכי הנשימה נפוצות בילדות, כגון אסטמה, קדחת השחת, אלא גם למגוון הפרעות נשימה אחרות נפוץ יותר מאוחר יותר בחיים.
כאן, אנו מתארים יישום שיטה מדגם ללא הפרעה הרירית רירית נוזל מתוך חלל האף באמצעות טכניקה המבוססת על נייר סינון, לא פולשנית, וכן הליך מיצוי הבאים, נהגה elute חלבון מבוססת analytes מהעיתונים סינון לפני כימות שלהם. טכניקה זו, לדוגמה, ניתן להשיג ויוו המערכת החיסונית חתימות של אנשים בריאים וגם אנשים עם מחלות נשימה שונות. יתר על כן, קיימת אפשרות לבחון חשיפות חשיבות עבור חתימה המערכת החיסונית ספציפיים וכן להעריך אם זה כמנבא או מתווך של התפתחות המחלה מאוחר יותר.
שורות mucosal נוזל שהושגו בעבר על ידי שטיפה של חלל האף2, אשר לעיתים קרובות לפניו מבחן אתגר האף, איפה אלרגן הוא הציג ברמות גבוהות כדי לעורר תגובה דלקתית של,3,4. עם זאת, טכניקת שטיפה של חלל האף הוא לא ריאלי אצל ילדים צעירים, מציגה גורם לדילול לא ידוע, אשר מבלבל את התוצאות, מתווך מדולל רמות יכול ליפול מתחת לגבול זיהוי של assay5. יתר על כן, בשל הגורם דילול לא ידוע, התגובות analyte נמדד מתוך הבדיקות אתגר האף אינן דומות בין אנשים, וכך להגביל את התועלת של טכניקת שטיפה של חלל האף במדגם הגדרת. לבסוף האתגר אלרגן ישימה רק במקצועות sensitized, אתגרים אחרים, כגון האתגר היסטמין, אינן רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית, ובכך לגרום השפעה התקרה על שחרור המתווך. בעיות אלה הם עקפו בטכניקת מבוססי-נייר סינון הציג אוסף נוזלים שורות mucosal, איפה בודדים הפרשת נוזלים ורמות analyte הגורמים היחידים המשפיעים השונות הבין-אישי.
במהלך ההליך החילוץ, analytes הן eluted מהעיתון מסנן לאחר התוספת של אמצעי אחסון זהים המאגר כדי כל הדגימות. זה מעדיף דומה שמחוץ דילול של כל הדגימות. מאגר החילוץ של אלבומין מבוססי תמיסת מלח מול משמש עבור השלב החילוץ; זה מאפשר הפקת מבוססי חלבונים מתווכים ומייצב חלבונים כדי להגביל דנטורציה במהלך ההקפאה עוקבות של חלבונים eluted לפני כמת. כדי למנוע השפלה חלבון במהלך שלב החילוץ, קוקטייל של מעכבי פרוטאז נוסף למאגר החילוץ.
היישום של טכניקות המאפשרות כימות של הפרעה, ויוו-מתווכים חיסוניים שנוצר באתרי הרירית הוא בעל חשיבות עליונה. ראשית, האתר הרירית מפצה אימונולוגי האיבר הגדול ביותר בגוף. שנית, המיקום האף הוא אתר ראשי של חשיפה לאוויר, קשורה באופן הדוק תא אימונולוגי הנשימה של הריאות1. שלישית, האפשרות של מדידות איבר חשוב זה עם שיטה לא פולשנית פותחת את האפשרות לספק שפע של מידע על ציר חשוב חיידק-החיסון אינטראקציה ביחס מחלה את דרכי הנשימה ובריאות. רביעית, יש הרבה יישומים אפשריים אחרים של טכניקה זו, כגון לימוד שינויים המקומיות אימונולוגי בניסויים אקראי, מבוקר של סמים, יסודות קורט.
אנחנו בתחילה ליישם את הטכניקה מחקרים פוטנציאליים קופנהגן על אסטמה במדגם2000 (COPSAC2000) ילדות, שבו קבענו את הפרופיל החיסונית של נוזל שורות mucosal בת 7 ילדים עם דלקת אלרגית לעומת פקדים בריא13. לאחר מכן, אנחנו הוחלו בהצלחה טכניקה זו האורך COPSAC2010 עוקבה ופרופילים דרכי הנשימה המוערך המערכת החיסונית 1 חודש, 2 שנים ולאחר 6 שנים של גיל ועל מופעים של תסמינים נשימתיים חריפה. תוצאות neonates בן חודש 1 הראו אגודות חשוב בין החתימה מערכת החיסון לבין חשיפה סביבתית מוקדמת-חיים7,8,9,10,11,12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1688">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Fibrous hydroxylatedpolyester sheets</td>
			<td style="width:103px;">Accuwik Ultra&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SPR0730</td>
			<td style="width:1084px;">Filter paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Milliplex Assay Buffer&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>L-AB</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">low-protein binding storage plates&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CLS8161</td>
			<td>Plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:103px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11873580001</td>
			<td>complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Reader of multi-spot plates</td>
			<td style="width:103px;">Mesoscale</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Sector imager 6000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Assays&#160;</td>
			<td style="width:103px;">Mesoscale</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-&#946;1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

