Name: spinal cord neurons isolation and culture from neonatal mice
Uploaded: 2017-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
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Die Pflege und Behandlung von Tieren in diesem Verfahren wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Colorado durchgeführt. 1. Vorbereitung von Lösungen <ol><li> Bereiten und lagern Sie alle Lösungen bei geeigneten Temperaturen, wie in Tabelle 1 gezeigt . </li></ol> 2. Beschichtungsbrunnen und -rutschen HINWEIS: Neuronen haften nicht gut an Kunststoff- oder Glasoberflächen. <ol><li> Einen Tag vor der Isolierung der Neuronen beschichten die Vertiefungen einer sterilen 24-Well-Kulturplatte mit 0,5 ml Poly-D-Lysin (PDL, Tabelle 2 ) und lassen sie in eine laminare Strömungshaube O / N. HINWEIS: Die bevorzugte Methode besteht darin, Platten mit 24 Vertiefungen zu verwenden und nur die Mittelbrunnen zu beschichten, da die Verdampfung von den peripheren Vertiefungen eher beschleunigt wird und zu inkonsistenten Ergebnissen führt. Zusätzlich können Glasscheiben in den Brunnen vor dem T platziert werdenO Beschichtung. Die Neuronen werden an den beschichteten Glasscheiben befestigt und können später zur weiteren mikroskopischen Bildgebung entfernt werden . </li><li> Am Tag der Isolierung, entfernen Sie die PDL aus den Brunnen. Mit einem sterilen Wasser für einige Minuten waschen, bevor das restliche Wasser entfernt und 1 h lang getrocknet wird (siehe unten). </li><li> Nach dem Trocknen die Folien mit Laminin beschichten ( Tabelle 2 ). HINWEIS: Etwa 10 &amp; mgr; l Laminin (10 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l) reichen aus, um jede Vertiefung einer sterilen 24-Well-Platte zu beschichten. Dies wird mit 340 μl Medium (Gesamtvolumen: 350 μL) gemischt, um den gesamten Brunnen zu bedecken. Lassen Sie diese für 2 h bei RT in einer Kulturhaube sitzen und dann vor dem Beschichten der Zellen abspülen. </li></ol> 3. Ernten von Wirbelsäulen HINWEIS: Alle Instrumente sollten für die Sterilität autoklaviert werden (135 ° C und 30 psi für 4 x 7 min Zyklen). <ol><li> Euthanisieren Sie 1-3 Tage alte C57BL / 6 Maus-Welpen in einer Kammer mit Isofluran. Warte ab30 s nach der Beendigung der Bewegung und kneifen das Bein, um einen Mangel an Antwort zu bestätigen. </li><li> Trennen Sie den Kopf vom Körper mit Schere, mit Welpen in der Bauchlage. </li><li> Stabilisieren Sie die Hinterbeine oder Schwanz und Arme auf der Prozedur Tabelle, mit dorsalen Seite zum Benutzer. </li><li> Schneiden Sie die Haut mit einer gebogenen Irisschere ab. </li><li> Schneiden Sie das Rückenmark aus dem Lendenbereich gerade über die Hüften und fahren Sie fort, beide Seiten des Thorax zu schneiden, um es vom Körper zu trennen. HINWEIS: Dies erfordert die sorgfältige Sezierung des Rückenmarks von viszeralen Organen, um unbeabsichtigte Schäden an anderen Organen zu vermeiden ( Abbildung 1a ). </li><li> Nach 10 Sekunden in 3 x 10 cm Petrischalen, die 5 ml 0,2 μm Filter-sterilisierte Phosphat-gepufferte Saline (PBS) enthalten, um überschüssiges Gewebe zu entfernen, abwaschen. </li><li> Setzen Sie eine 22 G-Nadel und Spritze mit 5 ml Filter-sterilisiertem PBS in das kaudale Ende der Wirbelsäule und bündig kranial, so dass die Schnur tO Ausfahrt in eine vierte Petrischale ( Abbildung 1b ). </li><li> Sammle das Rückenmark in einem 15-ml-Röhrchen mit 5 ml HABG ( Tabelle 1 ) auf Eis. Achten Sie darauf, dass Sie das Rückenmark nicht zerkleinern. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.8 für jeden Welpen im Wurf. HINWEIS: Im Idealfall sollte dieser Vorgang weniger als 30 Minuten pro Rückenmark dauern, um eine gesunde Neuronisolation zu gewährleisten. </li></ol> 4. Neuronen isolieren HINWEIS: Der folgende Schritt sollte in einer laminaren Strömungshaube durchgeführt werden. Vertrautheit mit der grundlegenden sterilen Technik wird erwartet. <ol><li> Tissue Mincing <ol><li> Nehmen Sie die Röhre mit den Rückenmark und schütteln Sie leicht, um das Gewebe zu suspendieren. </li><li> Gießen Sie das Gewebe aus dem Röhrchen in eine 60 mm Glas Petrischale und würfeln Sie mit einer Rasierklinge, um feine Stücke ~ 0,5 mm Größe zu schaffen. </li><li> Übertragen Sie das Gewebe mit einer breitlochigen Pipette in ein 15-ml-Röhrchen mit 5 ml HABG. </li><li> Legen Sie es in ein30 ° C Wasserbad für 30 min, damit die Zellen bei dieser Temperatur äquilibrieren können. Halten Sie die Zellen auf einen Shaker gerade genug, damit sie in der Flüssigkeit suspendiert werden können. HINWEIS: Dieser Schritt wird durchgeführt, um zu vermeiden, dass die Zellen bei der Übertragung von Eis auf das Verdauungsmedium geschockt werden. Das Halten der Zellen bei 30 ° C hilft, den Zelltod zu verringern, der mit einem ansonsten erhöhten Stoffwechsel bei 37 ° C verbunden ist. </li></ol></li><li> Bereiten Sie das Verdauungsmedium vor ( Tabelle 1 ). </li><li> Den Dichtegradienten vorbereiten (Tabelle 1). <ol><li> Bereiten Sie jede der 4 Schichten in 4 separaten 15-ml-Röhrchen vor, wie in Tabelle 1 beschrieben . </li><li> Füge 1 ml aus jeder Schicht in ein neues 15-ml-Röhrchen. Beginnen Sie mit der Schicht 1 an der Unterseite und folgen Sie nacheinander, bis die Schicht 4 an der Spitze erreicht ist. Vermeiden Sie es, die Schichten beim Hinzufügen zu stören. </li></ol></li><li> Waschen Sie die PDL-beschichteten Platten aus Schritt 2.2. Waschen Sie mit sterilem