Gli autori non hanno alcun riconoscimento.

La cura e il trattamento degli animali in questa procedura sono state condotte in conformità con le linee guida del Comitato istituzionale di cura e uso degli animali presso l&#39;Università del Colorado. 1. Preparazione delle soluzioni <ol><li> Preparare e conservare tutte le soluzioni a temperature adeguate, come mostrato nella Tabella 1 . </li></ol> 2. Rivestimenti di pozzetti e diapositive NOTA: i neuroni non aderiscono bene a superfici in plastica o vetro. <ol><li> Un giorno prima dell&#39;isolamento dei neuroni, coprire i pozzetti di una piastra di coltura a 24 pozzetti con 0,5 ml di poli-D-lisina (PDL, Tabella 2 ) e lasciarla in un cappuccio di flusso laminare O / N. NOTA: Il metodo preferito è quello di utilizzare piastre a 24 pozzetti e di rivestire solo i pozzetti centrali, in quanto l&#39;evaporazione dai pozzetti periferici tende ad essere più accelerata e portare a risultati incoerenti. Inoltre, le diapositive in vetro possono essere collocate all&#39;interno dei pozzetti precedentiO rivestimento. I neuroni si attaccheranno alle vetrate rivestite e possono essere rimosse in seguito per ulteriori immagini microscopiche . </li><li> Nel giorno dell&#39;isolamento, rimuovere il PDL dai pozzetti. Lavare con acqua sterile per alcuni minuti prima di rimuovere l&#39;acqua rimanente e lasciarla asciugare per 1 ora (vedi sotto). </li><li> Dopo l&#39;essiccazione, coprire le diapositive con laminina ( Tabella 2 ). NOTA: Circa 10 μL di laminina (10 μg / μL) è sufficiente a coprire ogni pozzetto di una piastra sterile a 24 pozzetti. Questo viene mescolato con 340 μL di mezzo (volume totale: 350 μL) per coprire l&#39;intero pozzetto. Lasciate riposare per 2 ore a RT in un cofano di cultura e aspirare prima di ricoprire le celle. </li></ol> 3. Raccogliere i cavi spinali NOTA: Tutti gli strumenti devono essere autoclavati (135 ° C e 30 psi per cicli di 4 x 7 min) per la sterilità. <ol><li> Eutanizzare cuccioli di topo C57BL / 6 di 1-3 giorni in una camera con isoflurano. Aspettare30 s dopo la cessazione del movimento e pizzicare la gamba per confermare la mancanza di risposta. </li><li> Separare la testa dal corpo usando forbici, con cucciolo nella posizione predisposta. </li><li> Stabilizzare le gambe posteriori o coda e braccia sulla tabella di procedura, con il lato dorsale rivolto verso l&#39;utente. </li><li> Tagliare la pelle usando le forbici curve dell&#39;iride. </li><li> Tagliare il midollo spinale dalla regione lombare appena sopra le anche e procedere a tagliare entrambi i lati del torace per separarlo dal corpo. NOTA: Ciò richiede un&#39;attenta dissezione del midollo spinale da organi viscerali per evitare danni involontari ad altri organi ( Figura 1a ). </li><li> Lavare in sequenza per 10 s in 3 x 10 cm di piatti Petri contenenti 5 mL di 0,2 μm filtrato-sterilizzato fosfato-tamponato salina (PBS) per rimuovere il tessuto in eccesso. </li><li> Inserire un ago e una siringa da 22 G riempiti di 5 mL di PBS sterilizzato con filtro nell&#39;estremità caudale della colonna vertebrale e scorrere cranialmente, lasciando il cavo tO uscire in un quarto piatto di Petri ( figura 1b ). </li><li> Raccogliere il midollo spinale in un tubo da 15 mL con 5 mL di HABG ( Tabella 1 ) sul ghiaccio. Usate attenzione per evitare di schiacciare il midollo spinale. </li><li> Ripetere i passaggi 3.1-3.8 per ogni cucciolo nella stiva. NOTA: Idealmente, questo processo dovrebbe richiedere