Name: chromatin immunoprecipitation (chip) in mouse t-cell lines
Uploaded: 2017-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines at JoVE.com

Mükemmel teknik yardım için P. Käse ve T. Schmidt-Wöll&#39;e minnettarız. Bu çalışma, DFG (Alman Araştırma Vakfı )&#39;nın TRR81 ve Heisenberg programı (BO 1639 / 5-1), Freiburg&#39;daki Max Planck Topluluğu ve EXC 294 ortak araştırması hükmü ve Cardio Pulmoner Sistem için Mükemmellik Kümesi tarafından desteklendi. (ECCPS), Giessen&#39;de TB&#39;ye

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm tamponlar ve ortam Tablo 1&#39;de listelenmiştir . Gün 1 ve 2 1. Hücrelerin Çapraz Bağlanması <ol><li> 6-kuyucuklu bir plakadan fare T-hücrelerini, 4 ° C&#39;de ve ~ 271 x g&#39;de 5 dakika boyunca 50 mL tüp ve santrifüje aktarın. 30 mL IMDM hücre kültürü ortamında hücre topağını süspanse edin ve bir Neubauer odası kullanarak hücreleri sayın. </li><li> Yeni 50 mL&#39;lik tüplere 20 x 10 6 hücrelik kısımlar toplayın. </li><li> % 1 final konsantrasyona doğrudan formaldehit (FMA) hücre kültürü ortamı ekleyin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Dikkat: FMA inhale edildiğinde toksiktir, bu nedenle duman kaputunun altında çalışın ve uygun koruyucu ekipman giyin. Ayrıca, lütfen ev sahibi kurumun kurallarına göre FMA atıklarını ele alınız. </li><li> 1/8 hacim 1 M glisin, pH 7.0 ekleyin ve 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 5 dakika süreyle santrifüj ederek hücreleri peletleyinMin, 4 ° C&#39;de ve ~ 271 xg&#39;de yıkanır ve 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkanır. </li><li> Hücre pelletini 1 mL PBS ile yıkayın ve 1.5 mL tüplere aktarın. </li></ol> 2. Hücre Lizizi ve Kromatin Kesme <ol><li> Hücre peletini 1 mL SDS liziz tamponuna tekrar süspanse edin ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. </li><li> Her bir numuneyi sonikasyon tüpüne aktarın ve Tablo 2&#39;de belirtilen ayarlara göre odaklanmış bir ultrasonatör kullanarak kesme işlemi yapın . </li><li> Makaslamadan sonra, örnekleri 1.5 mL tüplere aktarın ve 4 ° C&#39;de ve ~ 18.000 x g&#39;de 10 dakika santrifüjleyin. </li><li> Süpernatanı yeni tüplere aktarın. </li><li> Adım 3&#39;e göre kesilme verimliliğini belirlemek için 50 μL toplayın ve sıvı azot içinde kesilmiş lisatı derhal dondurun. Lizatı tek kullanımlık alikotlar halinde -80 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 3. Kesme Verimliliğinin Belirlenmesi <ol><li> 50 ul 50 ul elüsyon tamponu ekleyin ve #181 L; her bir kesilmiş lizatın l&#39;si ve gece boyunca 65 ° C&#39;de çalkalayarak inkübe edin. </li><li> 100 uL TE tampon ve 4 μL 10 mg / mL RNaz A (0.2 μg / μL son konsantrasyon) ilave edin. Karıştırıp 37 ° C&#39;de 2 saat çalkalayarak inkübe edin. </li><li> Her bir numuneye 2 mcL 20 mg / mL proteinaz K (0.2 μg / μL son konsantrasyon) ilave edin ve sallayarak 55 ° C&#39;de 2 saat inkübe edin. </li><li> Her numuneyi, fenol / kloroform / izoamil alkol ekstraksiyonu için uygun bir jel tüpüne aktarın; Üreticinin talimatlarına göre tutun. </li><li> 200 ul fenol / kloroform / izoamil alkol (25: 24: 1) ilave edin ve tüpleri sallayın. 24 ° C ve ~ 16000 xg&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve üst fazı yeni tüplere aktarın. Dikkat: Fenol, kloroform ve izoamil alkol inhale edildiğinde toksiktir ve koroziftir; Davlumbazın altında çalışın ve uygun kişisel koruyucu ekipman giyin. Ayrıca, fenol, kloroform ve izoamil alkollü atıkları idare edinEv sahibi kurumun kurallarına göre. <ol><li> Tekrarla. </li></ol></li><li> Üreticinin talimatlarına göre aşağıdaki değişikliklerle saflaştırma sütunları kullanarak DNA&#39;yı saflaştırın: <ol><li> Zar iki kez yıkayın. Son yıkamadan sonra kalan etanolün buharlaşması için tüp oda sıcaklığında 2 dakika açık bırakılmalıdır. </li><li> Elüsyon için, oda sıcaklığında 1 dakika inkübe 50 mcL H 2 O ekleyin, düzgün membran ıslak 1 s tüp ve 1 dakika için santrifüjleme ile DNA elute önce 1 dakika oda sıcaklığında inkübe 24 ° C ve ~ 17.900 x g. </li></ol></li><li> Üreticinin talimatlarına göre yüksek hassasiyetli bir kit kullanarak saflaştırılmış DNA&#39;yı bir florometre üzerinde ölçün. </li><li> % 1.8 agaroz jel üzerinde yaklaşık 500 ng saflaştırılmış DNA&#39;yı ve yüksek hassasiyetli bir kit kullanarak bir elektroforez sistemi üzerinde yaklaşık 1 ng analiz edin. Not: beklenen sizE DNA parçaları 200 ila 500 bp arasındadır. </li></ol> 3. ve 4. gün 4. İmmunopresipitasyon <ol><li> 1 hacim kesilmiş lizat, 5 hacim seyreltme tamponu ile seyreltin. </li><li> Soğuk odada dönerken 30 μL / mL protein A agaroz boncuk ( Ek A&#39;ya göre hazırlanmıştır) ile 30 dakika süreyle önceden temizleyin. </li><li> ~ 750 x g&#39;de 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Girişin% 10&#39;unu toplayın ve 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> İstenen lizat miktarını yeni tüplere koyun (ayrıntılar için Tablo 3&#39;e bakın). Her bir tüpe istenen antikorları ekleyin (ayrıntılar için Tablo 3&#39;e bakın) ve gece boyunca 4 ° C&#39;de döndürün. </li><li> 40 μL protein A boncuk ekleyin ve döndürürken 1 saat boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Boncukları 1 mL düşük tuzlu tampon, yüksek tuzlu tampon, LiCl tampon ve TE tampon ile yıkayın (her yıkama için döndürürken 5 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edin ve santrifüj edin4 ° C&#39;de ve ~ 950 xg&#39;de 3 dakika). Ayrıntılar için Tablo 3&#39;e bakın. </li><li> Elüsyon tampon 110 uL ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe, her 2 dakikada vorteksleme. </li><li> 4 ° C&#39;de ve ~ 950 xg&#39;de 3 dakika boyunca santrifüjleyin ve yüzer kısım 100 uL tekrar yeni bir 1.5 mL tüpe aktarın. </li><li> 4.7-4.8 adımlarını 100 uL elüsyon tamponuyla tekrarlayın ve eluatları birleştirin. Örnekleri girmek için elüsyon tamponu 200 μL&#39;ye kadar ekleyin. </li><li> Bütün örnekleri gece boyunca 65 ° C&#39;de çalkalayarak inkübe edin. </li></ol> 5. Gün 5. DNA Saflaştırması <ol><li> Her eluat için 200 uL TE tamponu ve 10 mg / mL RNaz A (8 μL, 0.2 μg / μL son konsantrasyon) ilave edin. Karıştırıp 37 ° C&#39;de 2 saat çalkalayarak inkübe edin. </li><li> Her bir eluat için 4 μL 20 mg / mL proteinaz K (0.2 μg / μL son konsantrasyon) ilave edin ve çalkalamayla 55 ° C&#39;de 2 saat inkübe edin. </li><li> Her bir örneği jöle haline getirinFenol / kloroform / izoamil alkol ekstraksiyonu için uygun tüp; Üreticinin talimatlarına göre tutun. </li><li> 400 μL fenol / kloroform / izoamil alkol (25: 24: 1) ilave edin ve tüpleri sallayın. 