المؤلفين ليس لديهم اعترافات.

وقد أجريت رعاية وعلاج الحيوانات في هذا الإجراء وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسي في جامعة كولورادو. 1. إعداد الحلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وتخزين جميع الحلول في درجات الحرارة المناسبة، كما هو مبين في الجدول 1 . </li></ol> 2. طلاء الآبار والشرائح ملاحظة: الخلايا العصبية لا تلتزم بشكل جيد إلى الأسطح البلاستيكية أو الزجاج. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوم واحد من عزل الخلايا العصبية، معطف آبار لوحة معقم 24-ثقافة جيدا مع 0.5 مل من بولي- D- يسين (بدل، الجدول 2 ) وتركها في غطاء تدفق الصفحي O / N. ملاحظة: الطريقة المفضلة هي استخدام لوحات 24-جيدا ولطلاء فقط آبار مركز، والتبخر من الآبار الطرفية يميل إلى أن يكون أكثر تسارعا ويؤدي إلى نتائج غير متناسقة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن وضع الشرائح الزجاجية داخل الآبار قبل to طلاء. الخلايا العصبية سوف نعلق على الشرائح الزجاجية المغلفة ويمكن إزالتها في وقت لاحق لمزيد من التصوير المجهري . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم العزلة، وإزالة بدل من الآبار. يغسل بالماء المعقم لبضع دقائق قبل إزالة أي ماء متبقي والسماح لها لتجف لمدة 1 ساعة (انظر أدناه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التجفيف، معطف الشرائح مع لامينين ( الجدول 2 ). ملاحظة: ما يقرب من 10 ميكرولتر من لامينين (10 ميكروغرام / ميكرولتر) ما يكفي لمعطف كل بئر من لوحة معقم 24 جيدا. يتم خلط هذا مع 340 ميكرولتر من المتوسطة (الحجم الكلي: 350 ميكرولتر) من أجل تغطية جيدا جيدا. السماح لهذا الجلوس لمدة 2 ساعة في رت في غطاء محرك السيارة والثقافة ثم نضح قبل طلاء الخلايا. </li></ol> 3. حصاد الحبل الشوكي ملاحظة: ينبغي تعقيم جميع الصكوك (135 درجة مئوية و 30 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 4 × 7 دقائق دورات) للعقم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء 1-3 من العمر الجراء الماوس C57BL / 6 في غرفة مع إيسوفلوران. انتظر30 ثانية بعد توقف الحركة وقرصة الساق لتأكيد عدم وجود استجابة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الرأس من الجسم باستخدام مقص، مع الجرو في وضعية العرض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استقرار الساقين الخلفيتين أو الذيل والذراعين على طاولة الإجراء، مع الجانب الظهري التي تواجه المستخدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الجلد قبالة باستخدام مقص القزحية المنحنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الحبل الشوكي من منطقة أسفل الظهر فقط فوق الوركين والمضي قدما في قطع جانبي الصدر لفصلها عن الجسم. ملاحظة: وهذا يتطلب تشريح دقيق من الحبل الشوكي من الأجهزة الحشوية لتجنب الضرر غير المقصود لأعضاء أخرى ( الشكل 1A ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بالتتابع لمدة 10 ثانية في 3 × 10 سم أطباق بتري تحتوي على 5 مل من 0.2 ميكرون مرشح تعقيم الفوسفات مخزنة المالحة (بس) لإزالة الأنسجة الزائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج إبرة 22 G والمحاقن مليئة 5 مل من برنامج تلفزيوني مرشح تعقيم في نهاية الذيلية من العمود الفقري ودافق كرانيالي، والسماح الحبل رس الخروج إلى طبق بتري الرابع ( الشكل 1B ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الحبل الشوكي في أنبوب 15 مل مع 5 مل من هبغ ( الجدول 1 ) على الجليد. استخدام الرعاية لتجنب سحق الحبل الشوكي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات 3،1-3،8 لكل الجرو في القمامة. ملاحظة: من الناحية المثالية، ينبغي أن تستغرق هذه العملية أقل من 30 دقيقة في الحبل الشوكي لضمان عزل الخلايا العصبية صحية. </li></ol> 4. عزل الخلايا العصبية ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوة التالية في غطاء تدفق الصفحي. ومن المتوقع الألفة مع تقنية معقمة الأساسية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأنسجة المفرمة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ أنبوب يحتوي على الحبل الشوكي ويهز بخفة لتعليق الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب الأنسجة من أنبوب إلى 60 ملم طبق بيتري الزجاج والنرد مع شفرة حلاقة