meno di 30 minuti per il midollo spinale per garantire l&#39;isolamento sano del neurone. </li></ol> 4. Neuroni isolanti NOTA: La fase seguente deve essere eseguita in un cappuccio di flusso laminare. Si prevede la conoscenza della tecnica base sterile. <ol><li> Tissue Mincing <ol><li> Prendete il tubo contenente le corde spinali e agitate leggermente per sospendere il tessuto. </li><li> Versare il tessuto dal tubo in un piatto da 60 mm di vetro Petri e dadi con una lama di rasoio per creare pezzi fini di circa 0,5 mm. </li><li> Trasferire il tessuto con una pipetta largo-bore in un tubo da 15 mL contenente 5 mL di HABG. </li><li> Posizionarlo in un30 ° C per 30 minuti per consentire alle cellule di equilibrare a questa temperatura. Mantenere le cellule su un agitatore appena sufficiente per consentire loro di essere sospesi nel fluido. NOTA: Questo passaggio è fatto per evitare di sconvolgere le cellule dopo il trasferimento dal ghiaccio al mezzo di digestione. Mantenere le cellule a 30 ° C contribuisce a ridurre la morte cellulare associata ad un metabolismo altrimenti aumentato a 37 ° C. </li></ol></li><li> Preparare il mezzo di digestione ( Tabella 1 ). </li><li> Preparare il gradiente di densità (Tabella 1). <ol><li> Preparare ciascuno dei 4 strati in 4 tubi separati da 15 ml, come descritto nella tabella 1 . </li><li> Aggiungere 1 ml da ogni strato in un nuovo tubo da 15 ml. Inizia con lo strato 1 in basso e aggiungi successivamente fino a raggiungere il livello 4 in alto. Evitare di disturbare gli strati durante l&#39;aggiunta. </li></ol></li><li> Lavare le piastre rivestite con PDL dalla fase 2.2. Lavare con acqua sterile per alcuni minuti prima di rimuovere qualsiasi acqua rimanente eConsentendo loro di asciugare per 1 h. </li><li> Trasferire il tessuto al mezzo di digestione. <ol><li> Rimuovere il tubo contenente i tessuti dal bagno dell&#39;acqua shaker a 30 ° C e lasciarlo accomodare per alcuni minuti. </li><li> Rimuovere il tubo mediano di digestione dal bagno d&#39;acqua di 37 ° C e aspirarlo in una siringa di chiusura. </li><li> Aspirare l&#39;eccesso di HABG dal tubo contenente i tessuti. </li><li> Utilizzare un filtro da 0.2 μm a sbirciamento sulla siringa per aggiungere il mezzo di digestione al tubo contenente i tessuti. </li><li> Mettere il tubo in un bagno d&#39;acqua di 30 ° C per 30 minuti. Tenere le cellule agitate abbastanza da permettere loro di essere sospese nel fluido. NOTA: È importante non mantenere troppo lungamente le cellule nel mezzo di digestione o lasciare che la temperatura sia troppo elevata, che potrebbe portare ad un&#39;eccessiva digestione e provocare il sospensione del tessuto in una miscela gelatinosa. </li></ol></li><li> Durante questo periodo, rivestire la laminina come nel punto 2.3. </li> &lt;Li&gt; Esegui la triturazione ( cioè la separazione delle cellule dal tessuto). <ol><li> Rimuovere il tubo dal bagno di agitazione a 30 ° C e lasciarlo accomodare per qualche minuto. </li><li> Aspirare un mezzo di digestione in eccesso. </li><li> Sospendere il tessuto in 2 ml di HABG. </li><li> Usando una pipetta stretta, triturare 10 volte per 45 s. NOTA: Questo è probabilmente il passo singolo più cruciale e può ridurre in modo significativo il rendimento se non viene eseguito correttamente. <ol><li> Aspirare il tessuto nella pipetta e vuotare immediatamente il contenuto. </li><li> Evitate l&#39;introduzione dell&#39;aria, poiché diminuirà significativamente la resa vitale. NOTA: la pipetta ideale è una pipetta di vetro da 9 &quot;, la punta della pipetta deve essere lucidata a fuoco per lisciare le superfici ruvide e quindi essere siliconizzata posizionandosi in una soluzione 1:20 di diclorodimetilsilano (DMDCS) in cloroformio e lasciata O La pipetta deve quindi essere rimossa e lasciata asciugare in ariaDeve essere autoclavato per la sterilizzazione. Attenzione: DMDCS e cloroformio sono altamente infiammabili, e la siliconizzazione deve essere effettuata in una cappa di fumo. </li></ol></li><li> Aspirare i primi 2 ml di supernatante e inserirlo in un nuovo tubo da 15 ml denominato &quot;raccolta&quot;. </li><li> Ripetere i passaggi 4.7.3-4.7.5 due volte supplementari (il tubo di raccolta delle cellule dovrebbe avere 6 ml alla fine). </li><li> Trasferire lentamente il contenuto del tubo di raccolta nel tubo di gradiente preparato al punto 4.2, evitando la rottura del gradiente. </li></ol></li><li> A questo punto, rimuovere il mezzo neurobasale già preparato ( Tabella 1 ) dal frigorifero e lasciarlo riscaldare in un bagno a 37 ° C. </li><li> Purificare i neuroni. <ol><li> Centrifugare il tubo di gradiente per 15 minuti a 800 xg e 22 ° C. </li><li> Raccogliere lo strato desiderato con una pipetta ( figura 2 ) e collocare in un nuovo tubo da 15 ml. Per la più alta purezza della neuroIsolare ( cioè &gt; 90%), raccogliere lo strato 3. Per ottenere una maggiore resa con meno purezza ( es. &gt; 70-80%), raccogliete i livelli 2 e 3. </li><li> Diluire il gradiente di densità aggiungendo 5 mL di HABG ai nuovi strati raccolti. </li><li> Centrifugare a 200 xg per 2 min a 22 ° C. </li><li> Scartare il surnatante, ri-sospendere in 5 mL di HABG e far scorrere il pellet per sospendere le cellule. </li><li> Centrifugare per 2 min 200 xg a 22 ° C. </li><li> Scartare il surnatante, risospendere in 3 ml di mezzo neurobasale e far scattare il pellet per riposizionare le cellule. </li></ol></li><li> Conte le celle. <ol><li> Prendere 10 μL della soluzione, ora con le cellule in mezzo neurobasale, e mescolare con 10 μL di Trypan blu. </li><li> Mettere 10 μL di questa miscela in una camera di conteggio del vetro. </li><li> Utilizzando una camera standard di conteggio del vetro conteggiate il numero di celle in ciascuno dei quattro quadranti 4 x 4. Aggiungere tutte le celle contate (n), multiPelo per 2 (fattore di diluizione), divide per 4 (numero di quadranti contati), moltiplica per 3 (volume di media neurobasale) e moltiplica per 10 4 per ottenere la concentrazione di cellule in cellule / ml. <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55856/55856eq0.jpg" /></li></ol></li><li> Seme le cellule sulle piastre di coltura <ol><li> Diluire la sospensione cellulare a 300.000 cellule in 1 mL di mezzo neurobasale. NOTA: Sulla base della concentrazione delle cellule ottenute nelle fasi precedenti, viene aggiunto un supporto neurobasale supplementare per ottenere una concentrazione finale di 3 x 10 5 cellule / mL. L&#39;equazione è C 1 V 1 = C 2 V 2 , dove C 1 è la concentrazione iniziale delle cellule ottenute dal raccolto; V 1 è 3 mL; E C 2 è 3 * 10 5 cellule / ml, come sopra discusso. L&#39;equazione viene risolta per V 2 . Aggiungere il volume del mezzo neurobasale necessario per rendere uguale il volume totale delle cellule in soluzioneV 2 . </li><li> Agitare delicatamente per distribuire le cellule in soluzione e aggiungere 1 mL ad ogni pozzetto nelle piastre ricoperte a 24 pozzetti. </li></ol></li></ol>