24 ° C&#39;de ve ~ 16.000 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Üst fazı yeni tüplere aktarın. Dikkat: Fenol, kloroform ve izoamil alkol inhale edildiğinde toksiktir ve koroziftir; Davlumbazın altında çalışın ve uygun kişisel koruyucu ekipman giyin. Ayrıca, ev sahibi kurumun kurallarına göre fenol, kloroform ve isoamil alkol atığını ele alınız. <ol><li> Tekrarla. </li></ol></li><li> Üreticinin talimatlarına göre aşağıdaki değişikliklerle saflaştırma sütunları kullanarak DNA&#39;yı saflaştırın: </li><li> Zar iki kez yıkayın. Son yıkamadan sonra kalan etanolün buharlaşması için tüpleri oda sıcaklığında 2 dakika açık bırakın. </li><li> Elüsyon için, 50 μL H 2 O ekleyin, oda temperatuasında inkübe edin1 dakika boyunca tekrarlayın, zarları düzgün ıslatmak için tüpleri 1 s döndürün ve 1 dakika boyunca 24 ° C&#39;de ve ~ 17.900 x g&#39;de santrifüje tabi tutarak DNA&#39;yı elute etmeden önce oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromatin+landscape+and+transcription+factors+in+T+cell+programming.">The chromatin landscape and transcription factors in T cell programming.</a> Trends Immunol. 35 (5), 195-204 (2014).</li><li>Zhang, J. A., Mortazavi, A., Williams, B. A., Wold, B. J., Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+transformations+of+genome-wide+epigenetic+marking+and+transcriptional+control+establish+T+cell+identity.">Dynamic transformations of genome-wide epigenetic marking and transcriptional control establish T cell identity.</a> Cell. 149 (2), 467-482 (2012).</li><li>Cauchy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+recruitment+of+Ets1+to+both+nucleosome-occupied+and+-depleted+enhancer+regions+mediates+a+transcriptional+program+switch+during+early+T-cell+differentiation.">Dynamic recruitment of Ets1 to both nucleosome-occupied and -depleted enhancer regions mediates a transcriptional program switch during early T-cell differentiation.</a> Nucl Acids Res. 44 (8), 3567-3585 (2016).</li><li>Koch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+initiation+platforms+and+GTF+recruitment+at+tissue-specific+enhancers+and+promoters.">Transcription initiation platforms and GTF recruitment at tissue-specific enhancers and promoters.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (8), 956-963 (2011).</li><li>Pekowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K4+tri-methylation+provides+an+epigenetic+signature+of+active+enhancers.">H3K4 tri-methylation provides an epigenetic signature of active enhancers.</a> EMBO J. 30 (20), 4198-4210 (2011).</li><li>Vanhille, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+quantitative+assessment+of+enhancer+activity+in+mammals+by+CapStarr-seq.">High-throughput and quantitative assessment of enhancer activity in mammals by CapStarr-seq.</a> Nat Commun. 6, 6905 (2015).</li><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression.">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li><li>Ernst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+analysis+of+chromatin+state+dynamics+in+nine+human+cell+types.">Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types.</a> Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).</li><li>Ostuni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+enhancers+activated+by+stimulation+in+differentiated+cells.">Latent enhancers activated by stimulation in differentiated cells.</a> Cell. 152 (1-2), 157-171 (2013).</li><li>Giaimo, B. D., Oswald, F., Borggrefe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+chromatin+regulation+at+Notch+target+genes.">Dynamic chromatin regulation at Notch target genes.</a> Transcription. 8 (1), 61-66 (2017).</li><li>Liefke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylase+KDM5A+is+an+integral+part+of+the+core+Notch-RBP-J+repressor+complex.">Histone demethylase KDM5A is an integral part of the core Notch-RBP-J repressor complex.</a> Genes Dev. 24 (6), 590-601 (2010).</li><li>Jung, C., Mittler, G., Oswald, F., Borggrefe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+helicase+Ddx5+and+the+noncoding+RNA+SRA+act+as+coactivators+in+the+Notch+signaling+pathway.">RNA helicase Ddx5 and the noncoding RNA SRA act as coactivators in the Notch signaling pathway.</a> Biochim Biophys Acta. 1833 (5), 1180-1189 (2013).</li><li>Oswald, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phospho-dependent+mechanism+involving+NCoR+and+KMT2D+controls+a+permissive+chromatin+state+at+Notch+target+genes.">A phospho-dependent mechanism involving NCoR and KMT2D controls a permissive chromatin state at Notch target genes.</a> Nucl Acids Res. 44 (10), 4703-4720 (2016).</li><li>Arrigoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+chromatin+research:+a+simple+and+universal+method+for+ChIP-seq.">Standardizing chromatin research: a simple and universal method for ChIP-seq.</a> Nucl Acids Res. 44 (7), e67 (2016).</li><li>Essen, D., Dullforce, P., Brocker, T., Gray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+interactions+involved+in+Th+cell+memory.">Cellular interactions involved in Th cell memory.</a> J Immunol. 165 (7), 3640-3646 (2000).</li><li>White, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+better+cell+lines+for+making+hybridomas+expressing+specific+T+cell+receptors.">Two better cell lines for making hybridomas expressing specific T cell receptors.</a> J Immunol. 143 (6), 1822-1825 (1989).</li><li>Ghisletti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+enhancers+controlling+the+inflammatory+gene+expression+program+in+macrophages.">Identification and characterization of enhancers controlling the inflammatory gene expression program in macrophages.</a> Immunity. 32 (3), 317-328 (2010).</li><li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality.">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li><li>Rothbart, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Interactive+Database+for+the+Assessment+of+Histone+Antibody+Specificity.">An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity.</a> Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).</li><li>Fenouil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+islands+and+GC+content+dictate+nucleosome+depletion+in+a+transcription-independent+manner+at+mammalian+promoters.">CpG islands and GC content dictate nucleosome depletion in a transcription-independent manner at mammalian promoters.</a> Genome Res. 22 (12), 2399-2408 (2012).</li><li>Hein, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+methylation+of+Notch1+controls+the+amplitude+and+duration+of+the+Notch1+response.">Site-specific methylation of Notch1 controls the amplitude and duration of the Notch1 response.</a> Sci Signal. 8 (369), ra30 (2015).</li></ol>

