Name: chromatin immunoprecipitation (chip) in mouse t-cell lines
Uploaded: 2017-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines at JoVE.com

Siamo grati a P. Käse e T. Schmidt-Wöll per un&#39;ottima assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dalla borsa di studio collaborativa TRR81 e dal programma Heisenberg (BO 1639 / 5-1) della DFG (la Fondazione di ricerca tedesca), della Max Planck Society e della EXC 294 di Friburgo e del Cluster di eccellenza per il sistema cardio-polmonare (ECCPS) a Giessen alla TB

NOTA: Tutti i buffer e il mezzo utilizzato in questo protocollo sono elencati nella tabella 1 . Giorni 1 e 2 1. Incrociare le cellule <ol><li> Trasferire le cellule T da topo da una piastra a 6 pozzetti a un tubo da 50 mL e centrifugare per 5 min a 4 ° C e ~ 271 x g. Resuspendere il pellet cellulare in 30 ml di terreno di coltura cellulare IMDM e contare le cellule utilizzando una camera Neubauer. </li><li> Raccogliere aliquote di 20 x 10 6 cellule in nuovi tubi da 50 ml. </li><li> Aggiungere la formaldeide (FMA) ad una concentrazione finale del 1% direttamente al mezzo di coltura cellulare e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Attenzione: la FMA è tossica se inalato, quindi lavorare sotto una cappa di fumo e indossare attrezzature di protezione adeguate. Inoltre, si prega di gestire i rifiuti FMA secondo le regole dell&#39;istituto ospitante. </li><li> Aggiungere un volume di 1/8 di glicina 1 M, pH 7,0 e incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Pellet le cellule per centrifugazione per 5Min a 4 ° C e ~ 271 xg e lavare con 10 ml di soluzione salina fosfata-tamponata (PBS). </li><li> Lavare il pellet cellulare con 1 ml di PBS e trasferire in tubi da 1,5 ml. </li></ol> 2. Lysis cellulare e cricatura di cromatina <ol><li> Resuspendere il pellet cellulare in 1 ml di tampone di lisi SDS e incubare su ghiaccio per 10 min. </li><li> Trasferire ogni campione in un tubo di sonicazione e eseguire la tranciatura utilizzando un ultrasonicator focalizzato in base alle impostazioni indicate nella tabella 2. </li><li> Dopo il taglio, trasferire i campioni su tubi da 1,5 ml e centrifugare per 10 minuti a 4 ° C e ~ 18,000 x g. </li><li> Trasferire il surnatante ai nuovi tubi. </li><li> Raccogliere 50 μl per determinare l&#39;efficienza di taglio secondo la fase 3 e congelare il lattato tagliato in azoto liquido. Conservare il lisato in aliquote monouso a -80 ° C. </li></ol> 3. Determinazione dell&#39;efficienza di taglio <ol><li> Aggiungere 50 μl di tampone di eluizione al 50 &amp;181 L di ogni lisato tritato e incubare a 65 ° C per una notte, con agitazione. </li><li> Aggiungere 100 μl di tampone TE e 4 μL di 10 mg / mL RNasi A (0,2 μg / μL di concentrazione finale). Mescolare e incubare per 2 ore a 37 ° C, con agitazione. </li><li> Aggiungere 2 μL di 20 mg / mL proteinasi K (0,2 μg / μl di concentrazione finale) ad ogni campione e incubare per 2 ore a 55 ° C, agitando. </li><li> Trasferire ogni campione in un tubo di gel idoneo all&#39;estrazione di fenolo / cloroformio / isoamilico; Maneggiare secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Aggiungere 200 μl di fenolo / cloroformio / isoamilico alcool (25: 24: 1) e scuotere i tubi. Centrifugare per 5 min a 24 ° C e ~ 16.000 xg e trasferire la fase superiore a nuovi tubi. Attenzione: Il fenolo, il cloroformio e l&#39;isoamilico sono tossici se inalizzati e corrosivi; Lavorare sotto un cappuccio e utilizzare adeguate attrezzature di protezione individuale. Inoltre, trattare i residui di fenolo, cloroformio e isoamil acSecondo le regole dell&#39;istituzione ospitante. <ol><li> Ripetere una volta. </li></ol></li><li> Purificare il DNA utilizzando colonne di purificazione secondo l&#39;istruzione del produttore, con le seguenti modifiche: <ol><li> Lavare due volte la membrana. Dopo l&#39;ultimo lavaggio lasciare il tubo aperto per 2 minuti a temperatura