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Gli autori non hanno alcuna divulgazione.

Questa tecnica consente la cultura affidabile dei neuroni del midollo spinale. Una volta raggiunta la conoscenza della tecnica, ci vogliono circa 3,5 ore per completare. Siamo stati in grado di effettuare l&#39;isolamento dei neuroni da 2 cucciolate separate (16 topi totali) in circa 4 h. Il passo fondamentale della fattibilità è poter estrarre efficacemente i cavi spinali dai topi. La resa consente di plating diversi pozzetti e per la capacità di testare i neuroni in varie condizioni. Siamo stati in grado di trattar...

<html> La comprensione della patologia del midollo spinale richiede l&#39;uso di vari modelli, sia a livello macroscopico che microscopico. I modelli animali grandi e piccoli 1 , 2 , 3 sono usati per le indagini in vivo di malattie del midollo spinale e lesioni. Mentre studia questi problemi in vivo ha i suoi meriti, l&#39;analisi del midollo spinale è limitata all&#39;intero homogenato del midollo spinale o alle sezioni del tessuto 4 . Ciò crea qualche ambiguità quando si cerca di isolare risposte e obiettivi specifici nel midollo spinale tra i neuroni residenti e la loro regione circostante. La crescente disponibilità di topi manipolati geneticamente permette di effettuare approfondite indagini sulla biologia a livello cellulare e molecolare. Pertanto, qui viene utilizzato un modello del topo neonatale, che consente lo studio delle proprietà uniche e della biologia dei neuroni del midollo spinale in vitro . L&#39;isolamento e la manutenzione dei neuroni in vitro non è particolarmente diretto. Esiste una abbondanza relativa di tecniche per l&#39;isolamento dei neuroni dal tessuto corticale dei roditori adulti che sembrano provocare un numero considerevole di neuroni isolati ( ossia milioni) 5 , 6 , 7. Al contrario, la resa dei neuroni dal tessuto del midollo spinale è inferiore a 8 , 9 , 10 , in parte dovuta alla più piccola massa di tessuto. Inoltre, nei topi c&#39;è una relativa poca tecnica di isolamento dei neonatali I neuroni del midollo spinale ei metodi esistenti sono limitati da rese inferiori ai neuroni ( cioè centinaia) 9 o tecniche laboriose e pesanti che richiedono l&#39;isolamento dei topi embrionali 10 . In questo protocollo, noiUtilizzare una tecnica che consente l&#39;isolamento costoso ed efficace di un numero considerevole di neuroni dai cavi spinali di topi neonatali. Come è comune nelle tecniche precedentemente pubblicate, utilizziamo il papain come una proteasi enzimatica, che consente il rilascio di neuroni dal tessuto del midollo spinale 5 , 6 . Inoltre, utilizziamo un gradiente di densità per la separazione delle cellule raffinate, che è stato precedentemente dimostrato essere efficace 6 , 10 . Mentre il mezzo in cui le cellule sono incubate può variare, nella nostra esperienza e come pubblicato in precedenza 11 , l&#39;integrazione con supplemento di terreno di coltura fresco B27 è risultato essere critico per la longevità del neurone. I neuroni sono tipicamente vitali per un massimo di 10 giorni, permettendo di eseguire il trattamento.