Yazarların rekabette finansal çıkarları yoktur.

ChIP, proteinlerin veya bunların PTM&#39;lerinin spesifik genomik bölgede zenginleşip zenginleşmediğini araştırmak için geçerli bir tekniktir. ChIP test sonuçları biyolojik veya teknik nedenlerden dolayı genellikle yorum yapmakla zorlanır. Biyolojik nedenler çok katlıdır ve proteinlerin DNA&#39;ya zayıf veya dolaylı olarak bağlanmasını içerir. Sınırlı antikor özgüllüğü ve verimsiz hücre lizisi veya kromatin kesme gibi teknik sınırlamalar da vardır. Bir sorun giderme kılavuzu ( Çizelge 5 ), okuyucunun ChIP analizlerinde karşılaşılabilecek sorunları çözmesine yardımcı olabilir. Soğutma odaklı bir ultrasonator cihazından yararlanan bu protokol, olgunlaşmış bir fare T hücre çizgisinin kromatinini verimli bir şekilde kesmesine izin verir. Protokolün asıl kritik basamağı, her zaman her hücre tipi için optimize edilmiş olması gereken kromatin kesilmesi ile temsil edilir. Hücrelerin sayısını ve sonikasyon çevrimlerinin sayısını değiştirmek önerilir. Ayrıca, o<html> SDS liziz tamponu ile buz üzerinde hücrelerin lizizi sırasında oluşabilecek örneklerdeki SDS çökeltilerinin varlığı olumsuz etkilenir. Bu durumda, SDS çökeltilerinin varlığını azaltmak için numuneyi oda sıcaklığında birkaç dakika boyunca lüsizasyondan sonra inkübe etmek en iyisidir. 200 ile 500 bp arasında kesilmiş fragmanları elde etmek için protokolü optimize etmek ve immüno çökeltme işlemine başlamadan önce numunelerin kesilme kalitesini daima değerlendirmek önerilir. Ayrıca sabitleme zamanı, antikor ve / veya hücrelerin miktarı ve yıkama koşulları, her bir antikor için optimize edilmelidir. Bir ChIP prosedürünü başarılı bir hale getirirken bir diğer kritik adım, antikorun seçilmesidir, çünkü düşük özgünlük antikorları immüno çökelmenin etkinliğini önemli ölçüde azaltır. Daha önce, piyasada bulunan çeşitli antikorların özgüllüğünün değerlendirilmesine izin verilen birleştirilmiş bir kalite testi prosedürü<html> Ss = &quot;xref&quot;&gt; 19. Tarama hattı, dot blot, Western blot ve ChIP&#39;e dayanılarak ChIP 19 için uygun yüksek kaliteli reaktiflerin bir listesi sağladı. Daha yakın zamanlarda, ticari olarak temin edilebilen birkaç antikorun spesifitesi, antikor özgüllüğü üzerine bir veri tabanının oluşturulmasına izin veren, yüksek yoğunluklu histon peptid mikrodizi platformları kullanılarak değerlendirildi. Okuyucu ChIP deneyleri için kullanılabilecek en spesifik antikorları tanımlamak için bu yararlı aracı kullanabilir. Bu protokol, birincil T hücreleri için test edilmemiştir ve bu durumda okuyucu, birincil T hücreleri 3 , 4 ve 21 üzerinde ChIP&#39;yi başarılı bir şekilde gerçekleştiren yayınlanmış protokollere başvurmalıdır. Özellikle, bu protokol bir fare endojen hücre hattının yanı sıra bir fare progenitör T-hücresi hattı üzerinde ChIP&#39;i başarıyla yerine getirmek için kullanılmıştır. Ove_content &quot;&gt; Histon işaretlerinin analizi için her immüno çökelme için 5 x 106 hücre kullanılmalıdır.Bu protokol TF&#39;ler veya kofaktörler üzerinde ChIP gerçekleştirmek için bazı optimizasyonlarla birlikte de uygun olabilir, bu nedenle hücre sayısını artırmak en iyisidir Bu vakalarda immüno çökeltme için kullanılmıştır Her deney için gerekli hücre sayısına ulaşmak için, dilimlenmiş lizatın daha küçük kısımları seyreltme tamponu içerisinde kromatin seyreltmeden önce bir araya toplanabilir. Bu protokol doğrudan DNA&#39;ya bağlanmayan endojen proteinler üzerinde ChIP gerçekleştirmek üzere modifiye edilebilir. Bu durumda, protein-protein çapraz bağlayıcılarla ( örneğin dimetil adipimidat, DMA) ön fiksasyon gerekebilir (daha fazla bilgi için Ek B&#39;ye bakınız). Kofaktörlerde ChIP&#39;in başarılı bir performansı, daha önce bir biotin etiketi ile kaynaştırılmış aşırı ifade eden proteinler tarafından yapılmıştır. Bu durumda, protein streptavidin-konjuga ile saflaştırılmıştırTed manyetik boncuklar ve DMA ile ön fiksasyon yapıldı 22 .