ambiente per evaporare l&#39;etanolo residuo. </li><li> Per l&#39;eluizione, aggiungere 50 μl di H 2 O, incubare a temperatura ambiente per 1 min, spin il tubo per 1 s per bagnare correttamente la membrana e incubare a temperatura ambiente per 1 min prima di eluire il DNA per centrifugazione per 1 min 24 ° C e ~ 17.900 x g. </li></ol></li><li> Quantificare il DNA purificato su un fluorometro utilizzando un kit di alta sensibilità secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Analizzare circa 500 ng del DNA purificato su un agarosio di 1,8% e circa 1 ng su un sistema di elettroforesi usando un kit di alta sensibilità. NOTA: il siz attesoE dei frammenti di DNA è compresa tra 200 e 500 bp. </li></ol> Giorni 3 e 4 4. Immunoprecipitazione <ol><li> Diluire 1 volume di lisato tagliato con 5 volumi di tampone di diluizione. </li><li> Preclear con 30 μL / mL di agarosio A di proteina A (preparato in conformità all&#39;Appendice A ) per 30 minuti mentre ruota nella stanza fredda. </li><li> Centrifugare a 4 ° C per 5 minuti a ~ 750 x g. </li><li> Raccogliere il 10% dell&#39;input e conservarlo a 4 ° C. </li><li> Aliquota la quantità desiderata di lisato nei nuovi tubi (per ulteriori dettagli vedere la Tabella 3 ). Aggiungere gli anticorpi desiderati a ciascun tubo (vedere la tabella 3 per i dettagli) e ruotare per una notte a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 40 μL di proteine ​​A e incubare per 1 h a 4 ° C durante la rotazione. </li><li> Lavare le perle con 1 ml di tampone di sale basso, tampone ad alto sale, LiCl buffer e tampone TE (per ogni lavaggio, incubare per 5 minuti a 4 ° C durante la rotazione e centrifugarePer 3 minuti a 4 ° C e ~ 950 xg). Vedere la Tabella 3 per i dettagli. </li><li> Aggiungere 110 μl di tampone di eluizione e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente, vorticando ogni 2 min. </li><li> Centrifugare per 3 min a 4 ° C e ~ 950 xg e trasferire 100 μL di supernatante in un nuovo tubo da 1,5 ml. </li><li> Ripetere i passaggi 4.7-4.8 con 100 μl di tampone di eluizione e combinare gli eluati. Aggiungere un buffer di eluizione fino a 200 μL per immettere i campioni. </li><li> Incubare tutti i campioni durante la notte a 65 ° C, con agitazione. </li></ol> Giorno 5 5. Purificazione del DNA <ol><li> Aggiungere 200 μl di tampone TE ad ogni eluato e 8 μL di 10 mg / mL RNasi A (0,2 μg / μL di concentrazione finale). Mescolare e incubare per 2 ore a 37 ° C, con agitazione. </li><li> Aggiungere 4 μl di 20 mg / mL proteinasi K (0,2 μg / μL di concentrazione finale) ad ogni eluato e incubare per 2 ore a 55 ° C, con agitazione. </li><li> Trasferire ogni campione in un gelTubo adatto all&#39;estrazione di fenolo / cloroformio / isoamilico; Maneggiare secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Aggiungere 400 μl di fenolo / cloroformio / isoamilico alcool (25: 24: 1) e scuotere i tubi. Centrifugare per 5 min a 24 ° C e ~ 16.000 x g. Trasferire la fase superiore ai nuovi tubi. Attenzione: Il fenolo, il cloroformio e l&#39;isoamilico sono tossici se inalizzati e corrosivi; Lavorare sotto un cappuccio e utilizzare adeguate attrezzature di protezione individuale. Inoltre, trattare i rifiuti di fenolo, cloroformio e alcol di isoamilico secondo le regole dell&#39;istituto ospitante. <ol><li> Ripetere una volta. </li></ol></li><li> Purificare il DNA utilizzando colonne di purificazione secondo le istruzioni del produttore, con le seguenti modifiche: </li><li> Lavare due volte la membrana. Dopo l&#39;ultimo lavaggio lasciare i tubi aperti per 2 minuti a temperatura ambiente per evaporare l&#39;etanolo residuo. </li><li> Per l&#39;eluizione, aggiungere 50 μl di H 2 O, incubare a temperatura ambientePer 1 min, spin i tubi per 1 s per bagnare la membrana in modo adeguato e incubare a temperatura ambiente per 1 min prima di eluire il DNA mediante centrifugazione per 1 min a 24 ° C e ~ 17.900 x g. </li></ol>