<table><tbody><tr><td>Hibernate A Medium - 500 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A1247501</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501</td></tr><tr><td>Hibernate A Minus Calcium - 500 mL</td><td>Brainbits</td><td>HA-Ca</td><td>http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/</td></tr><tr><td>Glutamax 100X - 100 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>35050061</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079</td></tr><tr><td>B27 Supplement 50X - 10 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>17504044</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044</td></tr><tr><td>Papain, Lyophilized - 100 mg</td><td>Worthington</td><td>LS003119</td><td>http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html</td></tr><tr><td>Neurobasal A Medium - 500 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10888022</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15140122</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine (PDL) hydrobromide - 5 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Mouse Laminin - 1 mg</td><td>Thermo-Fisher</td><td>23017015</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015</td></tr><tr><td>Trypan Blue - 20 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium - 250 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556-250ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440272-100ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306-1L</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Glass Pippette - 9&quot;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13-678-20C</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Pipette bulb - 5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z186678-3EA</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en&amp;amp;region=US&amp;amp;cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1</td></tr><tr><td>BRAND&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;Petri dish, glass - 60 x 15 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR455717-10EA</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Sterile 24-Well Cell Culture Plate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8812-100EA</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Hausser Hemacytometer (glass counting chamber)</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-671-6</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716</td></tr><tr><td>Glass Slides - 12 mm sterile cover glass - uncoated</td><td>Neuvitro</td><td>GG-12-1.5-Pre</td><td>http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm</td></tr><tr><td>NeuN Rabbit Monoclonal Antibody - 100 &amp;micro;L</td><td>Abcam</td><td>ab177487</td><td>After fixing in paraformaldehyde (PFA) and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:200 for 18 h in 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody - 50 &amp;micro;L</td><td>Abcam</td><td>ab11267</td><td>After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:500 for 18 h in 4 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

spinal cord neurons isolation and culture from neonatal mice

Presentiamo un protocollo per l&#39;isolamento e la cultura dei neuroni del midollo spinale. I neuroni sono ottenuti da topi neonatali C57BL / 6 e sono isolati nel giorno postnatalo 1-3. Un cucciolo di topo, di solito 4-10 cuccioli nati da una coppia di allevamento, viene raccolto per un esperimento e le corde spinali vengono raccolte individualmente da ciascun mouse dopo eutanasia con isoflurano. La colonna vertebrale viene disseccata e poi il midollo spinale viene rilasciato dalla colonna. I cavi spinali vengono quindi macinati per aumentare la superficie di consegna per una proteasi enzimatica che consente di liberare i neuroni e altre cellule dal tessuto. La triturazione viene poi usata per liberare le cellule in soluzione. Questa soluzione viene successivamente frazionata in un gradiente di densità per separare le varie cellule in soluzione, consentendo il isolamento dei neuroni. Circa 1-2,5 x 10 6 neuroni possono essere isolati da un gruppo di letti. I neuroni vengono poi seminati su pozzetti rivestiti di facto adesivoR che permettono una corretta crescita e maturazione. I neuroni richiedono circa 7 giorni per raggiungere la maturità nel mezzo di crescita e coltura e possono poi essere utilizzati per il trattamento e l&#39;analisi.

Utilizzando questa tecnica, una singola lettiera (4-10 cuccioli) consente l&#39;isolamento di 1-2,5 10 neuroni adatti per l&#39;invaso su piastre di coltura. Tipicamente, 4-8 pozzetti vengono seminati alla concentrazione menzionata sopra ( cioè 300.000 cellule / ml). La Figura 3 mostra l&#39;apparenza dei neuroni a questa concentrazione dopo una settimana di coltura a microscopia leggera di ingrandimento ( a ) e ad alta ( b...

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Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Questo studio presenta una tecnica per l&#39;isolamento dei neuroni da topi neonatali WT. Richiede l&#39;attenta disezione del midollo spinale dal topo neonatale, seguita dalla separazione dei neuroni dal tessuto del midollo spinale attraverso la scissione meccanica ed enzimatica.