noninvasive sampling of mucosal lining fluid for the quantification of in vivo upper airway immune-mediator levels

פרוטוקול זה מתאר דגימה לא פולשנית של דרכי הנשימה העליונות ללא הפרעה של שורות mucosal נוזל. זה גם פרטי ההליך החילוץ השתמשו לפני הניתוח של מתווכים חיסוניים בתוך נוזל eluates לצורך המחקר של דרכי הנשימה אקטואלי המערכת החיסונית החתימה, ללא צורך נהלים גירוי (משמש לעתים קרובות על ידי טכניקות אחרות). הנוזל שורות mucosal נדגמים רצועת נייר סינון הממוקמת בחלקו הקדמי של נחותים turbinate ושמאלה למשך 2 דקות הספיגה. Analytes הם eluted מהעיתון מסנן, eluates חלבון מבוססת שחולצו הם נותחו על ידי חומרים מבוסס electrochemiluminescence, המאפשר כימות רגישות גבוהה של level נמוך וגבוה analytes במדגם זהה. מדדנו את רמות ויוו 20 מתווכים חיסוניים שנבחרו מראש הקשורים ספציפית החיסונית איתות המסלולים ב רירית דרכי הנשימה העליונות, אבל הטכניקה אינה מוגבלת זה לוח ספציפי או דגימה באתר. השיטה יושמה לראשונה אצל ילדים בת 7-ממחקרים פוטנציאליים קופנהגן על אסטמה במדגם2000 (COPSAC2000) ילדות עם קדחת השחת. הוא שימש לאחר מכן במדגם האורך COPSAC2010 לידה, שנדגמו 1 חודש, 2 שנים ולאחר 6 שנים של גיל ועל מופעים של תסמינים נשימתיים חריפה. אנחנו בהצלחה שהושג וניתח דגימות 620 (89%) של 700 ילדים בן חודש 1; כמה דוגמאות היו מתחת לגבול זיהוי assay (המדווח החציון (הבין-הרביעון טווח (IQR)). מספר דוגמאות מתחת לגבול זיהוי (כלומר מ-0 עד כדי להגדיר עבור הגבול התחתון של זיהוי) עבור כל מתווך היה 29 (7.25-119.5). טכניקה זו מאפשרת כימות של vivo בתוך דרכי הנשימה הרירית המערכת החיסונית הפרופיל מלידה, יכול להיות מיושם longitudinally, שניתן להחיל על מחקרים על ההשפעה של גנטיקה, חשיפות סביבתיות-ונערותו פתופיזיולוגיה, endotyping, ניטור של מחלות נשימה, ועל פיתוח והערכה של הריפוי.