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Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

ChIP è una tecnica valida per indagare se le proteine ​​oi loro PTM sono arricchite in regioni genomiche specifiche. I risultati del test di ChIP sono spesso impegnativi per interpretare a causa di motivi biologici o tecnici. Le ragioni biologiche sono molteplici e includono il legame debole o indiretto delle proteine ​​al DNA. Ci sono anche limitazioni tecniche, come la limitata specificità degli anticorpi e la lisi cellulare inefficace o la cricatura di cromatina. Una guida alla risoluzione dei problemi ( Tabella 5 ) può aiutare il lettore a risolvere i problemi che potrebbero verificarsi con i test ChIP. Questo protocollo, facendo uso di un dispositivo ultrasonator focalizzato sul raffreddamento, consente di tagliare in modo efficiente la cromatina di una linea cellulare T cellula matura. La fase principale critica del protocollo è rappresentata dalla tranciatura della cromatina, che deve sempre essere ottimizzata per ciascun tipo di cellula. Si suggerisce di variare il numero di celle e il numero di cicli di sonicazione. Inoltre, lei<html> L&#39;efficienza dell&#39;azione è influenzata negativamente dalla presenza di precipitazioni di SDS nei campioni che possono formarsi durante la lisi delle cellule sul ghiaccio con buffer di lisi SDS. In questo caso, è meglio incubare il campione dopo la lisi a temperatura ambiente per alcuni minuti per ridurre la presenza di precipitazioni SDS. Si raccomanda di ottimizzare il protocollo per ottenere frammenti tagliati tra 200 e 500 bp e valutare sempre la qualità di taglio dei campioni prima di procedere con l&#39;immunoprecipitazione. Inoltre, il tempo di fissazione, la quantità di anticorpo e / o le cellule e le condizioni di lavaggio devono essere ottimizzate per ciascun anticorpo. Un ulteriore passo avanti nella realizzazione di una procedura ChIP è la scelta dell&#39;anticorpo, poiché gli anticorpi a bassa specificità riducono in modo significativo l&#39;efficacia dell&#39;immunoprecipitazione. In precedenza, una procedura di test di qualità unificata ha permesso di valutare la specificità di diversi anticorpi disponibili sul mercato<html> Ss = &quot;xref&quot;&gt; 19. La pipeline di screening è stata basata su macchia dot blot, Western blot e ChIP, fornendo un elenco di reagenti di alta qualità adatti per ChIP 19 . Più recentemente, la specificità di alcuni anticorpi disponibili in commercio è stata valutata usando piattaforme microarray a peptide ad alta densità di istone, consentendo la creazione di un database sulla specificità degli anticorpi 20 . Il lettore può utilizzare questo strumento utile per identificare gli anticorpi più specifici che possono essere utilizzati per gli esperimenti ChIP. Questo protocollo non è stato testato per le cellule T primarie e, in questo caso, il lettore dovrebbe fare riferimento a altri protocolli pubblicati che eseguono con successo ChIP sulle cellule T primarie 3 , 4 , 21 . In particolare, questo protocollo è stato utilizzato con successo per eseguire ChIP su una linea di cellule T progenitor del mouse, così come su una linea cellulare endoteliale. Ove_content &quot;&gt; 5 x 10 6 cellule dovrebbero essere utilizzate per ogni immunoprecipitazione per l&#39;analisi dei segni di istone.Perché questo protocollo può anche essere adatto, con qualche ottimizzazione, per eseguire ChIP su TF o cofattori, è meglio aumentare il numero di cellule Utilizzata per l&#39;immunoprecipitazione in questi casi.Per arrivare al numero di cellule richiesto per ogni esperimento, più aliquote di lutea tagliata possono essere raggruppate insieme prima di diluire la cromatina nel tampone di diluizione. Questo protocollo potrebbe anche essere modificato per eseguire ChIP sulle proteine ​​endogene che non si legano direttamente al DNA. In questo caso, è possibile richiedere la pre-fissazione con crosslinkers proteico-proteico ( ad esempio, dimetiladipimidato, DMA) (vedere l&#39;Appendice B per ulteriori informazioni). La buona prestazione di ChIP sui cofattori è stata precedentemente effettuata mediante sovraespressione di proteine ​​che sono fuse con un tag biotinico. In questo caso, la proteina è stata purificata con streptavidin-conjugaPerline magnetiche, e una pre-fissazione con DMA è stata eseguita 22 .