Wasser für ein paar Minuten, bevor Sie restliches Wasser entfernen undSo dass sie für 1 h trocknen lassen. </li><li> Übertragen Sie das Gewebe auf das Verdauungsmedium. <ol><li> Entfernen Sie das Gewebe-haltige Röhrchen aus dem Shaker-Wasserbad bei 30 ° C und lassen Sie es für einige Minuten absetzen. </li><li> Entfernen Sie das Verdauungsmediumschlauch aus dem 37 ° C Wasserbad und saugen Sie es in eine Leur-Lock-Spritze. </li><li> Absaugen Sie die überschüssige HABG aus dem Gewebe enthaltenden Rohr. </li><li> Verwenden Sie auf der Spritze einen Leur-Lock-0,2 μm-Filter, um dem Gewebe enthaltenden Röhrchen ein Verdauungsmedium zuzusetzen. </li><li> Legen Sie den Schlauch in ein 30 ° C Wasserbad für 30 min. Halten Sie die Zellen gerade genug schütteln, damit sie in der Flüssigkeit suspendiert werden können. HINWEIS: Es ist wichtig, die Zellen nicht zu lange im Verdauungsmedium zu halten oder die Temperatur zu hoch zu lassen, was zu einer übermäßigen Verdauung führen kann und dazu führt, dass das Gewebe in einer gallertartigen Mischung suspendiert wird. </li></ol></li><li> Während dieser Periode das Laminin wie in Schritt 2.3 beschichten. </li> &lt;Li&gt; Trituration durchführen ( dh die Zellen vom Gewebe trennen). <ol><li> Entfernen Sie das Röhrchen aus dem 30 ° C Wasserbad und lassen Sie es für ein paar Minuten absetzen. </li><li> Aspirate überschüssiges Verdauungsmedium. </li><li> Das Gewebe in 2 ml HABG suspendieren. </li><li> Mit einer schmalen Bohrpipette 10x für 45 s triturieren. HINWEIS: Dies ist wahrscheinlich der einzige entscheidende Schritt und kann den Ertrag erheblich senken, wenn nicht richtig gemacht. <ol><li> Sauge das Gewebe in die Pipette und leere sofort den Inhalt zurück. </li><li> Vermeiden Sie die Einführung von Luft, da es die lebensfähige Ausbeute deutlich verringern wird. HINWEIS: Die ideale Pipette ist eine 9-Zoll-Glaspipette, die Spitze der Pipette sollte feuerpoliert werden, um raue Oberflächen zu glätten, sie sollte dann durch Platzierung in einer 1: 20-Lösung von Dichlordimethylsilan (DMDCS) in Chloroform und O / N. Die Pipette sollte dann entfernt und an der Luft getrocknet werdenFür die Sterilisation autoklaviert werden. Achtung: DMDCS und Chloroform sind leicht entflammbar und die Silikonisierung sollte in einer Dunstabzugshaube durchgeführt werden. </li></ol></li><li> Aspirieren Sie die Top 2 ml Überstand und legen Sie sie in eine neue 15-ml-Röhre mit der Aufschrift &quot;Sammlung&quot;. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.7.3-4.7.5 zwei weitere Zeiten (das Zellsammelröhrchen sollte 6 ml am Ende haben). </li><li> Langsam den Sammelrohrinhalt in das in Schritt 4.2 hergestellte Gradientenrohr übertragen, wodurch die Störung des Gradienten vermieden wird. </li></ol></li><li> An diesem Punkt entfernen Sie das zuvor hergestellte neurobasale Medium ( Tabelle 1 ) aus dem Kühlschrank und lassen Sie es in einem 37 ° C Bad warm werden. </li><li> Reinige die Neuronen. <ol><li> Das Gradientenrohr für 15 min bei 800 xg und 22 ° C zentrifugieren. </li><li> Sammeln Sie die gewünschte Schicht (en) mit einer Pipette ( Abbildung 2 ) und legen Sie sie in ein neues 15-ml-Röhrchen. Für das hochreine NeuroN Isolierung ( dh &gt; 90%), sammeln Schicht 3. Für mehr Ausbeute mit weniger Reinheit ( dh &gt; 70-80%) sammeln Sie die Schichten 2 &amp; 3. </li><li> Verdünnen Sie den Dichtegradienten durch Zugabe von 5 ml HABG zu den neu gesammelten Schichten. </li><li> Zentrifugieren bei 200 xg für 2 min bei 22 ° C. </li><li> Den Überstand verwerfen, in 5 ml HABG erneut suspendieren und das Pellet zusetzen, um die Zellen zu suspendieren. </li><li> Zentrifugieren bei 2 min 200 xg bei 22 ° C. </li><li> Den Überstand verwerfen, in 3 ml Neurobasalmedium resuspendieren und das Pellet auffüllen, um die Zellen zu resuspendieren. </li></ol></li><li> Zähle die Zellen. <ol><li> Nehmen Sie 10 μl der Lösung, jetzt mit Zellen im neurobasalen Medium, und mischen mit 10 μl Trypanblau. </li><li> 10 μl dieser Mischung in eine Glaszählkammer geben. </li><li> Mit einer Standard-Glaszählkammer zählen die Anzahl der Zellen in jedem der vier 4 x 4 Quadranten. Fügen Sie alle Zellen gezählt (n), multiPly durch 2 (Verdünnungsfaktor), teilen sich mit 4 (Anzahl der gezählten Quadranten), multiplizieren mit 3 (Volumen des neurobasalen Mediums) und multiplizieren mit 10 4 , um die Konzentration der Zellen in Zellen / ml zu erhalten. <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55856/55856eq0.jpg" /></li></ol></li><li> Samen die Zellen auf Kulturplatten <ol><li> Die Zellsuspension auf 300.000 Zellen in 1 ml Neurobasalmedium verdünnen. HINWEIS: Basierend auf der Konzentration der in den obigen Schritten erhaltenen Zellen wird zusätzliches neurobasales Medium zugegeben, um eine Endkonzentration von 3 · 10 &amp; sup5; Zellen / ml zu erhalten. Die Gleichung ist C 1 V 1 = C 2 V 2 , wobei C 1 die Anfangskonzentration der aus der Ernte gewonnenen Zellen ist; V &amp; sub1; ist 3 ml; Und C &amp; sub2; ist 3 · 10 &amp; sup5; Zellen / ml, wie oben diskutiert. Die Gleichung ist für V 2 gelöst. Fügen Sie das Volumen des neurobasalen Mediums hinzu, das notwendig ist, um das Gesamtvolumen der Zellen in Lösung gleich zu machenV 2 </li><li> Schütteln Sie sanft, um die Zellen in Lösung zu verteilen und fügen Sie 1 ml zu jeder Vertiefung in den beschichteten 24-Well-Platten hinzu. </li></ol></li></ol>