Baseline Characteristics of the Airway Immune Profiles: 
Complete data on upper airway mucosal immune mediator levels at 1 month of age was obtained in 620 (89%) of the 700 children enrolled in the COPSAC2010 cohort. Ten neonates were enrolled before the technique was established, and 19 did not attend the 1-month visit. Additionally, 47 samples were excluded because they were extracted and measured in another laboratory used in a pilot study, and 4 samples were lost in transportation (See the study flowchart, Figure 1). Baseline characteristics for the cohort are shown in Table 1.
Most of the mediators had a low level of detection &#60;10 pg/mL (IL-1&#946;, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, TGF-&#946;1, IFN-&#947;, TNF-&#945;, CXCL8, CCL13, CCL4, and CCL17), whereas 5 had a detection level &#62;10 pg/mL (CXCL10, CCL2, CCL11, CCL26, and CCL22) (Table 2). The median (IQR) number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5) (Table 2). IFN-&#947; levels were below the lower detection limit in almost half (46%) of the samples, whereas CXCL8 and IL-1&#946; levels were detectable in all samples, and TGF-&#946;1, CCL4, and TNF-&#945; levels were below the lower detection limit in &#60;1% of the samples. One of the mediators, TSLP, was only detected in 2% of samples, and TSLP data was therefore not used for consecutive data analyses. A strong multicollinearity was evident for the 20 detected immune mediator levels, which is visualized in a heatmap (Figure 2).
The Influence of Airway Bacteria and Viruses in Neonates: 
We previously found an association between the airway immune profile and colonization in specific airway bacteria sampled concomitantly with mucosal lining fluid at 1 month of age. An upregulated Type 1- and Type 17-based airway immune profile was observed in neonates colonized with intracellular bacteria, whereas the presence of extracellular bacteria was associated with a Type 17-based profile7. We have also shown previously that the presence of picornavirus was associated with an upregulated profile comprised mainly of Type 1 immune mediators (Figure 3)11. These findings were obtained in children without respiratory symptoms, (i.e.&#160;asymptomatic) on the day of sampling, suggesting an immune-triggering role of colonizing bacteria and viruses in the earliest part of life.
The Influence of Pre- and Perinatal Exposure: 
We have further observed an association between the level of immune mediators at 1 month of age and a maternal history of atopy8, where children born to atopic mothers displayed an overall lower level of immune mediators than children of non-atopic mothers. We subsequently identified an association between the presence of siblings in the household at birth and a specific Type 1/Type 17-directed mucosal immune response, with evidence of this being related to an in utero immune priming effect, as the immune response was inversely correlated to the time since last childbirth (Figure 4)12. Further evidence for in utero immune priming effects was determined from an association between maternal H1N1 influenza vaccination status and the upregulation of TGF-&#946;1 levels in the neonatal airway10.
Evidence for Micronutrient Mechanisms of Action: 
In COPSAC2010, we performed a high-dose versus standard-dose vitamin D intervention trial during pregnancy, which showed an almost one-fourth reduction in the risk of asthma/recurrent wheeze in the offspring at 3 years of age9. Utilizing the measured neonatal airway immune profile, we observed that children born to mothers receiving high-dose vitamin D, compared to standard-dose, were characterized by an upregulation of specific mediators (IL-12p70, IL-13, CCL17, TGF-&#946;1, and IL-2), suggesting that vitamin D promotes an anti-bacterial defense system different from that induced by bacteria, virus, siblings, and maternal atopy9 (Figure 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55800/55800fig1.jpg" /> 
Figure 1: Study Group Flowchart. Complete data on upper airway mucosal immune mediator levels at 1 month of age was obtained in 620 (89%) of the 700 children enrolled in the COPSAC2010 cohort. Ten neonates were enrolled before the technique was established, and 19 did not attend the 1-month visit. Additionally, 47 samples were excluded because they were extracted and measured in another laboratory used in a pilot study, and 4 samples were lost in transportation. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55800/55800fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55800/55800fig2.jpg" /> 
Figure 2: Heatmap of Pairwise Correlations between the 20 Cytokines and Chemokines. The red color represents a positive correlation and the blue color represents a negative correlation. The number inside every square denotes the correlation between two mediators. The figure shows that all mediators are positively correlated. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55800/55800fig2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55800/55800fig3.jpg" /> 
Figure 3: The Presence of Picornavirus is Associated with an Upregulated Profile Comprised Mainly of Type 1 Immune-mediators. This figures shows the Geometric Mean Ratios (GMR), with 95% Confidence Intervals (CI), of airway mediators in neonates with/without the concomitant presence of picornavirus, measured at 1 month of age. This figure has been modified from Wolsk et al.11, with permission. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55800/55800fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55800/55800fig4.jpg" /> 