Lo sviluppo, la differenziazione e l&#39;omeostasi dipendono da specifici programmi di espressione genica che vengono stabiliti mediante segnalazione di eventi che modulano la struttura della cromatina e pertanto determinano se un determinato gene viene attivato o represso in maniera cellulare e temporale. Durante lo sviluppo di cellule T, devono essere stabiliti programmi specifici di espressione genica per determinare correttamente la maturazione dei precursori delle cellule T dal doppio negativo (DN) allo stato singolo-positivo (SP), passando attraverso diverse fasi intermedie 1 . Come il programma di espressione genica è dinamicamente regolato durante lo sviluppo di cellule T è stato ampiamente studiato negli anni precedenti da diversi laboratori 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Con modificazioni post-traduzionali (PTMs) di istoni, lo scambio diIsonici canonici con varianti istone, sfratto nucleosomi e metilazione del DNA regolano l&#39;interruttore ON / OFF dei geni. Diversi gruppi hanno esaminato la distribuzione genoma di PTM e varianti istone per determinare marcature associate a diversi stati di cromatina sia nelle regioni regolatori prossimali che distali 7 , 8 , 9 , 10 . Le cascate di segnalazione orchestrano la regolazione dinamica della cromatina mediante lo scambio di enzimi positivi e negativi che modificano cromatina (noti anche come modificatori di cromatina) ad elementi specifici di potenziamento. Questi modificatori di cromatina regolano la struttura della cromatina e quindi la produzione trascrizionale con, ad esempio, la metilazione dinamica dell&#39;istone e l&#39;acetilazione. Questo è il caso nel percorso di segnalazione Notch 11 , 12 , 13 ,14. Dinamico istone PTMs; Scambi con varianti istone; E l&#39;occupazione dinamica degli istoni, dei fattori di trascrizione e dei cofattori può essere studiata mediante saggi di cromatin immunoprecipitazione (ChIP). Gli anticorpi altamente specifici vengono usati per purificare specifici complessi proteici del DNA e il DNA purificato viene analizzato mediante PCR quantitativo (qPCR); Sequenza profonda (ChIP-Seq); O, meno frequentemente, l&#39;ibridazione a microarray (ChIP-ChIP). I test di ChIP sono talvolta impegnativi a causa di complicanze con la lisi delle cellule, taglio della cromatina e / o bassa specificità degli anticorpi. Sono state adottate diverse strategie per migliorare il protocollo, come avviene per NEXSON 15 . L&#39;uso di sonicatori a bagno d&#39;acqua raffreddato evita il riscaldamento del campione che potrebbe danneggiare gli epitopi presenti sulla proteina in esame, ma l&#39;energia necessaria per la tranciatura dei campioni viene disperdita nell&#39;acqua.Un altro miglioramento è stato fatto con lo sviluppo di dispositivi a ultrasuoni focalizzati che impediscono la dispersione dell&#39;energia. Pertanto, i dispositivi a ultrasuoni focalizzati consentono di migliorare la lisi cellulare e la cricatura, eliminando le variazioni indotte dall&#39;operatore e aumentando notevolmente la riproducibilità. Questo lavoro descrive un protocollo (riepilogo schematico in Figura 1 ) per eseguire in modo efficiente il ChIP delle proteine ​​dell&#39;istone in una linea di cellule T di topi chiamata E2-10HA 16 , 17 . Le cellule T sono di solito difficili da lire e la loro cromatina è stata rivelata inefficiente. In questo protocollo, che utilizza un ultrasonicator raffreddato a raffreddamento, il numero di cellule, il buffer di lisi e l&#39;impostazione di taglio sono stati ottimizzati per la linea di cellule T2 mouse da mouse E2-10HA. Questo protocollo consente di eseguire ChIP con un&#39;elevata riproducibilità e in un tempo ragionevole. In effetti, richiedeCirca due giorni per tagliare la cromatina e valutare la qualità della tranciatura e tre giorni per eseguire l&#39;immunoprecipitazione, invertire il reticolato e purificare il DNA.

<table><tbody><tr><td>Agilent High Sensitivity D5000 Reagents</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5593</td><td></td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5592</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Tapestation 4200</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S220 AFA System</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td></td></tr><tr><td>dimethyl adipimidate (DMA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20660</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Pan-Biotech</td><td>1502-P121301</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde (FMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Insulin solution human&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&#039;s modified Dulbecco&#039;s medium (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>nProtein A Sepharose 4 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5280-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&lt;br /&gt;(10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Peptone primatone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4963-100G</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy 2&amp;nbsp;mL</td><td>5 Prime</td><td>2302830</td><td></td></tr><tr><td>Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td><td>Roth</td><td>A156.2</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>GIBCO</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>RNase A, DNase and protease-free (10&amp;nbsp;mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Tube AFA Fiber &amp;amp; Cap</td><td>Covaris</td><td>520081</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation (chip) in mouse t-cell lines

I percorsi di segnalazione regolano i programmi di espressione genica attraverso la modulazione della struttura della cromatina a diversi livelli, ad esempio mediante modificazioni post-traslazionali (PTM) delle code di istone, lo scambio di istoni canonici con varianti istone e lo sfratto nucleosomico. Tale regolazione richiede il legame dei fattori di trascrizione sensibili al segnale (TFs) che reclutano gli enzimi che modificano cromatina agli elementi regolatori definiti come potenziatori. Comprendere come le cascate di segnalazione regolino l&#39;attività di miglioramento richiede un&#39;analisi completa del legame delle TF, degli enzimi che modificano cromatina e l&#39;occupazione di marchi specifici di istone e di varianti istone. I campioni di immunoprecipitazione cromatina (ChIP) utilizzano anticorpi altamente specifici per immunoprecipitazioni di complessi proteici / DNA specifici. La successiva analisi del DNA purificato consente di identificare la regione occupata dalla proteina riconosciuta dall&#39;anticorpo. Questo lavoro descrive un protocollo in modo efficiente peRform ChIP di proteine ​​di istone in una linea cellulare T-cellule matura. Il protocollo presentato consente di eseguire i test ChIP in un tempo ragionevole e con un&#39;elevata riproducibilità.