Isolamento e cultura dei neuroni del midollo spinale da topi neonatali

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.0K Views.  University of Colorado Anschutz Medical Campus.  Questo studio presenta una tecnica per l'isolamento dei neuroni da topi neonatali WT. Richiede l'attenta disezione del midollo spinale dal topo neonatale, seguita dalla separazione dei neuroni dal tessuto del midollo spinale attraverso la scissione meccanica ed enzimatica. 

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Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. Neuroepithelial cells of the neural tube that express Nkx6.1 are the unique precursor cells for spinal motoneurons1. Though postmitotic motoneurons move towards their final position and organize themselves into columns along the spinal tract2,3. More than 90% of all these differentiated and positioned motoneurons express the transcription factors Islet 1/2. They innervate the muscles of the limbs as well as those of the body and the inner organs. Among others, motoneurons typically express the high affinity receptors for brain derived neurotrophic factor (BDNF) and Neurotrophin-3 (NT-3), the tropomyosin-related kinase B and C (TrkB, TrkC). They do not express the tropomyosin-related kinase A (TrkA)4. Beside the two high affinity receptors, motoneurons do express the low affinity neurotrophin receptor p75NTR. The p75NTR can bind all neurotrophins with similar but lower affinity to all neurotrophins than the high affinity receptors would bind the mature neurotrophins. Within the embryonic spinal cord, the p75NTR is exclusively expressed by the spinal motoneurons5. This has been used to develop motoneuron isolation techniques to purify the cells from the vast majority of surrounding cells6. Isolating motoneurons with the help of specific antibodies (panning) against the extracellular domains of p75NTR has turned out to be an expensive method as the amount of antibody used for a single experiment is high due to the size of the plate used for panning. A much more economical alternative is the use of lectin. Lectin has been shown to specifically bind to p75NTR as well7. The following method describes an alternative technique using wheat germ agglutinin for a preplating procedure instead of the p75NTR antibody. The lectin is an extremely inexpensive alternative to the p75NTR antibody and the purification grades using lectin are comparable to that of the p75NTR antibody. Motoneurons from the embryonic spinal cord can be isolated by this method, survive and grow out neurites.

An alternative way of isolating mouse embryonic motoneurons from the spinal cord is described. The method takes into account the fact that lectin can bind to the low affinity nerve growth factor receptor p75NTR. This lectin-based preplating allows a purification similar to that with a specific antibody against the p75NTR.

Lectina a base di isolamento e la coltura del mouse motoneuroni embrionali

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Ricerca

Neuroscienze

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Coltura Microglia dal Sistema Nervoso Centrale neonatale e adulti

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Immunologia e infezioni

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord Elettrofisiologia

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Biologia

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

Un neonatale mouse Spinal Cord Injury compressione Modello

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Medicina

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

Preparazione delle colture gliali miste primarie da adulti mouse spinale tessuto del midollo

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

Cultura primaria dei neuroni isolata dal cerbellello del topo embrionale

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) when compared to spinal motor neurons (SMNs). The ability to isolate and culture primary mouse CN3s, CN4s, and SMNs would provide an approach to study mechanisms underlying this selective vulnerability. To date, most protocols use heterogeneous cell cultures, which can confound the interpretation of experimental outcomes. To minimize the problems associated with mixed-cell populations, pure cultures are indispensable. Here, the first protocol describes in detail how to efficiently purify and cultivate CN3s/CN4s alongside SMNs counterparts from the same embryos using embryonic day 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgenic mouse embryos. The protocol provides details on the tissue dissection and dissociation, FACS-based cell isolation, and in vitro cultivation of cells from CN3/CN4 and SMN nuclei. This protocol adds a novel in vitro CN3/CN4 culture system to existing protocols and simultaneously provides a pure species- and age-matched SMN culture for comparison. Analyses focusing on the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of motor neurons are feasible in this culture system. This protocol will enable research into the mechanisms that define motor neuron development, selective vulnerability, and disease.