Figure 4: Effects of the Presence of Siblings in the Household at Birth. A) Airway immune signature (PC1) in neonates with and without siblings at birth. B) Scatterplot showing an inverse association between the airway immune signature (PC1) and time since previous birth for children with siblings. This figure has been modified from Wolsk et al.12, with permission. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55800/55800fig4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55800/55800fig5.jpg" /> 
Figure 5: Principal Component Analysis Biplot of the Effect of Vitamin D Intervention in the COPSAC2010 Cohort on the Airway Immune Mediator Level at 1 Month of Age. Each point represents a sample, colored according to the intervention allocation of the child. The loadings (i.e.&#160;impact) of the original variables on the principal components are shown as arrows. The intervention resulted in a significantly upregulated immune profile in PC1, which is positively correlated with all immune mediators. This figure has been modified from Chawes et al.9, with permission. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55800/55800fig5large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>N = 620 (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maternal atopy</td>
			<td>334 (54)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Caucasian</td>
			<td>29 (5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesarean section</td>
			<td>134 (22)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics in 3rd trimester&#160;</td>
			<td>126 (20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siblings in the home at birth</td>
			<td>358 (58)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pets (cat and/or dog) in the home</td>
			<td>216 (35)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fully-breastfed at 1 month</td>
			<td>570 (92)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No smoking in 3rd trimester</td>
			<td>597 (96)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No alcohol consumption in 3rd trimester</td>
			<td>591 (95)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Family income &#62;100.000 euro/year</td>
			<td>89 (14)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gestational age &#62;37 weeks</td>
			<td>601 (97)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apgar score &#62;7 at 5 min</td>
			<td>591 (95)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1: Baseline Characteristics of the COPSAC2010 Cohort.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mediator</td>
			<td>Detection limit pg/ml</td>
			<td>&#60; Detection limit N (%)</td>
			<td>Median pg/ml</td>
			<td>IQR&#160;pg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-12p70</td>
			<td>1.4</td>
			<td>102 (16%)</td>
			<td>10.80</td>
			<td>4.99 - 22.22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCL10</td>
			<td>31</td>
			<td>8 (1%)</td>
			<td>1787.78</td>
			<td>722.8 - 5423</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#947;</td>
			<td>4.1</td>
			<td>285 (46%)</td>
			<td>20.14</td>
			<td>7.63 - 48.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945;</td>
			<td>0.6</td>
			<td>5 (&#60;1%)</td>
			<td>28.33</td>
			<td>10.06 - 88.55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL4</td>
			<td>4.3</td>
			<td>4 (&#60;1%)</td>
			<td>194.90</td>
			<td>71.22 - 655.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL2</td>
			<td>16.0</td>
			<td>9 (1%)</td>
			<td>256.11</td>
			<td>134.4 - 468.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL13</td>
			<td>2.8</td>
			<td>13 (2%)</td>
			<td>15.17</td>
			<td>10.35 - 22.80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>1.1</td>
			<td>196 (32%)</td>
			<td>1.37</td>
			<td>0.42 - 2.86</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-5</td>
			<td>1.2</td>
			<td>172 (28%)</td>
			<td>3.72</td>
			<td>1.42 - 8.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-13</td>
			<td>2.7</td>
			<td>48 (8%)</td>
			<td>14.49</td>
			<td>6.84 - 27.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL11</td>
			<td>22.0</td>
			<td>39 (6%)</td>
			<td>139.54</td>
			<td>85.00 &#8211; 236.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL26</td>
			<td>45.0</td>
			<td>252 (41%)</td>
			<td>164.93</td>
			<td>56.33 - 350.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL17</td>
			<td>7.2</td>
			<td>90 (15%)</td>
			<td>41.30</td>
			<td>26.83 - 60.68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL22</td>
			<td>25.0</td>
			<td>78 (13%)</td>
			<td>398.31</td>
			<td>243.4 - 575.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1&#946;</td>
			<td>0.4</td>
			<td>0 (0%)</td>
			<td>225.49</td>
			<td>50.07 - 1169</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-17A</td>
			<td>1.5</td>
			<td>285 (46%)</td>
			<td>1,480</td>
			<td>0.43 - 4.79</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCL8</td>
			<td>3</td>
			<td>0 (0%)</td>
			<td>19465</td>
			<td>6321 - 38274</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;1</td>
			<td>5.2</td>
			<td>1 (&#60;1%)</td>
			<td>28.66</td>
			<td>20.76 - 39.50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-10</td>
			<td>1</td>
			<td>13 (2%)</td>
			<td>22.32</td>
			<td>9.28 - 49.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>1.5</td>
			<td>19 (3%)</td>
			<td>18.72</td>
			<td>8.29 - 37.33</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 2: Mucosal Lining Fluid Samples from 1-month-old Neonates from the COPSAC2010 Cohort. Most of the mediators had a low level of detection &#60;10 pg/mL (IL-1&#946;, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, TGF-&#946;1, IFN-&#947;, TNF-&#945;, CXCL8, CCL13, CCL4, and CCL17), whereas 5 had a detection level &#62;10 pg/mL (CXCL10, CCL2, CCL11, CCL26, and CCL22).