لخلق قطع غرامة ~ 0.5 ملم في الحجم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأنسجة مع ماصة واسعة تحمل في أنبوب 15 مل تحتوي على 5 مل من هبغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضعه في30 درجة مئوية حمام الماء لمدة 30 دقيقة للسماح للخلايا أن تتوازن في هذه الدرجة. إبقاء الخلايا على شاكر بما فيه الكفاية للسماح لهم أن يتم تعليقها في السائل. ملاحظة: يتم هذه الخطوة لتجنب صدمة الخلايا عند نقل من الجليد إلى المتوسطة الهضم. الحفاظ على الخلايا في 30 درجة مئوية يساعد على تقليل موت الخلايا المرتبطة مع زيادة التمثيل الغذائي على خلاف ذلك عند 37 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وسط الهضم ( الجدول 1 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد التدرج الكثافة (الجدول 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد كل من 4 طبقات في 4 أنابيب منفصلة 15 مل، على النحو المبين في الجدول 1 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من كل طبقة إلى أنبوب 15 مل جديد. تبدأ مع الطبقة 1 في الجزء السفلي وتسلسل إضافة حتى الوصول إلى الطبقة 4 في الأعلى. تجنب إزعاج الطبقات أثناء إضافة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل لوحات المغلفة بدل من الخطوة 2.2. اغسل بالماء المعقم لبضع دقائق قبل إزالة أي ماء متبقي ومما يسمح لهم لتجف لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأنسجة إلى المتوسطة الهضم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأنبوب الذي يحتوي على الأنسجة من حمام الماء شاكر في 30 درجة مئوية والسماح لها لتسوية لبضع دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أنبوب المتوسطة الهضم من 37 درجة مئوية حمام الماء ونضح في حقنة ليور قفل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح قبالة هبغ الزائدة من الأنسجة التي تحتوي على أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ليور قفل 0.2 ميكرون مرشح على حقنة لإضافة المتوسطة الهضم إلى أنبوب يحتوي على الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب في 30 درجة مئوية حمام الماء لمدة 30 دقيقة. إبقاء الخلايا تهز ما يكفي للسماح لهم أن يتم تعليقها في السائل. ملاحظة: من المهم عدم إبقاء الخلايا في وسط الهضم لفترة طويلة جدا أو للسماح لدرجة الحرارة الحصول على مرتفعة جدا، مما قد يؤدي إلى الهضم المفرط ويؤدي إلى أن تصبح الأنسجة معلقة في خليط هلامي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال هذه الفترة، معطف لامينين كما هو الحال في الخطوة 2.3. </li> &lt;لي&gt; أداء تريتوراتيون ( أي فصل الخلايا من الأنسجة). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأنبوب من هز 30 درجة مئوية حمام الماء والسماح لها لتسوية لبضع دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الزائد الهضم المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق الأنسجة في 2 مل من هبغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة ضيقة تتحمل، تريتورات 10X لمدة 45 ثانية. ملاحظة: هذا هو على الارجح خطوة واحدة الأكثر أهمية ويمكن أن تقلل بشكل كبير من العائد إذا لم يتم بشكل صحيح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الأنسجة في ماصة وفراغ محتويات على الفور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجنب إدخال الهواء، كما أنها سوف تقلل بشكل كبير من العائد قابلة للحياة. ملاحظة: ماصة مثالية هو ماصة الزجاج 9 &quot;، وينبغي أن يكون طرف ماصة النار مصقول لتلطيف الأسطح الخام، وينبغي بعد ذلك سيليكونيزد عن طريق التنسيب في حل 01:20 من ثنائي كلوروديميثيلزيلان (دمدكس) في الكلوروفورم واليسار O / N. وينبغي بعد ذلك إزالة ماصة ويسمح للهواء الجاف، وبعد ذلك، فإنه قهولد يكون تعقيمها للتعقيم. الحذر: دمدكس والكلوروفورم قابلة للاشتعال للغاية، وينبغي أن يتم السيليكونية في غطاء الدخان. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح أعلى 2 مل من طاف ووضعه في أنبوب 15 مل جديد المسمى &quot;جمع&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات 4.7.3-4.7.5 مرتين إضافيتين (يجب أن يكون أنبوب جمع الخلايا 6 مل بنهاية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ببطء محتويات أنبوب جمع في أنبوب التدرج أعدت في الخطوة 4.2، وتجنب تعطيل التدرج. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند هذه النقطة، إزالة المتوسطة نيوروباسال أعدت سابقا ( الجدول 1 ) من الثلاجة والسماح لها لتدفئة في حمام 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية الخلايا العصبية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي أنبوب التدرج لمدة 15 دقيقة في 800 x ج و 22 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الطبقة المطلوبة (ق) مع ماصة ( الشكل 2 ) ومكان في أنبوب 15 مل جديد. للحصول على أعلى النقاء العصبية( أي أكثر من 90٪)، وجمع الطبقة 3. للحصول على مزيد من المحصول مع أقل نقاء ( أي &gt; 70-80٪)، وجمع طبقات 2 و 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع التدرج الكثافة بإضافة 5 مل من هبغ إلى الطبقات التي تم جمعها حديثا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 2 دقيقة عند 22 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف، إعادة تعليق في 5 مل من هبغ، ونفض الغبار بيليه لتعليق الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في لمدة 2 دقيقة 200 x ج في 22 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف، ريسوسبيند في 3 مل من المتوسطة العصبية، ونفض الغبار بيليه ل ريسوسبيند الخلايا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ 10 ميكرولتر من الحل، والآن مع خلايا في المتوسطة العصبية، وتخلط مع 10 ميكرولتر من الأزرق تريبان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان 10 ميكرولتر من هذا الخليط في غرفة العد الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام غرفة العد الزجاج القياسية، عد عدد الخلايا في كل من أربعة 4 × 4 الأرباع. إضافة جميع الخلايا عد (ن)، متعددةمن خلال 2 (عامل التخفيف)، وتقسيم بنسبة 4 (عدد من الأرباع عد)، تتضاعف من قبل 3 (حجم الوسط العصبي القاعدي)، وتضاعف من قبل 10 4 للحصول على تركيز الخلايا في الخلايا / مل. <img alt="معادلة" src="/files/ftp_upload/55856/55856eq0.jpg" /></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور الخلايا على لوحات الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع تعليق الخلية إلى 300،000 خلية في 1 مل من المتوسطة العصبية. ملاحظة: استنادا إلى تركيز الخلايا التي تم الحصول عليها في الخطوات المذكورة أعلاه، يضاف المتوسطة العصبية إضافية للحصول على تركيز النهائي من 3 * 10 5 خلايا / مل. المعادلة هي C 1 V 1 = C 2 V 2 ، حيث C 1 هو التركيز الأولي للخلايا التي تم الحصول عليها من الحصاد؛ V 1 هو 3 مل. و C 2 هو 3 * 10 5 خلايا / مل، كما نوقش أعلاه. يتم حل المعادلة ل V 2 . إضافة حجم المتوسطة العصبية اللازمة لجعل الحجم الكلي للخلايا في حل يساويV 2 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يهز بلطف لتوزيع الخلايا في حل وإضافة 1 مل لكل بئر في لوحات 24-جيدا المغلفة. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Qayumi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+model+for+investigation+of+spinal+cord+injury+caused+by+aortic+cross-clamping.">Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping.</a> J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).</li><li>Fang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+preconditioning+protects+against+spinal+cord+ischemia-reperfusion+injury+in+rabbits+by+attenuating+blood+spinal+cord+barrier+disruption.">Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption.</a> Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).</li><li>Taira, Y., Marsala, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+proximal+arterial+perfusion+pressure+on+function,+spinal+cord+blood+flow,+and+histopathologic+changes+after+increasing+intervals+of+aortic+occlusion+in+the+rat.">Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat.</a> Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li><li>Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocols+for+the+simultaneous+preparation+of+primary+neuronal+cultures+of+the+neocortex,+hippocampus+and+cerebellum+from+individual+newborn+(P0.