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Diese Technik ermöglicht die zuverlässige Kultur der Rückenmark Neuronen. Sobald die Technik erreicht ist, dauert es ca. 3,5 Stunden. Wir konnten die Isolierung von Neuronen aus 2 getrennten Würfen (16 Mäuse insgesamt) in ca. 4 h durchführen. Der entscheidende Schritt in der Machbarkeit ist es, die Rückenmarke von den Mäusen kompetent zu extrahieren. Die Ausbeute ermöglicht das Plattieren von mehreren Vertiefungen und die Fähigkeit, die Neuronen unter verschiedenen Bedingungen zu testen. Wir konnten die Neuron...

<html> Das Verständnis der Rückenmarkpathologie erfordert die Verwendung verschiedener Modelle, sowohl auf makroskopischer als auch auf mikroskopischer Ebene. Große und kleine Tiermodelle 1 , 2 , 3 werden für in vivo Untersuchungen von Rückenmarkserkrankungen und Verletzungen verwendet. Während das Studium dieser Probleme in vivo hat seine Verdienste, ist die Analyse des Rückenmarks auf ganze Rückenmark-Homogenat oder Gewebe-Abschnitte 4 begrenzt . Dies schafft eine gewisse Unklarheit beim Versuch, spezifische Reaktionen und Ziele im Rückenmark unter seinen residenten Neuronen und umgebenden Glia zu isolieren. Die zunehmende Verfügbarkeit von genetisch manipulierten Mäusen ermöglicht detailliertere Untersuchungen der Biologie auf zellulärer und molekularer Ebene. So wird hier ein neonatales Mausmodell verwendet, das die Untersuchung der einzigartigen Eigenschaften und der Biologie der Rückenmark-Neuronen in vitro ermöglicht . Die Isolierung und Aufrechterhaltung von Neuronen in vitro ist nicht besonders einfach. Es gibt eine relative Häufigkeit von Techniken für die Neuronisolation aus dem kortikalen Gewebe von adulten Nagetieren, die in einer beträchtlichen Anzahl von isolierten Neuronen ( dh Millionen) 5 , 6 , 7. Im Gegensatz dazu ist die Ausbeute an Neuronen aus dem Rückenmarkgewebe geringer, 8 , 9 , 10 , zum Teil aufgrund der geringeren Gewebemasse. Darüber hinaus gibt es bei Mäusen eine relative Mangel an Techniken zur Isolierung von Neugeborenen Rückenmarksneuronen und bestehende Methoden sind durch niedrigere Neuronenausbeuten ( dh Hunderte) 9 oder mühsame und ressourcenschonende Techniken begrenzt, die die Isolierung von embryonalen Mäusen erfordern 10 . In diesem Protokoll, wirVerwenden Sie eine Technik, die die kosten- und ressourcenwirksame Isolierung einer beträchtlichen Anzahl von Neuronen aus den Rückenmarken von Neugeborenen ermöglicht. Wie es bei bisher veröffentlichten Techniken üblich ist, verwenden wir Papain als enzymatische Protease und erlauben die Freisetzung von Neuronen aus dem Rückenmarksgewebe 5 , 6 . Darüber hinaus verwenden wir einen Dichtegradienten für die raffinierte Zelltrennung, der sich bisher als wirksam erwiesen hat 6 , 10 . Während das Medium, in dem die Zellen inkubiert werden, in unserer Erfahrung variieren kann und wie bereits veröffentlicht 11 , ergänzt sich die Ergänzung mit frischem B27-Kulturmedium-Supplement als kritisch für die Neuron-Langlebigkeit. Die Neuronen sind typischerweise für bis zu 10 Tage lebensfähig, so dass eine Behandlung durchgeführt werden kann.