Le cellule T murine mature sono state sottoposte ad analisi ChIP per indagare l&#39;arricchimento della mono-metilazione della lisin 4 sulla istone 3 (H3K4me1), tri-metilazione della lisina 4 sull&#39;istone 3 (H3K4me3) e l&#39;acetilazione della lisina 27 Istone 3 (H3K27ac), così come l&#39;occupazione nucleosomica, come rivelato da panH3 ChIP. La qualità di taglio è stata valutata mediante analisi su un agarosio di 1,8% ( Figura 2A ) e su un sistema di elettroforesi ( Figura 2B ). H3K4me1 e H3K4me3 sono generalmente utilizzati per identificare rispettivamente siti e promotori di miglioramento ( Figura 3A ). Infatti, H3K4me3 è prominente ma non solo arricchito nei promotori 5 , 8 , 14 . Una caratteristica di valorizzatori attivi deve essere altamente arricchita per H3K4me1 e H3K27ac e poco arricchita per H3K4me3 (&lt;(Figura 3A, pannello superiore), mentre gli incrementi inattivi presentano bassi livelli di H3K4me3 e H3K27ac, ma livelli elevati di H3K4me1 ( Figura 3A , pannello inferiore). Come mostrato nella figura 3B , il gene Glyceraldehyde 3-fosfato deidrogenasi ( Gapdh ) è rappresentativo dell&#39;analisi di promotori di gene attivi ( promotore di Gapdh ). Infatti, mostra livelli elevati di H3K4me3 e H3K27ac e bassi livelli di H3K4me1. Nella figura 3B , Deltex1 ( Dtx1 ) è rappresentativo di valorizzatori inattivi ( Dtx1 enhancer ), in quanto è altamente arricchito per H3K4me1 e poco arricchito per H3K4me3 e H3K27ac. Il deserto di Gene è rappresentativo di una regione priva di geni di codifica e di solito è stata citata come un controllo negativo per i segni attivi di cromatina. L&#39;osservazione che H3K4me1, un marchio di miglioramento ben accolto 4 , 5 , </sup&gt; 7 , 14 , 18 , non è arricchito nel deserto del Gene suggerisce che questa regione manca di potenziatori. <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig1.jpg" /> Figura 1: Panoramica schematica del protocollo ChIP presentato. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig2.jpg" /> Figura 2: Controllo della qualità di taglio della linea di cellule T cellule mature. ( A ) Sono state tagliate due aliquote diverse della linea di cellule T-cellule T210HA del mouse, e circa 500 ng di DNA purificato sono state analizzate su un agarosio di 1,8% per valutare il loro taglioQualità. ( B ) 1 ng di DNA purificato del campione 2 è stato analizzato mediante elettroforesi per valutare la sua qualità di taglio. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig3.jpg" /> Figura 3: segni di cromatina che caratterizzano promotori e promotori. ( A ) I potenziatori attivi (pannello superiore) sono caratterizzati da un elevato livello H3K4me1, basso H3K4me3 e alto H3K27ac, mentre i rialzatori inattivi (pannello inferiore) presentano elevati livelli H3K4me1, basso H3K4me3 e basso H3K27ac. ( B ) I campioni presentati nella Figura 2A sono stati raggruppati e utilizzati per l&#39;analisi di ChIP contro i contrassegni istoni H3K4me1, H3K4me3 e H3K27ac e l&#39;occupazione dell&#39;istone, come rivelato da panH3 ChIP. Questa analisi mostra che thE promotore del gene di mantenimento Glyceraldehyde 3-fosfato deidrogenasi ( promoter Gapdh ) è altamente arricchito per H3K4me3 e H3K27ac e abbastanza arricchito per H3K4me1. D&#39;altra parte, l&#39;enhancer del gene inattivo Deltex1 ( Dtx1 enhancer ) è altamente arricchito per H3K4me1 ma poco arricchito per H3K4me3 e H3K27ac. ChIP utilizzando un anticorpo panH3 è stato utilizzato per indagare l&#39;occupazione dei nucleosomi. Il deserto del gene è stato usato come un controllo negativo. Viene mostrato un esperimento rappresentativo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nome del buffer </td><td> Reagente </td><td> Concentrazione finale </td></tr><tr><td rowspan="5"> Tampone di diluizione </td><td> Sodio dodecIl solfato (SDS) </td><td> 0,01% (w / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1,1% (v / v) </td></tr><tr><td> Acido etilendiamintetraoacetico (EDTA) pH 8,0 </td><td> 1,2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 16,7 mM </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio (NaCl) </td><td> 167 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> Soluzione DMA </td><td> Dimetil adipimidato (DMA) </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Salina di tampone fosfato (PBS) </td><td> 1x </td></tr><tr><td rowspan="3"> Tampone di eluizione </td><td> Sodio dodecilsolfato (SDS) </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> Acido etilendiamintetraoacetico (EDTA) pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8,0 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Alta tampone di sale </td><td> Sodio dodecilsolfato (SDS) </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> EthylenediamiAcido nitrutametico (EDTA) pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio (NaCl) </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td rowspan="6"> IMDM medium </td><td> Il mezzo di Dulbecco modificato da Iscove (IMDM) </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Siero del bovino fetale (FBS) </td><td> 2% (v / v) </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Peptone primatone </td><td> 0,3 mg / ml </td></tr><tr><td> Soluzione insulinica umana </td><td> 4,8 mg / ml </td></tr><tr><td> Minimo amminoacidi essenziali non essenziali (MEM NEAA) </td><td> 1x </td></tr><tr><td rowspan="4"> Tampone di sale di LiCl </td><td> Cloruro di litio (LiCl) </td><td> 0,25 M </td></tr><tr><td> IGEPAL-CA630 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> Acido etilendiamintetraoacetico (EDTA) pH 8,0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Basso buffer di sale </td><td> Sodio dodecilsolfato (SDS) </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> Acido etilendiamintetraoacetico (EDTA) pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio (NaCl) </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Tampone di lavaggio dei branchi di proteine ​​A Sepharose </td><td> Tris-HCl pH 8,0 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio (NaCl) </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td> Acido etilendiamintetraoacetico (EDTA) pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Sodio dodecilsolfato (SDS) </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> IGEPAL-CA630 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Buffer SDS Lysis </td><td> Sodio dodecilsolfato (SDS) </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> EthylenediAcido aminetraacetico (EDTA) pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> TE buffer </td><td> Tris-HCl pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Acido etilendiamintetraoacetico (EDTA) pH 8,0 </td><td> 1 mM </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Elenco dei buffer e del mezzo utilizzato in questo protocollo. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> SOPRA </td><td> OFF </td></tr><tr><td> Picco di potenza </td><td> 150.0 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Fattore di dovere </td><td> 15.0 </td><td> 15.0 </td></tr><tr><td> Cicli / scoppio </td><td> 500 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Numero di cicli </td><td colspan="2"> 28 </td></tr></tbody></table>Tabella 2: Shearing delle impostazioni utilizzate in questo protocollo . Queste condizioni sono state ottimizzate per una linea cellulare T-cellule matura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Fornitore </td><td> Quantità di anticorpo / immunoprecipitazione </td><td> Quantità di cellule / immunoprecipitazione </td><td> Condizioni di lavaggio </td></tr><tr><td> H3 </td><td> Abcam (ab1791) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Una volta in tampone di sale basso, due volte nel tampone di sale alto, due volte in tampone di sale LiCl e tre volte in tampone TE </td></tr><tr><td> H3K4me1 </td><td> Abcam (ab8895) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Una volta in tampone di sale basso, due volte nel tampone di sale alto, due volte in tampone di sale LiCl e tre volte in tampone TE </td></tr><tr><td> H3K4me3 </td><td> Diagenode (pAb-003-050) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Una volta in tampone di sale basso, due volte nel tampone di sale alto, due volte in tampone di sale LiCl e tre volte in tampone TE </td></tr><tr><td> H3K27ac </td><td> Diagenode (pAb-174-050) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Oce in tampone di sale basso, due volte nel tampone di sale alto, due volte in tampone di sale LiCl e tre volte in tampone TE </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Diagenode (C15410206) </td><td> Variabile* </td><td> Variabile* </td><td> Variabile* </td></tr><tr><td colspan="5"> * Nel caso del controllo IgG, la quantità di anticorpi e cellule, nonché i passi di lavaggio, devono rispecchiare le condizioni delle altre immunoprecipitazioni. </td></tr></tbody></table> Tabella 3: Anticorpi e condizioni di lavaggio utilizzate in questo studio. <table border="1" fo:keEp-together.within-page = &quot;1&quot; per: keep-with-next.within-page = &quot;sempre&quot;&gt; <tbody><tr><td> Gene </td><td> Primer avanti </td><td> Primer inverso </td><td> sonda </td></tr><tr><td> Promotore di Gapdh (0 kb) </td><td> 5&#39;-GGG TTC CTA TAA ATA CGG ATTO GC-3 &#39; </td><td> 5&#39;-CTG GCA CTG CAC AAG AAG A-3 &#39; </td><td> 68 </td></tr><tr><td> Enhancer Dtx1 (+26 kb) </td><td> 5&#39;-CTC TGG GTT GTA GGG GAC AG-3 &#39; </td><td> 5&#39;-GCA TGG GAA CTG TGT TAC AGA A-3 &#39; </td><td> 27 </td></tr><tr><td> Deserto del gene </td><td> 5&#39;-CAA TGC ATG GGT CCA GAT TT-3 &#39; </td><td> 5&#39;-ATT GGC ACG GAA GTA GTG CT-3 &#39; </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> Tabella 4: Primer e sonde utilizzate per qPCR in questo studio. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> Problema </td><td> Le cause </td><td> Soluzione </td></tr><tr><td rowspan="3"> La cromatina è sotto tosatura e i frammenti sono troppo grandi. </td><td> Sono state utilizzate troppe cellule. </td><td> Ridurre il numero di celle. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Il taglio è troppo basso. </td><td> Aumenta il numero di cicli di taglio. </td></tr><tr><td> Aumenta la potenza di picco di taglio, il fattore di carico e / oi cicli / burst. </td></tr><tr><td rowspan="3"> La cromatina è troppo tesa e i frammenti sono troppo piccoli. </td><td> Sono state utilizzate troppo poche cellule. </td><td> Aumenta il numero di celle. </td></tr><tr><td rowspan="2"> La cesoia è troppo alta. </td><td> Ridurre il numero di cicli di taglio. </td></tr><tr><td> Ridurre la potenza di picco di taglio, il fattore di carico e / oi cicli / burst. </td></tr><tr><td rowspan="11"> Troppo basso di recupero rispetto a meControllo gG e / o controllo negativo (alto sfondo). </td><td> Non è sufficiente cromatina utilizzata per l&#39;esperimento. </td><td> Aumenta la quantità di cromatina. </td></tr><tr><td> Il numero di anticorpi è troppo basso. </td><td> Aumenta la quantità di anticorpo. </td></tr><tr><td> Il numero di anticorpi è troppo elevato. </td><td> Ridurre la quantità di anticorpi. </td></tr><tr><td> L&#39;anticorpo ha bassa specificità. </td><td> Cambiare l&#39;anticorpo. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Le condizioni di lavaggio sono troppo severe. </td><td> Ridurre il numero di lavaggi. </td></tr><tr><td> Ridurre la rigidità dei tamponi di lavaggio. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Le condizioni di lavaggio non sono abbastanza rigorose. </td><td> Aumenta il numero di lavaggi. </td></tr><tr><td> Aumenta la rigidità dei tamponi di lavaggio. </td></tr><tr><td> Troppo DNA è stato pipettato nel qPCR. </td><td> Ridurre la quantità di DNA pipettata nel qPCR. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Le condizioni qPCR non sono ottimali. </td><td> Ottimizzare le condizioni qPCR. </td></tr><tr><td> Ridurre il numero di cicli. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Nessun prodotto o prodotto è troppo basso nella reazione qPCR del campione di input. </td><td> Non è stato sufficiente un DNA pipettato nel qPCR. </td><td> Aumenta la quantità di DNA pipettata nel qPCR. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Le condizioni qPCR non sono ottimali. </td><td> Ottimizzare le condizioni qPCR. </td></tr><tr><td> Aumenta il numero di cicli. </td></tr><tr><td> Non è sufficiente cromatina utilizzata per l&#39;esperimento. </td><td> Aumenta la quantità di cromatina. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Nessun segnale nel controllo positivo e / o PanH3 ChIP. </td><td> Non è sufficiente cromatina utilizzata per l&#39;esperimento. </td><td> Aumenta la quantità di cromatina. </td></tr><tr><td> Il numero di anticorpi è troppo basso. </td><td> Aumenta la quantità di anticorpo. </td></tr><tr><td> L&#39;antiIl corpo ha una bassa specificità. </td><td> Cambiare l&#39;anticorpo. </td></tr><tr><td> L&#39;eluizione è sub-ottimale. </td><td> Assicurarsi di vorticarsi frequentemente i campioni per mantenere le perle in soluzione. </td></tr></tbody></table> Tabella 5: Risoluzione dei problemi.