+5)+C57Bl/6J+mice.">Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0. 5) C57Bl/6J mice.</a> J Neurosci Methods. 149 (2), 110-120 (2005).</li><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+neurons+and+neurospheres.">Isolation and culture of adult neurons and neurospheres.</a> Nat Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Res. 126 (3), 397-425 (1977).</li><li>Graber, D. J., Harris, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+culture+of+spinal+motor+neurons+from+rat+embryos.">Purification and culture of spinal motor neurons from rat embryos.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (4), 319-326 (2013).</li><li>Anderson, K. N., Potter, A. C., Piccenna, L. G., Quah, A. K., Davies, K. E., Cheema, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+motor+neurons+from+the+newborn+mouse+spinal+cord.">Isolation and culture of motor neurons from the newborn mouse spinal cord.</a> Brain Res Prot. 12 (3), 132-136 (2004).</li><li>Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocols+for+isolation+of+primary+motor+neurons,+astrocytes+and+microglia+from+embryonic+mouse+spinal+cord.">Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 163 (1), 111-118 (2007).</li><li>Brewer, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal,+a+new+serum-free+medium+combination.">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).</li><li>Fang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+preconditioning+protects+against+spinal+cord+ischemia-reperfusion+injury+in+rabbits+by+attenuating+blood+spinal+cord+barrier+disruption.">Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption.</a> Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).</li><li>Su, M., Zhong, W., Ren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+protection+of+reseveratrol+against+spinal+cord+ischemic-reperfusion+injury+in+rats.">Dose-dependent protection of reseveratrol against spinal cord ischemic-reperfusion injury in rats.</a> Trop J Pharm Res. 15 (6), 1225-1233 (2016).</li><li>Haapanen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+ischemic+preconditioning+protects+the+spinal+cord+against+ischemic+insult:+An+experimental+study+in+a+porcine+model.">Remote ischemic preconditioning protects the spinal cord against ischemic insult: An experimental study in a porcine model.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 151 (3), 777-785 (2016).</li><li>Conrad, M. F., Ye, J. Y., Chung, T. K., Davison, J. K., Cambria, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+complications+after+thoracic+aortic+surgery:+long-term+survival+and+functional+status+varies+with+deficit+severity.">Spinal cord complications after thoracic aortic surgery: long-term survival and functional status varies with deficit severity.</a> J Vasc Surg. 48 (1), 47-53 (2008).</li><li>Wong, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+spinal+cord+deficits+after+thoracoabdominal+aortic+aneurysm+repair.">Delayed spinal cord deficits after thoracoabdominal aortic aneurysm repair.</a> Ann Thorac Surg. 83 (4), 1345-1355 (2007).</li><li>Freeman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-2+agonist+attenuates+ischemic+injury+in+spinal+cord+neurons.">Alpha-2 agonist attenuates ischemic injury in spinal cord neurons.</a> J Surg Res. 195 (1), 21-28 (2015).</li><li>Freeman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+protection+via+alpha-2+agonist-mediated+increase+in+glial+cell-line-derived+neurotrophic+factor.">Spinal cord protection via alpha-2 agonist-mediated increase in glial cell-line-derived neurotrophic factor.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 149 (2), 578-586 (2015).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أية إفصاحات.