<table><tbody><tr><td>Hibernate A Medium - 500 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A1247501</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501</td></tr><tr><td>Hibernate A Minus Calcium - 500 mL</td><td>Brainbits</td><td>HA-Ca</td><td>http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/</td></tr><tr><td>Glutamax 100X - 100 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>35050061</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079</td></tr><tr><td>B27 Supplement 50X - 10 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>17504044</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044</td></tr><tr><td>Papain, Lyophilized - 100 mg</td><td>Worthington</td><td>LS003119</td><td>http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html</td></tr><tr><td>Neurobasal A Medium - 500 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10888022</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15140122</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine (PDL) hydrobromide - 5 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Mouse Laminin - 1 mg</td><td>Thermo-Fisher</td><td>23017015</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015</td></tr><tr><td>Trypan Blue - 20 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium - 250 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556-250ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440272-100ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306-1L</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Glass Pippette - 9&quot;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13-678-20C</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Pipette bulb - 5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z186678-3EA</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en&amp;amp;region=US&amp;amp;cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1</td></tr><tr><td>BRAND&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;Petri dish, glass - 60 x 15 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR455717-10EA</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Sterile 24-Well Cell Culture Plate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8812-100EA</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Hausser Hemacytometer (glass counting chamber)</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-671-6</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716</td></tr><tr><td>Glass Slides - 12 mm sterile cover glass - uncoated</td><td>Neuvitro</td><td>GG-12-1.5-Pre</td><td>http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm</td></tr><tr><td>NeuN Rabbit Monoclonal Antibody - 100 &amp;micro;L</td><td>Abcam</td><td>ab177487</td><td>After fixing in paraformaldehyde (PFA) and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:200 for 18 h in 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody - 50 &amp;micro;L</td><td>Abcam</td><td>ab11267</td><td>After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:500 for 18 h in 4 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