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Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Questo lavoro descrive un protocollo per l&#39;immunoprecipitazione cromatina (ChIP) usando una linea cellulare T-cellula matura. Questo protocollo è idoneo per indagare la distribuzione di marchi specifici di istoni in siti specifici di promozione o nel genoma.

Immunoprecipitazione cromatinica (ChIP) nelle linee di cellule T delle cellule

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

18.3K Views.  University of Giessen.  Questo lavoro descrive un protocollo per l'immunoprecipitazione cromatina (ChIP) usando una linea cellulare T-cellula matura. Questo protocollo è idoneo per indagare la distribuzione di marchi specifici di istoni in siti specifici di promozione o nel genoma. 

Video: Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a high content of structural proteins. Dissected limb muscles from adult mice are physically disrupted by mechanical homogenisation, or a combination of mincing and douncing, in a hypotonic buffer before formaldehyde fixation of the cell lysate. The fixed nuclei are purified by further cycles of mechanical homogenisation or douncing and sequential filtrations to remove cell debris. The purified nuclei can be sonicated immediately or at a later stage after freezing. The chromatin can be efficiently sonicated and is suitable for chromatin immunoprecipitation experiments, as illustrated by the profiles obtained for transcription factors, RNA polymerase II, and covalent histone modifications. The binding events detected using chromatin prepared by this protocol are predominantly those taking place in the muscle fiber nuclei despite the presence of chromatin from other fiber-associated satellite and endothelial cells. This protocol is therefore adapted to study gene regulation in the adult mouse skeletal muscle.