Gelişme, farklılaşma ve homeostaz, kromatin yapısını modüle eden ve bu nedenle belirli bir genin bir hücre ve zamana özgü biçimde aktive edilip engellenmediğini belirleyen olayları bildiren belirli gen ekspresyon programlarına bağlıdır. T-hücresi gelişimi sırasında, birkaç ara evreden 1 geçerek çift negatif (DN) ila tek pozitif (SP) haldeki T hücresi öncüllerinin olgunlaşmasını doğru bir şekilde belirlemek için spesifik gen ekspresyon programları oluşturulmalıdır. Gen ekspresyon programının T hücresi gelişimi sırasında dinamik olarak nasıl düzenlendiği, önceki laboratuvarlarda 2 , 3 , 4 , 5 , 6 numaralı laboratuvarlar tarafından geniş çapta araştırılmıştır. Histonların post translasyonel modifikasyonları (PTM&#39;ler) ile,Histon varyantlarına sahip kanonik histonlar, nükleozom tahliye ve DNA metilasyonu, genlerin ON / OFF anahtarını düzenler. Çeşitli gruplar, proksimal ve distal düzenleyici bölgelerde 7 , 8 , 9 , 10 farklı kromatin durumlarıyla ilişkili işaretleri belirlemek için PTM&#39;lerin ve histon varyantlarının genom çapında dağılımını araştırdılar. Sinyalizasyon, spesifik arttırıcı elementlerde pozitif ve negatif kromatin değiştirici enzimlerin (ayrıca kromatin modifiye edici olarak da bilinir) değişimi yoluyla dinamik kromatin düzenlenişini düzenler. Bu kromatin değiştiriciler kromatin yapısını ve dolayısıyla transkripsiyonel çıktıyı örneğin dinamik histon metilasyonu ve asetilasyon ile düzenler. Notch sinyal yolunda 11 , 12 , 13 ,14. Dinamik histon PTM&#39;leri; Histon varyantları ile alışverişler; Ve histonların, transkripsiyon faktörlerinin ve kofaktörlerin dinamik dolaşımı, kromatin immüno-çökeltme (ChIP) tahlilleri ile araştırılabilir. Belirli DNA-protein komplekslerini saflaştırmak için oldukça spesifik antikorlar kullanılır ve saflaştırılmış DNA kantitatif PCR (qPCR) ile analiz edilir; Derin dizilim (ChIP-Seq); Veya günümüzde daha az sıklıkla, mikrodiziye hibridizasyon (ChIP-ChIP). ChIP tahlilleri, bazen hücrelerin lizisi, kromatin kesilmesi ve / veya antikorların düşük özgüllüğü ile ilgili komplikasyonlar nedeniyle zorlayıcıdır. NEXSON 15&#39;te olduğu gibi, protokolü geliştirmek için çeşitli stratejiler benimsenmiştir. Soğutma suyu banyosu sonikatörlerinin kullanılması, araştırılan protein üzerindeki epitoplara zarar verebilecek numune ısıtmasından kaçınır, ancak numunelerin kesilmesi için gereken enerji suya dağılır.Enerjinin dağılmasını önleyen odaklanmış ultrasonication cihazlarının geliştirilmesi ile bir başka gelişme yapılmıştır. Bu nedenle, odaklanmış ultrasonatör cihazları, hücre lizizinde ve kromatin makaslamada iyileştirme yapmaya, operatöre bağlı varyasyonları ortadan kaldırmaya ve tekrarlanabilirliği önemli ölçüde arttırmaya olanak tanır. Bu çalışma , E2-10HA 16 , 17 olarak adlandırılan olgun bir fare T hücresi çizgisindeki histon proteinlerinin ChIP&#39;ini etkili bir şekilde gerçekleştirmek için bir protokolü ( Şekil 1&#39;deki şematik genel bilgi) açıklar. T-hücrelerinin çözülmesi genellikle zordur ve kromatinlerinin kesilmesi yetersizdir. Soğutma odaklı bir ultrasonatörü kullanan bu protokolde, hücre sayısı, liziz tamponu ve kesme ayarı E2-10HA fare T hücre dizisi için optimize edildi. Bu protokol, yüksek bir tekrarlanabilirlik ve makul bir zamanda ChIP gerçekleştirmesine olanak tanır. Aslında, requirKromatin kesmek ve makaslama kalitesini değerlendirmek için yaklaşık iki gün, immüno çökelmeyi gerçekleştirmek için üç gün, çapraz bağın tersini çevirin ve DNA&#39;yı arındırın.