هذه التقنية تسمح للثقافة موثوق بها من الخلايا العصبية الحبل الشوكي. بمجرد تحقيق الكفاءة في هذه التقنية، يستغرق حوالي 3.5 ساعة لإكمال. كنا قادرين على تنفيذ العزلة من الخلايا العصبية من 2 ليترز منفصلة (16 الفئران المجموع) في حوالي 4 ساعات. الخطوة الرئيسية في الجدوى هو أن تك...

<html> فهم أمراض الحبل الشوكي يتطلب استخدام نماذج مختلفة، سواء على المستويات المجهرية والميكروسكوبية. وتستخدم النماذج الحيوانية الكبيرة والصغيرة 1 ، 2 ، 3 في التحقيقات في الجسم الحي من مرض الحبل الشوكي والإصابات. في حين دراسة هذه القضايا في الجسم الحي له مزاياه، وتحليل الحبل الشوكي يقتصر على كامل جنون الحبل الشوكي أو أقسام الأنسجة 4 . هذا يخلق بعض الغموض عند محاولة عزل ردود محددة والأهداف في الحبل الشوكي بين الخلايا العصبية المقيمين والدبقية المحيطة بها. زيادة توافر الفئران التلاعب وراثيا يسمح لإجراء تحقيقات أكثر تفصيلا في علم الأحياء على المستويات الخلوية والجزيئية. وهكذا، يتم استخدام نموذج الماوس حديثي الولادة هنا، مما يسمح لدراسة خصائص فريدة من نوعها وعلم الأحياء من الخلايا العصبية الحبل الشوكي في المختبر . إن &quot;عزل الخلايا العصبية في المختبر وصيانتها ليس واضحا بشكل خاص، وهناك وفرة نسبية من تقنيات عزل العصبونات من الأنسجة القشرية للقوارض البالغة التي يبدو أنها تؤدي إلى عدد كبير من الخلايا العصبية المعزولة ( أي الملايين) 5 ، 6 ، 7. في المقابل، فإن العائد من الخلايا العصبية من أنسجة الحبل الشوكي هو أقل 8 ، 9 ، 10 ، ويرجع ذلك جزئيا إلى كتلة أصغر من الأنسجة.وعلاوة على ذلك، في الفئران، وهناك قلة نسبي من التقنيات لعزل حديثي الولادة والخلايا العصبية الحبل الشوكي، والأساليب القائمة محدودة من قبل انخفاض الخلايا العصبية ( أي المئات) 9 أو التقنيات الشاقة والموارد الثقيلة التي تتطلب عزل الفئران الجنينية 10 . في هذا البروتوكول، ونحناستخدام تقنية تسمح لعزل فعالة من حيث التكلفة والموارد من عدد كبير من الخلايا العصبية من الحبل الشوكي من الفئران حديثي الولادة. كما هو شائع في التقنيات المنشورة سابقا، ونحن نستخدم غشاء كما الأنزيمية الأنزيمية، مما يسمح للإفراج عن الخلايا العصبية من أنسجة الحبل الشوكي 5 ، 6 . وبالإضافة إلى ذلك، ونحن نستخدم التدرج الكثافة لفصل الخلية المكرر، والتي سبق أن ثبت أن تكون فعالة 6 ، 10 . في حين أن الوسيط الذي يتم فيه حضانة الخلايا يمكن أن تختلف، في تجربتنا وكما نشرت سابقا 11 ، مكملات مع الطازجة B27 تكملة متوسطة الثقافة وقد ثبت أن تكون حاسمة لطول العمر العصبية. الخلايا العصبية هي عادة قابلة للحياة لمدة تصل إلى 10 يوما، مما يسمح للعلاج أن تنفذ.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1357">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Hibernate A Medium - 500 mL</td>
			<td style="width:116px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:107px;">A1247501</td>
			<td style="width:805px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hibernate A Minus Calcium - 500 mL</td>
			<td style="width:116px;">Brainbits</td>
			<td>HA-Ca</td>
			<td>http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax 100X - 100 mL</td>
			<td style="width:116px;">Thermo-Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 Supplement 50X - 10 mL</td>
			<td style="width:116px;">Thermo-Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Papain, Lyophilized - 100 mg</td>
			<td style="width:116px;">Worthington</td>
			<td>LS003119</td>
			<td>http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal A Medium - 500 mL</td>
			<td style="width:116px;">Thermo-Fisher</td>
			<td>10888022</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:116px;">Thermo-Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-D-lysine hydrobromide - 5 mg</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Laminin - 1 mg</td>
			<td style="width:116px;">Thermo-Fisher</td>
			<td>23017015</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue - 20 mL</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OptiPrep Density Gradient Medium - 250 mL</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556-250ML</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat)</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>440272-100ML</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>288306-1L</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Glass Pippette - 9&#34;</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">13-678-20C</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette bulb - 5 mL</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z186678-3EA</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en&#38;region=US&#38;cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BRAND&#174;&#160;Petri dish, glass - 60x15 mm</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR455717-10EA</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile 24 Well Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8812-100EA</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Hausser Hemacytometer (glass counting chamber)</td>
			<td style="width:116px;">Fischer Scientific</td>
			<td>02-671-6</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Slides - 12 mm sterile cover glass - uncoated</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG-12-1.5-Pre</td>
			<td>http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NeuN Rabbit Monoclonal Antibody - 100 &#181;L</td>
			<td style="width:116px;">Abcam</td>
			<td>ab177487</td>
			<td>After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:200 for 18 hours in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody - 50 &#181;L</td>
			<td style="width:116px;">Abcam</td>
			<td>ab11267</td>
			<td>After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:500 for 18 hours in 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spinal cord neurons isolation and culture from neonatal mice