spinal cord neurons isolation and culture from neonatal mice

Wir stellen ein Protokoll für die Isolierung und Kultur der Rückenmark Neuronen. Die Neuronen werden aus neonatalen C57BL / 6-Mäusen gewonnen und sind am postnatalen Tag 1-3 isoliert. Ein Mausstreu, in der Regel 4-10 Welpen aus einem Zuchtpaar geboren, ist für ein Experiment gesammelt, und Wirbelsäule werden einzeln von jeder Maus nach Euthanasie mit Isofluran gesammelt. Die Wirbelsäule wird ausgeschnitten und dann wird das Rückenmark aus der Säule entnommen. Die Wirbelsäule werden dann gehackt, um die Oberfläche der Abgabe für eine enzymatische Protease zu erhöhen, die es ermöglicht, dass die Neuronen und andere Zellen aus dem Gewebe freigesetzt werden. Trituration wird dann verwendet, um die Zellen in Lösung freizusetzen. Diese Lösung wird anschließend in einem Dichtegradienten fraktioniert, um die verschiedenen Zellen in Lösung zu trennen, wodurch Neuronen isoliert werden können. Etwa 1-2,5 x 10 6 Neuronen können aus einer Wurfgruppe isoliert werden. Die Neuronen werden dann auf mit Klebstoff beschichteten Wells ausgesätRs, die für ein angemessenes Wachstum und Reifung zu ermöglichen. Die Neuronen dauern ca. 7 Tage, um die Reife im Wachstums- und Kulturmedium zu erreichen und können danach zur Behandlung und Analyse verwendet werden.

Mit dieser Technik erlaubt ein einzelner Wurf (4-10 Welpen) die Isolierung von 1-2,5 10 6 Neuronen, die für die Aussaat auf Kulturplatten geeignet sind. Typischerweise werden 4-8 Vertiefungen in der oben erwähnten Konzentration ( dh 300.000 Zellen / ml) ausgesät. Abbildung 3 zeigt das Auftreten von Neuronen in dieser Konzentration nach einer Woche in der Kultur bei der Nieder- ( a ) und der Hoch- ( b )...

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Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Diese Studie stellt eine Technik für die Isolierung von Neuronen aus WT neonatalen Mäusen vor. Es erfordert die sorgfältige Sezierung des Rückenmarks aus der neonatalen Maus, gefolgt von der Trennung von Neuronen aus dem Rückenmarksgewebe durch mechanische und enzymatische Spaltung.