<table><tbody><tr><td>Agilent High Sensitivity D5000 Reagents</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5593</td><td></td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5592</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Tapestation 4200</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S220 AFA System</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td></td></tr><tr><td>dimethyl adipimidate (DMA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20660</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Pan-Biotech</td><td>1502-P121301</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde (FMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Insulin solution human&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&#039;s modified Dulbecco&#039;s medium (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>nProtein A Sepharose 4 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5280-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&lt;br /&gt;(10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Peptone primatone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4963-100G</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy 2&amp;nbsp;mL</td><td>5 Prime</td><td>2302830</td><td></td></tr><tr><td>Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td><td>Roth</td><td>A156.2</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>GIBCO</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>RNase A, DNase and protease-free (10&amp;nbsp;mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Tube AFA Fiber &amp;amp; Cap</td><td>Covaris</td><td>520081</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation (chip) in mouse t-cell lines

Sinyal yolakları, histon kuyruklarının post translasyonel modifikasyonları (PTM&#39;ler), histon varyantları ile kanonik histonların değişimi ve nükleozom tahliye gibi farklı seviyelerde kromatin yapısının modülasyonu yoluyla gen ekspresyon programlarını düzenler. Bu düzenleme, arttırıcılar olarak tanımlanan düzenleyici elemanlarda kromatin değiştirici enzimleri işe yarayan sinyal duyarlı transkripsiyon faktörlerinin (TF&#39;ler) bağlanmasını gerektirir. Sinyal olay kaskadlarının arttırıcı aktiviteyi nasıl düzenlediğini anlamak TF&#39;lerin, kromatin değiştirici enzimlerin bağlanmasının ve spesifik histon işaretlerinin ve histon varyantlarının dolaşımının kapsamlı bir analizini gerektirir. Kromatin immüno-çökeltme (ChIP) tahlilleri, spesifik protein / DNA komplekslerini immüno-çökeltmek için yüksek spesifik antikorları kullanır. Saflaştırılmış DNA&#39;nın sonraki analizi, antikor tarafından tanınan protein tarafından işgal edilen bölgenin tanımlanmasına izin verir. Bu çalışma verimli bir şekilde peOlgun fare T hücre dizisinde histon proteinlerinin ChIP&#39;ini oluşturun. Sunulan protokol, ChIP tahlillerinin makul bir zaman aralığında ve yüksek tekrarlanabilirlik ile gerçekleştirilmesini sağlar.