نقدم بروتوكول لعزل وثقافة الخلايا العصبية الحبل الشوكي. يتم الحصول على الخلايا العصبية من حديثي الولادة C57BL / 6 الفئران ويتم عزلها في يوم ما بعد الولادة 1-3. يتم جمع القمامة الماوس، وعادة 4-10 الجراء ولدت من زوج تربية واحد، لتجربة واحدة، ويتم جمع الحبال الشوكي بشكل فردي من كل الماوس بعد القتل الرحيم مع إيسوفلوران. يتم تشريح العمود الفقري بها ومن ثم يتم تحرير الحبل الشوكي من العمود. ثم يتم مفرغة الحبل الشوكي لزيادة مساحة سطح التسليم للبروتياز الأنزيمية التي تسمح للخلايا العصبية والخلايا الأخرى أن يطلق سراحه من الأنسجة. ثم يتم استخدام تريتوراتيون لإطلاق الخلايا في حل. هذا الحل في وقت لاحق مجزأة في التدرج الكثافة لفصل الخلايا المختلفة في حل، مما يسمح للعصبية لتكون معزولة. يمكن عزل ما يقرب من 1-2.5 × 10 6 الخلايا العصبية من مجموعة القمامة واحدة. ثم يتم تصنيف الخلايا العصبية على الآبار المغلفة مع فاكتو لاصقةرس التي تسمح للنمو السليم والنضج. وتستغرق الخلايا العصبية حوالي 7 أيام للوصول إلى مرحلة النضج في النمو والثقافة المتوسطة ويمكن استخدامها بعد ذلك للعلاج والتحليل.