Wirbelsäule Neuronen Isolierung und Kultur aus neonatalen Mäusen

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

spinal-cord-neurons-isolation-and-culture-from-neonatal-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.1K Aufrufe.  University of Colorado Anschutz Medical Campus.  Diese Studie stellt eine Technik für die Isolierung von Neuronen aus WT neonatalen Mäusen vor. Es erfordert die sorgfältige Sezierung des Rückenmarks aus der neonatalen Maus, gefolgt von der Trennung von Neuronen aus dem Rückenmarksgewebe durch mechanische und enzymatische Spaltung. 

Serie: Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. Neuroepithelial cells of the neural tube that express Nkx6.1 are the unique precursor cells for spinal motoneurons1. Though postmitotic motoneurons move towards their final position and organize themselves into columns along the spinal tract2,3. More than 90% of all these differentiated and positioned motoneurons express the transcription factors Islet 1/2. They innervate the muscles of the limbs as well as those of the body and the inner organs. Among others, motoneurons typically express the high affinity receptors for brain derived neurotrophic factor (BDNF) and Neurotrophin-3 (NT-3), the tropomyosin-related kinase B and C (TrkB, TrkC). They do not express the tropomyosin-related kinase A (TrkA)4. Beside the two high affinity receptors, motoneurons do express the low affinity neurotrophin receptor p75NTR. The p75NTR can bind all neurotrophins with similar but lower affinity to all neurotrophins than the high affinity receptors would bind the mature neurotrophins. Within the embryonic spinal cord, the p75NTR is exclusively expressed by the spinal motoneurons5. This has been used to develop motoneuron isolation techniques to purify the cells from the vast majority of surrounding cells6. Isolating motoneurons with the help of specific antibodies (panning) against the extracellular domains of p75NTR has turned out to be an expensive method as the amount of antibody used for a single experiment is high due to the size of the plate used for panning. A much more economical alternative is the use of lectin. Lectin has been shown to specifically bind to p75NTR as well7. The following method describes an alternative technique using wheat germ agglutinin for a preplating procedure instead of the p75NTR antibody. The lectin is an extremely inexpensive alternative to the p75NTR antibody and the purification grades using lectin are comparable to that of the p75NTR antibody. Motoneurons from the embryonic spinal cord can be isolated by this method, survive and grow out neurites.

An alternative way of isolating mouse embryonic motoneurons from the spinal cord is described. The method takes into account the fact that lectin can bind to the low affinity nerve growth factor receptor p75NTR. This lectin-based preplating allows a purification similar to that with a specific antibody against the p75NTR.

Lectin-basierte Isolierung und Kultivierung von embryonalen Maus-Motoneuronen

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Forschung

Neurowissenschaften

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Kultivierung Mikroglia aus dem Neugeborenen und Erwachsenen Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Immunologie und Infektion

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord Elektrophysiologie

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Biologie

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

Primäre Kultur der Neuronen isoliert von Embryonal Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) when compared to spinal motor neurons (SMNs). The ability to isolate and culture primary mouse CN3s, CN4s, and SMNs would provide an approach to study mechanisms underlying this selective vulnerability. To date, most protocols use heterogeneous cell cultures, which can confound the interpretation of experimental outcomes. To minimize the problems associated with mixed-cell populations, pure cultures are indispensable. Here, the first protocol describes in detail how to efficiently purify and cultivate CN3s/CN4s alongside SMNs counterparts from the same embryos using embryonic day 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgenic mouse embryos. The protocol provides details on the tissue dissection and dissociation, FACS-based cell isolation, and in vitro cultivation of cells from CN3/CN4 and SMN nuclei. This protocol adds a novel in vitro CN3/CN4 culture system to existing protocols and simultaneously provides a pure species- and age-matched SMN culture for comparison. Analyses focusing on the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of motor neurons are feasible in this culture system. This protocol will enable research into the mechanisms that define motor neuron development, selective vulnerability, and disease.

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

This work presents a protocol to yield homogeneous cell cultures of primary oculomotor, trochlear, and spinal motor neurons. These cultures can be used for comparative analyses of the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of ocular and spinal motor neurons.