Olgun fare T hücreleri, lizin 4&#39;ün histon 3&#39;te (H3K4me1) histon marka mono-metilasyonunun zenginleştirilmesini, histon 3&#39;ün (H3K4me3) lisin 4&#39;ün tri-metilasyonunu ve lizin 27&#39;nin asetillenmesini incelemek için ChIP analizine tabi tutuldu. Histone 3 (H3K27ac) yanı panH3 ChIP tarafından ortaya çıkarılan nükleozom doluluğu. Kesme kalitesi,% 1.8 agaroz jeli ( Şekil 2A ) ve bir elektroforez sistemi ( Şekil 2B ) üzerinde analizle değerlendirildi. H3K4me1 ve H3K4me3, sırasıyla arttırıcı bölgeleri ve yükselticileri tanımlamak için kullanılır ( Şekil 3A ). Nitekim H3K4me3 belirgin olup yalnızca promotörler 5 , 8 , 14&#39;te zenginleştirilmiş değildir. Aktif arttırıcıların bir özelliği, H3K4me1 ve H3K27ac için oldukça zenginleştirilmiş olması ve H3K4me3 için zayıf şekilde zenginleştirilmiş olmasıdır (&lt;Inaktif arttırıcılar, düşük H3K4me3 ve H3K27ac seviyeleri, ancak yüksek H3K4me1 seviyeleri gösterirler ( Şekil 3A , alt panel). Şekil 3B&#39;de gösterildiği gibi, Glyceraldehyde 3-fosfat dehidrogenaz ( Gapdh ) geni, aktif gen promotörlerinin ( Gapdh promotörünün ) analizini temsil etmektedir . Gerçekte, yüksek seviyelerde H3K4me3 ve H3K27ac ve düşük H3K4me1 seviyeleri gösterir. Şekil 3B&#39;de Deltex1 ( Dtxl ), H3K4me1 için zenginleştirilmiş ve H3K4me3 ve H3K27ac için zayıf şekilde zenginleştirilmiş olduğu için, inaktif arttırıcıları ( Dtx1 arttırıcı ) temsil etmektedir. Gen çölü , kodlayıcı genlerden yoksun bir bölgeyi temsil eder ve genellikle aktif kromatin işaretleri için negatif bir kontrol olarak dava edilir. H3K4me1, iyi kabul görmüş arttırıcı işaret 4 , 5 , </sup&gt; 7 , 14 , 18 , Gen çölde zenginleştirilmiş değil, bu bölgenin güçlendirici bulunmadığını öne sürüyor. <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig1.jpg" /> Şekil 1: Sunulan ChIP protokolünün şematik görünümü. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig2.jpg" /> Şekil 2: olgun fare T hücre hattının kesme kalitesi kontrolü. ( A ) Olgun fare T hücre çizgisi E2-10HA&#39;nın iki farklı bölüntüsü kesildi ve yaklaşık% 500 saflaştırılmış DNA,% 1.8 agaroz jeli üzerinde analiz edildi ve kesilip alınmadığı değerlendirildiIng kalitesi. ( B ) numune 2&#39;den 1 ng saflaştırılmış DNA, kesme kalitesini değerlendirmek için elektroforez ile analiz edildi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig3.jpg" /> Şekil 3: arttırıcıları ve yükselticileri karakterize eden kromatin işaretleri. ( A ) Aktif arttırıcılar (üst panel) yüksek H3K4me1, düşük H3K4me3 ve yüksek H3K27ac ile karakterize edilirken, inaktif arttırıcılar (alt panel) yüksek H3K4me1, düşük H3K4me3 ve düşük H3K27ac sunar. ( B ) Şekil 2A&#39;da sunulan numuneler bir araya getirildi ve panH3 ChIP tarafından ortaya çıkarıldığı üzere, histon markları H3K4me1, H3K4me3 ve H3K27ac ve histon doluluğu için ChIP analizi için kullanıldı. Bu analiz,E destekçisi Glyceraldehyde 3-fosfat dehidrogenaz ( Gapdh promotörü ), H3K4me3 ve H3K27ac için zenginleştirilmiş ve H3K4me1 için az zenginleştirilmiş. Öte yandan, aktif olmayan gen Deltex1&#39;in ( Dtx1 arttırıcı ) zenginleştiricisi, H3K4me1 için zenginleştirilmiş ancak H3K4me3 ve H3K27ac için zayıf şekilde zenginleştirilmiş. Nükleozomun doluluk oranını araştırmak için bir panH3 antikoru kullanan ChIP kullanıldı. Gen çölü negatif bir kontrol olarak kullanıldı. Bir temsilci deney gösterilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Arabellek adı </td><td> reaktif </td><td> Nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td rowspan="5"> Seyreltme tamponu </td><td> Sodyum dodekIl sülfat (SDS) </td><td> % 0.01 (ağ / hac) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> % 1.1 (h / h) </td></tr><tr><td> Etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 </td><td> 1.2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HC1 pH 8.1 </td><td> 16.7 mM </td></tr><tr><td> Sodyum klorür (NaCI) </td><td> 167 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> DMA çözümü </td><td> Dimetil adipimidat (DMA) </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Fosfat tamponlu salin (PBS) </td><td> 1x </td></tr><tr><td rowspan="3"> Elüsyon tamponu </td><td> Sodyum dodesil sülfat (SDS) </td><td> % 1 (a / h) </td></tr><tr><td> Etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Tris-HC1 pH 8.0 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Yüksek tuz tamponu </td><td> Sodyum dodesil sülfat (SDS) </td><td> % 0.1 (a / h) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> % 1 (h / h) </td></tr><tr><td> EthylenediamiNetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HC1 pH 8.1 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Sodyum klorür (NaCI) </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td rowspan="6"> IMDM aracı </td><td> Iscove&#39;un modifiye Dulbecco&#39;s medium (IMDM) </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu (FBS) </td><td> % 2 (h / h) </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Pepton primatonu </td><td> 0.3 mg / mL </td></tr><tr><td> Insan insülini çözeltisi </td><td> 4.8 mg / mL </td></tr><tr><td> Minimum esansiyel orta zorunlu olmayan amino asitler (MEM NEAA) </td><td> 1x </td></tr><tr><td rowspan="4"> LiCl tuz tamponu </td><td> Lityum klorür (LiCI) </td><td> 0,25 M </td></tr><tr><td> IGEPAL-CA630 </td><td> % 1 (h / h) </td></tr><tr><td> Etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Tris-HC1 pH 8.1 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Düşük tuz tamponu </td><td> Sodyum dodesil sülfat (SDS) </td><td> % 0.1 (a / h) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> % 1 (h / h) </td></tr><tr><td> Etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HC1 pH 8.1 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Sodyum klorür (NaCI) </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Protein A Sepharose boncuk yıkama tamponu </td><td> Tris-HC1 pH 8.0 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Sodyum klorür (NaCI) </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td> Etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Sodyum dodesil sülfat (SDS) </td><td> % 0.1 (a / h) </td></tr><tr><td> IGEPAL-CA630 </td><td> % 1 (h / h) </td></tr><tr><td rowspan="3"> SDS Lysis tamponu </td><td> Sodyum dodesil sülfat (SDS) </td><td> % 1 (a / h) </td></tr><tr><td> EthylenediAminetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Tris-HC1 pH 8.1 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> TE tamponu </td><td> Tris-HC1 pH 8.0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 </td><td> 1 mM </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Bu protokolde kullanılan tamponların ve ortamın listesi. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> AÇIK </td><td> KAPALI </td></tr><tr><td> Zirve gücü </td><td> 150,0 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Görev faktörü </td><td> 15.0 </td><td> 15.0 </td></tr><tr><td> Döngüleri / patlama </td><td> 500 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Devir sayısı </td><td colspan="2"> 28 </td></tr></tbody></table>Tablo 2: Bu protokolde kullanılan kesme ayarları. Bu koşullar olgun bir fare T-hücresi hattı için optimize edilmiştir. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Antikor </td><td> satıcı </td><td> Antikor miktarı / immüno çökeltme </td><td> Hücrelerin miktarı / immüno çökeltme </td><td> Yıkama koşulları </td></tr><tr><td> H3 </td><td> Abcam (ab1791) </td><td> 2.5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Bir kez düşük tuz tamponunda, iki kez Yüksek tuz tamponunda, iki kez LiCl tuz tamponu ve üç kez TE tamponunda </td></tr><tr><td> H3K4me1 </td><td> Abcam (ab8895) </td><td> 2.5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Bir kez düşük tuz tamponunda, iki kez Yüksek tuz tamponunda, iki kez LiCl tuz tamponu ve üç kez TE tamponunda </td></tr><tr><td> H3K4me3 </td><td> Diagenode (pAb-003-050) </td><td> 2.5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Bir kez düşük tuz tamponunda, iki kez Yüksek tuz tamponunda, iki kez LiCl tuz tamponu ve üç kez TE tamponunda </td></tr><tr><td> H3K27ac </td><td> Diagenode (pAb-174-050) </td><td> 2.5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Düşük tuz tamponunda Oce, iki kez Yüksek tuz tamponu, iki kez LiCl tuz tamponu ve üç kez TE tamponu </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Diagenode (C15410206) </td><td> Değişken* </td><td> Değişken* </td><td> Değişken* </td></tr><tr><td colspan="5"> * IgG kontrolü durumunda hem antikor hem de hücrelerin miktarı, yıkama adımları, diğer immüno çökeltilerin koşullarını yansıtmalıdır. </td></tr></tbody></table> Tablo 3: Bu çalışmada kullanılan antikorlar ve yıkama koşulları. <table border="1" fo:keEp-together.within-sayfa = &quot;1&quot; fo: keep-with-next.within-sayfa = &quot;her zaman&quot;&gt; <tbody><tr><td> Gen </td><td> Ileri astar </td><td> Ters astar </td><td> sonda </td></tr><tr><td> Gapdh yönlendiricisi (0 kb) </td><td> 5&#39;-GGG TTC CTA TAA ATA CGG ACT GC-3 &#39; </td><td> 5&#39;-CTG GCA CTG CAC AAG AAG A-3 &#39; </td><td> 68 </td></tr><tr><td> Dtx1 arttırıcı (+26 kb) </td><td> 5&#39;-CTC TGG GTT GTA GGG GAC AG-3 &#39; </td><td> 5&#39;-GCA TGG GAA CTG TGT TAC AGA A-3 &#39; </td><td> 27 </td></tr><tr><td> Gen çölü </td><td> 5&#39;-CAA TGC ATG GGT CCA GAT TT-3 &#39; </td><td> 5&#39;-ATT GGC ACG GAA GTA GTG CT-3 &#39; </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> Tablo 4: Bu çalışmada qPCR için kullanılan primerler ve problar. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within sayfalık = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> Sorun </td><td> Nedenler </td><td> Çözüm </td></tr><tr><td rowspan="3"> Kromatin makaslanmış ve parçacıklar çok büyük. </td><td> Çok fazla hücre kullanılmıştır. </td><td> Hücrelerin sayısını azaltın. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Makaslama çok düşüktür. </td><td> Kesme çevrimi sayısını artırın. </td></tr><tr><td> Kesme tepe gücü, çalışma faktörü ve / veya devir / patlamayı arttırın. </td></tr><tr><td rowspan="3"> Kromatin kesilmiş ve fragmanlar çok küçük. </td><td> Çok az hücre kullanılmıştır. </td><td> Hücre sayısını artırın. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Kesme çok yüksek. </td><td> Kesme çevrimi sayısını azaltın. </td></tr><tr><td> Kesme tepe enerjisini, görev faktörünü ve / veya devir / patlamayı azaltın. </td></tr><tr><td rowspan="11"> Ben üzerinde çok düşük kurtarmaGG kontrolü ve / veya negatif kontrol (yüksek arka plan). </td><td> Deney için yeterli kromatin kullanıldı. </td><td> Kromatin miktarını arttırın. </td></tr><tr><td> Antikor miktarı çok düşüktür. </td><td> Antikor miktarını arttırın. </td></tr><tr><td> Antikor miktarı çok yüksek. </td><td> Antikor miktarını azaltın. </td></tr><tr><td> Antikorun özgüllüğü düşüktür. </td><td> Antikoru değiştir. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Yıkama koşulları çok katıdır. </td><td> Yıkama sayısını azaltın. </td></tr><tr><td> Yıkama tamponlarının sıkılığını azaltın. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Yıkama koşulları yeterince sıkı değildir. </td><td> Yıkama sayısını arttırın. </td></tr><tr><td> Yıkama tamponlarının sıkılığını arttırın. </td></tr><tr><td> QPCR&#39;de çok fazla DNA pipetle alındı. </td><td> QPCR&#39;de pipetle alınan DNA miktarını azaltın. </td></tr><tr><td rowspan="2"> QPCR koşulları optimal değildir. </td><td> QPCR koşullarını optimize edin. </td></tr><tr><td> Çevrim sayısını azaltın. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Girdi örneğinin qPCR reaksiyonunda hiçbir ürün veya ürün çok düşüktür. </td><td> QPCR&#39;de yeterli DNA pipete konmadı. </td><td> QPCR&#39;de pipetle alınan DNA miktarını arttırın. </td></tr><tr><td rowspan="2"> QPCR koşulları optimal değildir. </td><td> QPCR koşullarını optimize edin. </td></tr><tr><td> Çevrim sayısını arttırın. </td></tr><tr><td> Deney için yeterli kromatin kullanıldı. </td><td> Kromatin miktarını arttırın. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Pozitif kontrol ve / veya panH3 Çipinde sinyal yok. </td><td> Deney için yeterli kromatin kullanıldı. </td><td> Kromatin miktarını arttırın. </td></tr><tr><td> Antikor miktarı çok düşüktür. </td><td> Antikor miktarını arttırın. </td></tr><tr><td> AntiVücut özgüllüğü düşüktür. </td><td> Antikoru değiştir. </td></tr><tr><td> Elüsyon uygun değildir. </td><td> Boncukları çözelti içinde tutmak için numuneleri sık sık girdapladığınızdan emin olun. </td></tr></tbody></table> Tablo 5: Sorun Giderme.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines at JoVE.com