باستخدام هذه التقنية، والقمامة واحدة (4-10 الجراء) يسمح لعزل 1-2.5 10 6 الخلايا العصبية مناسبة للبذر على لوحات الثقافة. عادة، يتم تصنيف البذور 4-8 بئر في التركيز المذكور أعلاه ( أي 300،000 خلية / مل). ويبين الشكل 3 ظهور الخلايا العصبية ...

Watch this Scientific Journal Video about Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice at JoVE.com

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

تقدم هذه الدراسة تقنية لعزل الخلايا العصبية من الفئران حديثي الولادة وت. فإنه يتطلب تشريح دقيق من الحبل الشوكي من الماوس حديثي الولادة، تليها فصل الخلايا العصبية من أنسجة الحبل الشوكي من خلال الانقسام الميكانيكية والانزيمية.

الحبل الشوكي العصبونات العزلة والثقافة من الفئران حديثي الولادة

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

spinal-cord-neurons-isolation-and-culture-from-neonatal-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.0K Views.  University of Colorado Anschutz Medical Campus.  تقدم هذه الدراسة تقنية لعزل الخلايا العصبية من الفئران حديثي الولادة وت. فإنه يتطلب تشريح دقيق من الحبل الشوكي من الماوس حديثي الولادة، تليها فصل الخلايا العصبية من أنسجة الحبل الشوكي من خلال الانقسام الميكانيكية والانزيمية. 

Video: Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

تشريح والثقافة من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي صواري الجنينية

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

الوحشي قرع السائل : نموذج لإصابات في الدماغ لدى الفئران

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية قرن آمون من الفئران قبل الولادة

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

الدجاج الأجنة شريحة الحبل الشوكي الثقافة البروتوكول

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

العزلة وثقافة فصل الخلايا العصبية الحسية من الفرخ الأجنة

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

الزرد<em&gt; في الموقع</em&gt; الحبل الشوكي التحضير للتسجيلات الكهربية من العمود الفقري الحسية والحركية العصبية

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

التصوير النشاط العصبي في القشرة الأولية Somatosensory باستخدام Thy1-GCaMP6s الفئران المحورة وراثيا

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

إعداد نشط إيقاعي في الحبل الشوكي الدماغ القوارض الولدان المختبر وشريحة رقيقة

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) when compared to spinal motor neurons (SMNs). The ability to isolate and culture primary mouse CN3s, CN4s, and SMNs would provide an approach to study mechanisms underlying this selective vulnerability. To date, most protocols use heterogeneous cell cultures, which can confound the interpretation of experimental outcomes. To minimize the problems associated with mixed-cell populations, pure cultures are indispensable. Here, the first protocol describes in detail how to efficiently purify and cultivate CN3s/CN4s alongside SMNs counterparts from the same embryos using embryonic day 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgenic mouse embryos. The protocol provides details on the tissue dissection and dissociation, FACS-based cell isolation, and in vitro cultivation of cells from CN3/CN4 and SMN nuclei. This protocol adds a novel in vitro CN3/CN4 culture system to existing protocols and simultaneously provides a pure species- and age-matched SMN culture for comparison. Analyses focusing on the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of motor neurons are feasible in this culture system. This protocol will enable research into the mechanisms that define motor neuron development, selective vulnerability, and disease.

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

This work presents a protocol to yield homogeneous cell cultures of primary oculomotor, trochlear, and spinal motor neurons. These cultures can be used for comparative analyses of the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of ocular and spinal motor neurons.

العزلة والثقافة من محرك للعين ، تروشلير ، والخلايا العصبية موتور الشوكي من السابق للولادة Islmn: Gfp الفئران المحورة وراثيا

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

التسليم داخل الشرايين للخلايا الجذعية العصبية إلى الدماغ الفئران والفأر: تطبيق على الإقفاري الدماغي

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

الحبل الشوكي العصبونات العزلة والثقافة من الفئران حديثي الولادة

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video