Isolation und Kultur von Okulomotor, Trochlea, und Spinal Motor Neuronen von pränatalen Islmn:GFP Transgene Mäuse

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Embryonales Mausgehirn mischte Zellkulturen, um Infektionen und angeborene Immunität zu untersuchen

Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of neurons, astrocytes, oligodendrocytes, and microglia. Due to increasing efforts to replace and reduce animal use, a variety of in vitro cell culture systems have been developed to explore innate cell properties, which allow the development of therapeutics for CNS infections and pathologies. Whilst certain research questions can be addressed by human-based cell culture systems, such as (induced) pluripotent stem cells, working with human cells has its own limitations with regard to availability, costs, and ethics. Here, we describe a unique protocol for isolating and culturing cells from embryonic mouse brains. The resulting mixed neural cell cultures mimic several cell populations and interactions found in the brain in vivo. Compared to current equivalent methods, this protocol more closely mimics the characteristics of the brain and also garners more cells, thus allowing for more experimental conditions to be investigated from one pregnant mouse. Further, the protocol is relatively easy and highly reproducible. These cultures have been optimized for use at various scales, including 96-well based high throughput screens, 24-well microscopy analysis, and 6-well cultures for flow cytometry and reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) analysis. This culture method is a powerful tool to investigate infection and immunity within the context of some of the complexity of the CNS with the convenience of in vitro methods.

Autor im Rampenlicht: Etablierung gemischter neuronaler und glialer Zellkulturen aus embryonalen Mäusegehirnen zur Untersuchung von Infektionen und angeborener Immunität  

This protocol presents a unique way of generating central nervous system cell cultures from embryonic day 17 mouse brains for neuro(immuno)logy research. This model can be analyzed using various experimental techniques, including RT-qPCR, microscopy, ELISA, and flow cytometry.

Etablierung gemischter neuronaler und glialer Zellkulturen aus embryonalen Mäusegehirnen zur Untersuchung von Infektionen und angeborener Immunität

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of ...

Effiziente Extraktion von Astrozyten und Mikroglia aus dem Rückenmark der adulten Maus

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic cells exhibit rapid responses to environmental changes and display significant heterogeneity in terms of morphology, transcriptional profiles, and functions. While our understanding of the functions of glial cells in health and disease has advanced substantially, there remains a need for in vitro, cell-specific analyses conducted in the context of insults or injuries to comprehensively characterize distinct cell populations. Isolating cells from the adult mouse offers several advantages over cell lines or neonatal animals, as it allows for the analysis of cells under pathological conditions and at specific time points. Furthermore, focusing on spinal cord-specific isolation, excluding brain involvement, enables research into spinal cord pathologies, including experimental autoimmune encephalomyelitis, spinal cord injury, and amyotrophic lateral sclerosis. This protocol presents an efficient method for isolating astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating immediate or future analysis with potential applications in functional, molecular, or proteomic downstream studies.

Autor im Rampenlicht: Isolierung von Gliazellen aus dem Rückenmark der adulten Maus 

This protocol outlines the isolation of purified astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating subsequent applications such as RNA analysis and cell culture. It includes detailed cell dissociation methods and procedures designed to enhance both the quality and yield of isolated cells.

Isolierung von reinen Astrozyten und Mikroglia aus dem Rückenmark adulter Mäuse für In-vitro-Assays und Transkriptomstudien

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic ...

Wirbelsäule Neuronen Isolierung und Kultur aus neonatalen Mäusen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Lectin-basierte Isolierung und Kultivierung von embryonalen Maus-Motoneuronen

Kultivierung Mikroglia aus dem Neugeborenen und Erwachsenen Central Nervous System

Spinal Cord Elektrophysiologie

Primäre Kultur der Neuronen isoliert von Embryonal Mouse Cerebellum

Isolation und Kultur von Okulomotor, Trochlea, und Spinal Motor Neuronen von pränatalen Isl^mn:GFP Transgene Mäuse

Etablierung gemischter neuronaler und glialer Zellkulturen aus embryonalen Mäusegehirnen zur Untersuchung von Infektionen und angeborener Immunität

Etablierung gemischter neuronaler und glialer Zellkulturen aus embryonalen Mäusegehirnen zur Untersuchung von Infektionen und angeborener Immunität

Etablierung gemischter neuronaler und glialer Zellkulturen aus embryonalen Mäusegehirnen zur Untersuchung von Infektionen und angeborener Immunität

Isolierung von reinen Astrozyten und Mikroglia aus dem Rückenmark adulter Mäuse für In-vitro-Assays und Transkriptomstudien

Isolierung von reinen Astrozyten und Mikroglia aus dem Rückenmark adulter Mäuse für In-vitro-Assays und Transkriptomstudien