Watch this Scientific Journal Video about Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels at JoVE.com

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

פרוטוקול זה מתאר שיטה לא פולשנית עבור הדגימה של נוזל ללא הפרעה של שורות mucosal של דרכי הנשימה העליונות. זה יכול לשמש כדי לבצע כימות של ויוו רמות של חלבונים מתווכים, כגון ציטוקינים, נוגדנים, המקצועות לכל הגילאים.

לא פולשנית דגימה של נוזל שורות Mucosal עבור כימות של In Vivo דרכי הנשימה העליונות החיסון-מגשרת רמות

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

noninvasive-sampling-mucosal-lining-fluid-for-quantification-vivo

Google

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Immunology and Infection

Unit 1

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Upper Respiratory Tract Infections

SCIENTISTS IN ACTION

10.1K Views.  University of Copenhagen. פרוטוקול זה מתאר שיטה לא פולשנית עבור הדגימה של נוזל ללא הפרעה של שורות mucosal של דרכי הנשימה העליונות. זה יכול לשמש כדי לבצע כימות של ויוו רמות של חלבונים מתווכים, כגון ציטוקינים, נוגדנים, המקצועות לכל הגילאים.

Video: Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

במבחנה Coculture Assay כדי להעריך פתוגן המושרה נדידת נויטרופילים טרנס אפיתל

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

הביתור מולדת איתות חיסון בהתחמקות ויראלי של ציטוקין ייצור

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Intranasal המינהל של החיסונים שפעת רקומביננטי במודלי כימרי עכבר ללמוד חסינות רירית

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the correct determination of a peptide&#39;s concentration, it should be stable during blood processing. However, this is not the case for several peptides which are quickly degraded by endogenous peptidases. Recently, we developed a blood processing method employing Reduced temperatures, Acidification, Protease inhibition, Isotopic exogenous controls and Dilution (RAPID) for the use in rats. Here, we have established this technique for the use in humans and investigated recovery, molecular form and circulating concentration of food intake regulatory hormones. The RAPID method significantly improved the recovery for 125I-labeled somatostatin-28 (+39%), glucagon-like peptide-1 (+35%), acyl ghrelin and glucagon (+32%), insulin and kisspeptin (+29%), nesfatin-1 (+28%), leptin (+21%) and peptide YY3-36 (+19%) compared to standard processing (EDTA blood on ice, p&#160;&#60;0.001). High performance liquid chromatography showed the elution of endogenous acyl ghrelin at the expected position after RAPID processing, while after standard processing 62% of acyl ghrelin were degraded resulting in an earlier peak likely representing desacyl ghrelin. After RAPID processing the acyl/desacyl ghrelin ratio in blood of normal weight subjects was 1:3 compared to 1:23 following standard processing (p&#160;= 0.03). Also endogenous kisspeptin levels were higher after RAPID compared to standard processing (+99%, p&#160;= 0.02). The RAPID blood processing method can be used in humans, yields higher peptide levels and allows for assessment of the correct molecular form.

The RAPID blood processing method can be used in humans and yields higher peptide levels as well as allows for assessment of the correct molecular form. Therefore, this method will be a valuable tool in peptide research.

שיטה מהירה עבור עיבוד דם כדי להגדיל את התשואה של רמות הפפטיד פלזמה בדם אנושי

Research in the field of food intake regulation is gaining importance. This often includes the measurement of peptides regulating food intake. For the ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We demonstrate the procedure for preparing H. influenzae inoculum, intra-tracheal instillation of H. influenzae into the lung, collection of broncho-alveolar lavage fluid (BALF), analysis of immune cells in the BALF, and RNA isolation for differential gene expression analysis. This procedure can be used to study the lung inflammatory response to any bacteria, virus or fungi. Direct tracheal instillation is mostly preferred over intranasal or aerosol inhalation procedures because it more efficiently delivers the bacterial inoculum into the lower respiratory tract with less ambiguity.

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

מנהל Intra-קנה נשימה של<em&gt; אינפלואנזה המופילוס</em&gt; בעכברי מודל לחקר Airway דלקת

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

שיטת הדגימה ספוגית לצורך זיהוי של norovirus האדם על משטחים

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, a significant stress response is induced during gastrointestinal transit and upon bile exposure, a normal component of human digestion. To overcome the bactericidal effects of bile, many enteric pathogens form a biofilm hypothesized to permit survival when transiting through the small intestine. Here we present methodologies to define biofilm formation through solid-phase adherence assays as well as extracellular polymeric substance (EPS) matrix detection and visualization. Furthermore, biofilm dispersion assessment is presented to mimic the analysis of events triggering release of bacteria during the infection process. Crystal violet staining is used to detect adherent bacteria in a high-throughput 96-well plate adherence assay. EPS production assessment is determined by two assays, namely microscopy staining of the EPS matrix and semi-quantitative analysis with a fluorescently-conjugated polysaccharide binding lectin. Finally, biofilm dispersion is measured through colony counts and plating. Positive data from multiple assays support the characterization of biofilms and can be utilized to identify bile salt-induced biofilm formation in other bacterial strains.