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

This work presents a protocol to yield homogeneous cell cultures of primary oculomotor, trochlear, and spinal motor neurons. These cultures can be used for comparative analyses of the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of ocular and spinal motor neurons.

Isolamento e coltura di Oculomotor, Trochlear, e MotoNeuroni Spinali da Prenatal Islmn:GFP Topi Transgenici

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal growth, development, and survival. We describe a detailed method for the use of microfluidic chambers (MFCs) for tracking axonal transport of fluorescently labeled organelles in MN axons. This method is rapid, relatively inexpensive, and allows for the monitoring of intracellular cues in space and time. We describe a step by step protocol for: 1) Fabrication of polydimethylsiloxane (PDMS) MFCs; 2) Plating of ventral spinal cord explants and MN dissociated culture in MFCs; 3) Labeling of mitochondria and acidic compartments followed by live confocal imagining; 4) Manual and semiautomated axonal transport analysis. Lastly, we demonstrate a difference in the transport of mitochondria and acidic compartments of HB9::GFP ventral spinal cord explant axons as a proof of the system validity. Altogether, this protocol provides an efficient tool for studying the axonal transport of various axonal components, as well as a simplified manual for MFC usage to help discover spatial experimental possibilities.

Axonal transport is a crucial mechanism for motor neuron health. In this protocol we provide a detailed method for tracking the axonal transport of acidic compartments and mitochondria in motor neuron axons using microfluidic chambers.

Trasporto assonale di Organanelle nelle colture del motoneurone utilizzando il sistema di camere microfluidiche

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Estrazione efficiente di astrociti e microglia dal midollo spinale del topo adulto

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic cells exhibit rapid responses to environmental changes and display significant heterogeneity in terms of morphology, transcriptional profiles, and functions. While our understanding of the functions of glial cells in health and disease has advanced substantially, there remains a need for in vitro, cell-specific analyses conducted in the context of insults or injuries to comprehensively characterize distinct cell populations. Isolating cells from the adult mouse offers several advantages over cell lines or neonatal animals, as it allows for the analysis of cells under pathological conditions and at specific time points. Furthermore, focusing on spinal cord-specific isolation, excluding brain involvement, enables research into spinal cord pathologies, including experimental autoimmune encephalomyelitis, spinal cord injury, and amyotrophic lateral sclerosis. This protocol presents an efficient method for isolating astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating immediate or future analysis with potential applications in functional, molecular, or proteomic downstream studies.

Autore in primo piano: Isolamento delle cellule gliali dal midollo spinale del topo adulto 

This protocol outlines the isolation of purified astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating subsequent applications such as RNA analysis and cell culture. It includes detailed cell dissociation methods and procedures designed to enhance both the quality and yield of isolated cells.

Isolamento di astrociti puri e microglia dal midollo spinale di topo adulto per saggi in vitro e studi trascrittomici

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic ...

Isolamento e cultura dei neuroni del midollo spinale da topi neonatali

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Lectina a base di isolamento e la coltura del mouse motoneuroni embrionali

Coltura Microglia dal Sistema Nervoso Centrale neonatale e adulti

Spinal Cord Elettrofisiologia

Un neonatale mouse Spinal Cord Injury compressione Modello

Preparazione delle colture gliali miste primarie da adulti mouse spinale tessuto del midollo

Cultura primaria dei neuroni isolata dal cerbellello del topo embrionale

Isolamento e coltura di Oculomotor, Trochlear, e MotoNeuroni Spinali da Prenatal Isl^mn:GFP Topi Transgenici

Trasporto assonale di Organanelle nelle colture del motoneurone utilizzando il sistema di camere microfluidiche

Isolamento di astrociti puri e microglia dal midollo spinale di topo adulto per saggi in vitro e studi trascrittomici

Isolamento di astrociti puri e microglia dal midollo spinale di topo adulto per saggi in vitro e studi trascrittomici