A novel protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle adapted to the study of gene regulation in muscle fibers by chromatin immunoprecipitation is presented.

Miglioramento protocollo per immunoprecipitazione della cromatina dal Mouse del muscolo scheletrico

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Ricerca

Biochimica

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

Immunoprecipitazione della cromatina del tessuto adiposo marrone murino

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Genetica

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Immunoprecipitazione della cromatina di cellule staminali embrionali umane

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Biologia

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

Cromatina Immunoprecipitazioni Analisi Utilizzando Nucleasi Micrococal nelle cellule di Mammaliana

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled with high-throughput sequencing (ChIP-seq) is widely used to identify genome-wide binding locations of DNA-binding proteins. However, the ChIP-seq method is limited by its heterogeneity in length of sonicated DNA fragments and non-specific background DNA, resulting in low mapping resolution and uncertainty in DNA-binding sites. To overcome these limitations, the combination of ChIP with exonuclease digestion (ChIP-exo) utilizes 5&#8217; to 3&#8217; exonuclease digestion to trim the heterogeneously sized immunoprecipitated DNA to the protein-DNA crosslinking site. Exonuclease treatment also eliminates non-specific background DNA. The library-prepared and exonuclease-digested DNA can be sent for high-throughput sequencing. The ChIP-exo method allows for near base-pair mapping resolution with greater detection sensitivity and reduced background signal. An optimized ChIP-exo protocol for mammalian cells and next-generation sequencing is described below.

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

Precise determination of protein-binding locations across the genome is important for understanding gene regulation. Here we describe a&#160;genomic mapping method that treats chromatin-immunoprecipitated DNA with exonuclease digestion (ChIP-exo) followed by high-throughput sequencing. This method detects protein-DNA interactions with near base-pair mapping resolution and high signal-to-noise ratio in mammalian neurons.

Mappatura ad alta risoluzione delle interazioni proteina-DNA nei neuroni derivati dalle cellule staminali del topo utilizzando l'immunoprecipitazione-esonucleasi della cromatina (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Saggio di immunoprecipitazione della cromatina per geni tessuto-specifici utilizzando nella fase iniziale di embrioni di topo

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

Efficiente immunoprecipitazione della cromatina utilizzando Limitare quantità di biomassa

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: Cellula-tipo-specifico Epigenome profilatura

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on host and/or pathogen chromatin. Chromatin preparation from tissues creates additional challenges that need to be overcome to obtain reproducible and reliable protocols comparable to those used for cell culture. Tissue disruption and fixation are critical steps to achieve efficient shearing of chromatin. Coexistence of different cell types and clusters may also require different shearing times to reach optimal fragment size and hinders shearing reproducibility. The purpose of this method is to achieve reliable and reproducible host chromatin preparations from frozen tissue (liver) suitable for both ChIP-qPCR and next generation sequencing (NGS) applications. We observed that the combination of liquid nitrogen tissue pulverization followed by homogenization leads to increased reproducibility compared to homogenization only, since it provides a suspension consisting mostly of dissociated single cells that can be efficiently sheared. Moreover, the fixation step should be performed under mild rotation to provide homogeneous crosslinking. The fixed material is then suitable for buffer-based nuclei isolation, to reduce contamination of cytoplasmic protein and pathogen DNAs and RNAs (when applicable), avoiding time-consuming centrifugation gradients. Subsequent sonication will complete nuclear lysis and shear the chromatin, producing a specific size range according to the chosen shearing conditions. The size range should fall between 100 and 300 nt for NGS applications, while it could be higher (300-700 nt) for ChIP-qPCR analysis. Such protocol adaptations can greatly improve chromatin analyses from frozen tissue specimens.

This protocol focuses on chromatin preparation from snap frozen tissues and it is suitable for Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) followed by either quantitative PCR analysis (X-ChIP-qPCR) or next generation sequencing approaches (X-ChIP-seq).

Estrazione della cromatina dal tessuto epatico chimerico congelato per l'analisi dell'immunoprecipitazione della cromatina

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

Chromatin Immunoprecipitation

Histones are proteins that help organize DNA in eukaryotic nuclei by serving as &#8220;scaffolds&#8221; around which DNA can be wrapped, forming a complex called &#8220;chromatin&#8221;. These proteins can be modified through the addition of chemical groups, and these changes affect gene expression. Researchers use a technique called chromatin immunoprecipitation (ChIP) to better understand which DNA regions associate with specific histone modifications or other gene regulatory proteins. Antibodies are used to isolate the protein of interest, and the bound DNA is extracted for analysis. Here, JoVE presents the principles behind ChIP, discussing specific histone modifications and their relationship to gene expression and DNA organization. We then review how to perform a ChIP protocol, and explore the ways scientists are currently using this technique.

Immunoprecipitazione della cromatina

Histones are proteins that help organize DNA in eukaryotic nuclei by serving as &#8220;scaffolds&#8221; around which DNA can be wrapped, forming a complex ...