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Bu çalışma olgun bir fare T-hücresi hattı kullanarak kromatin immüno çökeltme (ChIP) için bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokol, spesifik histon marklarının belirli promotör alanlarında veya genom çapında dağılımını araştırmak için uygundur.

Fare T-hücresi Hatlarında Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP)

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

chromatin-immunoprecipitation-chip-in-mouse-t-cell-lines

Research

JoVE Journal

Genetics

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

18.3K Görüntüleme.  University of Giessen.  Bu çalışma olgun bir fare T-hücresi hattı kullanarak kromatin immüno çökeltme (ChIP) için bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokol, spesifik histon marklarının belirli promotör alanlarında veya genom çapında dağılımını araştırmak için uygundur. 

Video: Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a high content of structural proteins. Dissected limb muscles from adult mice are physically disrupted by mechanical homogenisation, or a combination of mincing and douncing, in a hypotonic buffer before formaldehyde fixation of the cell lysate. The fixed nuclei are purified by further cycles of mechanical homogenisation or douncing and sequential filtrations to remove cell debris. The purified nuclei can be sonicated immediately or at a later stage after freezing. The chromatin can be efficiently sonicated and is suitable for chromatin immunoprecipitation experiments, as illustrated by the profiles obtained for transcription factors, RNA polymerase II, and covalent histone modifications. The binding events detected using chromatin prepared by this protocol are predominantly those taking place in the muscle fiber nuclei despite the presence of chromatin from other fiber-associated satellite and endothelial cells. This protocol is therefore adapted to study gene regulation in the adult mouse skeletal muscle.

A novel protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle adapted to the study of gene regulation in muscle fibers by chromatin immunoprecipitation is presented.

Kromatin Immunoprecipitation üzerinden fare kas iskelet için geliştirilmiş iletişim kuralı

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Biyokimya

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

Kromatin Immunoprecipitation fare kahverengi yağ dokusunun

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Genetik

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kromatin Immunoprecipitation

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Biyoloji

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

Mammalin hücrelerinde Micrococcal Nüklenleri kullanarak kromatin Immünopmamitasyon tahlil

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled with high-throughput sequencing (ChIP-seq) is widely used to identify genome-wide binding locations of DNA-binding proteins. However, the ChIP-seq method is limited by its heterogeneity in length of sonicated DNA fragments and non-specific background DNA, resulting in low mapping resolution and uncertainty in DNA-binding sites. To overcome these limitations, the combination of ChIP with exonuclease digestion (ChIP-exo) utilizes 5&#8217; to 3&#8217; exonuclease digestion to trim the heterogeneously sized immunoprecipitated DNA to the protein-DNA crosslinking site. Exonuclease treatment also eliminates non-specific background DNA. The library-prepared and exonuclease-digested DNA can be sent for high-throughput sequencing. The ChIP-exo method allows for near base-pair mapping resolution with greater detection sensitivity and reduced background signal. An optimized ChIP-exo protocol for mammalian cells and next-generation sequencing is described below.

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

Precise determination of protein-binding locations across the genome is important for understanding gene regulation. Here we describe a&#160;genomic mapping method that treats chromatin-immunoprecipitated DNA with exonuclease digestion (ChIP-exo) followed by high-throughput sequencing. This method detects protein-DNA interactions with near base-pair mapping resolution and high signal-to-noise ratio in mammalian neurons.

Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo) Kullanılarak Fare Kök Hücre Türevi Nöronlarda Protein-DNA Etkileşimlerinin Yüksek Çözünürlüklü Haritalanması

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Erken evre Fare Embriyolar kullanarak Doku özel Genler Kromatin Immunoprecipitation Testi

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

Biyokütle Limit Tutarlar kullanarak Verimli Kromatin Immunoprecipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: Hücre türüne özgü Epigenome profil oluşturma

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on host and/or pathogen chromatin. Chromatin preparation from tissues creates additional challenges that need to be overcome to obtain reproducible and reliable protocols comparable to those used for cell culture. Tissue disruption and fixation are critical steps to achieve efficient shearing of chromatin. Coexistence of different cell types and clusters may also require different shearing times to reach optimal fragment size and hinders shearing reproducibility. The purpose of this method is to achieve reliable and reproducible host chromatin preparations from frozen tissue (liver) suitable for both ChIP-qPCR and next generation sequencing (NGS) applications. We observed that the combination of liquid nitrogen tissue pulverization followed by homogenization leads to increased reproducibility compared to homogenization only, since it provides a suspension consisting mostly of dissociated single cells that can be efficiently sheared. Moreover, the fixation step should be performed under mild rotation to provide homogeneous crosslinking. The fixed material is then suitable for buffer-based nuclei isolation, to reduce contamination of cytoplasmic protein and pathogen DNAs and RNAs (when applicable), avoiding time-consuming centrifugation gradients. Subsequent sonication will complete nuclear lysis and shear the chromatin, producing a specific size range according to the chosen shearing conditions. The size range should fall between 100 and 300 nt for NGS applications, while it could be higher (300-700 nt) for ChIP-qPCR analysis. Such protocol adaptations can greatly improve chromatin analyses from frozen tissue specimens.

This protocol focuses on chromatin preparation from snap frozen tissues and it is suitable for Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) followed by either quantitative PCR analysis (X-ChIP-qPCR) or next generation sequencing approaches (X-ChIP-seq).

Kromatin İmmünopresipitasyon Analizi için Dondurulmuş Kimerik Karaciğer Dokusundan Kromatin Ekstraksiyonu

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

Chromatin Immunoprecipitation

Histones are proteins that help organize DNA in eukaryotic nuclei by serving as &#8220;scaffolds&#8221; around which DNA can be wrapped, forming a complex called &#8220;chromatin&#8221;. These proteins can be modified through the addition of chemical groups, and these changes affect gene expression. Researchers use a technique called chromatin immunoprecipitation (ChIP) to better understand which DNA regions associate with specific histone modifications or other gene regulatory proteins. Antibodies are used to isolate the protein of interest, and the bound DNA is extracted for analysis. Here, JoVE presents the principles behind ChIP, discussing specific histone modifications and their relationship to gene expression and DNA organization. We then review how to perform a ChIP protocol, and explore the ways scientists are currently using this technique.

Histones are proteins that help organize DNA in eukaryotic nuclei by serving as &#8220;scaffolds&#8221; around which DNA can be wrapped, forming a complex ...