This protocol enables the reader to analyze bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens using a multifaceted approach to capture the dynamic nature of bacterial biofilms by assessing adherence, extracellular polymeric substance matrix formation, and dispersion.

מלח מרה-induced ביופילמים בתוך המעית פתוגנים: טכניקות וכימות

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Quantification of Atherosclerosis in Mice

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic inflammatory disease. Experimental atherosclerosis studies have elucidated the role of cholesterol and inflammation in the disease process. This has led to successful clinical trials with pharmaceutical agents that reduce clinical manifestations of atherosclerosis. Careful and well-controlled experiments in mouse models of the disease could further elucidate the pathogenesis of the disease, which is not fully understood. Standardized lesion analysis is important to reduce experimental variability and increase reproducibility. Determining lesion size in aortic root, aortic arch, and brachiocephalic artery are common endpoints in experimental atherosclerosis. This protocol provides a technical description for evaluation of atherosclerosis at all these sites in a single mouse. The protocol is particularly useful when material is limited, as is frequently the case when genetically modified animals are being characterized.

Murine models of atherosclerosis are useful tools to investigate pathogenic pathways on a molecular level, but require standardized quantification of lesion development. This protocol describes an optimized method to determine lesion size in the major arterial vessels including the aortic root, aortic arch, and brachiocephalic artery.

קוונפיקציה של טרשת עורקים בעכברים

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic ...

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal immunity, because they can model host-pathogen interactions in the tissue. While isolated cells derived from tissues were the first cell culture model, their use has been neglected because tissue can be hard to obtain. In the present protocol, we explain how to easily process and culture tonsillar mononuclear cells (TMCs) from healthy human tonsils to study innate immune responses upon activation, mimicking viral infection in mucosal tissues. Isolation of TMCs from the tonsils is quick, because the tonsils barely have any epithelium and yield up to billions of all major immune cell types. This method allows detection of cytokine production using several techniques, including immunoassays, qPCR, microscopy, flow cytometry, etc., similar to the use of peripheral mononuclear cells (PBMCs) from blood. Furthermore, TMCs show a higher sensitivity to drug testing than PBMCs, which needs to be considered for future toxicity assays. Thus, ex vivo TMCs cultures are an easy and accessible mucosal model.

In the present protocol, we explain how to easily process and culture tonsillar mononuclear cells from healthy humans undergoing partial surgical tonsillectomy to study innate immune responses upon activation, mimicking viral infection in mucosal tissues.

בידוד של התאים המוננובית מונמונומנט ללמוד Ex Vivo מולדת תגובות החיסונית ברקמת הלימפה של האדם Mucosal

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response without any interference such as low protein expression, enzyme inactivity, or structural changes. This makes APN an attractive candidate in the development of vaccines that selectively target the mucosal epithelium. Previous studies have shown that APN is a receptor protein for both enterotoxigenic Escherichia coli (E. coli) F4 and transmissible gastroenteritis virus. Thus, APN shows promise in the development of antibody-drug conjugates or novel vaccines based on APN-specific antibodies. In this study, we compared production of APN-specific monoclonal antibodies (mAbs) using traditional hybridoma technology and recombinant antibody expression method. We also established a stably transfected Chinese hamster ovary (CHO) cell line using pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN and an E. coli expression BL21(DE3) strain harboring the pET28a (+)-rAbs-APN vector. The results show that antibodies expressed in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO cells and mAbs produced using hybridomas could recognize and bind to the APN protein. This provides the basis for further elucidation of the APN receptor function for the development of therapeutics targeting different APN-specific epitopes.

The recombinant antibody protein expressed in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO cells and monoclonal antibodies produced using traditional hybridoma technology can recognize and bind to the porcine aminopeptidase N (APN) protein.

ייצור נוגדנים חד-שבטיים המכוונים לאמינופפטידאז N באפיתל רירית המעי החזירי

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response ...