والهدف من هذا الإجراء هو توفير التوجيه لإنتاج وبلورة وتحديد الهيكلية للإنسان IKK1-ألفا من أجل فهم الأساس الميكانيكي لوظيفتها الإشارات وإنشاء منصات لتصميم المخدرات الرشيد. وينبغي أن تساعد هذه الطريقة الباحثين في تحديد هيكل IKK1، والتي من شأنها أن توفر إجابات على الاستفسارات الرئيسية في مجال الإشارات المناعية. تصف هذه التقنية مسارًا مبسطًا للحصول على بلورات من بروتينات IKK ، والتي هي بالأحرى انكسارية للتبلور وتوفير معلومات مهمة مختلفة في التغلب على الاختناقات في تحديد الهياكل.
عموما ، سوف الأفراد الجدد لهذه الطريقة النضال ، وذلك لأن توليد كميات مليغرام من البروتين القابل للذوبان ، وحسن السلوك ، ويتطلب التعبير عنها في خلايا الحشرات ، ويمكن أن يتم التبلور فقط تحت نافذة ضيقة للغاية من الظروف. يمكن أن يكون إجراء الاستبدال الجزيئي المستخدم في تحديد بنية IKK1 صعبًا للغاية ، خاصة بسبب سوء خاصية الانحراف للبلورات ، وليس في موقع الوحدة غير المتماثلة التي تحتوي على العديد من جزيئات IKK1 في غياب نماذج البحث المناسبة. إثبات الإجراءات سيكون كايل شوماتي وسونجيلا هوتشكيس، طلاب من مختبري.
في اليوم الأول ، الخلايا Sf9 لوحة في مليلترين من Sf903 خلية حشرات المتوسطة ، في كل بئر من لوحة ستة بئر واحتضان في 27 درجة مئوية. مرور الخلايا عندما تصل إلى كثافة من 2 إلى 3 مرات 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر في التعليق عن طريق تمييعها إلى وسائط جديدة، في كثافة حوالي ست مرات 10 إلى 5. في اليوم الثاني ، تمييع ثمانية ميكرولترات من كاشف Sf9 transfection في 100 ميكرولترات من SF-903 أو وسط الحشرات في غريس.
ثم دوامة الخليط لفترة وجيزة. في أنبوب منفصل، تمييع ميكروغرام واحد من عصيات إعادة الكومبيتامين المنقى في 100 ميكرولترات من نفس الوسيلة. الجمع بين الحمض النووي المخفف ومكشف نقل.
بعد احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 30 دقيقة، وإزالة المتوسطة من البئر. ثم يضاف ملليلتر واحد من المتوسطة الطازجة. بعد ذلك ، أضف الخليط المُخفف من الملوثات الخلوية بالحمض النووي إلى الخلايا ، مع ضبط حجم القطرة بحيث لا يطرد الخلايا المضمّنة.
بعد ست ساعات، إضافة 1.5 ملليلتر من المتوسطة الطازجة على رأس الخلايا. احتضان الخلايا في 27 درجة مئوية، والتحقق من الآبار بشكل دوري كل 12 ساعة لعلامات العدوى الفيروسية. في اليوم الخامس، إزالة الخلايا التي تحتوي على المتوسطة، 60 إلى 72 ساعة بعد العدوى.
وبعد نقل الوسيط إلى أنابيب، يتم إرسال أجهزة الطرد المركزي لمدة خمس دقائق بمعدل 500 ضعف غرام وأربع درجات مئوية. عند الانتهاء، حفظ عظمى، وهو كومة فيروس P1. في اليوم الأول، resuspend إعداد سابقا له-IKK1 خلية بيليه في 40 ملليلتر من العازلة تحلل.
وضع تعليق الخلية على الجليد وlyse الخلايا عن طريق سونيكيشن في 60٪ إلى 70٪ دورات الخدمة و 5 إلى 10 نبضات من 30 ثانية مدة في فاصل زمني أكبر من دقيقة واحدة. توضيح lysate بواسطة الطرد المركزي في أكبر من أو يساوي 28، 000 ز لمدة 45 دقيقة في أربع درجات مئوية. بعد إعداد راتنج النيكل-NTA Agarose, وفقا لبروتوكول النص, elute له الموسومة IKK1 بروتين ألفا تحت تدفق الجاذبية باستخدام 20 ملليلتر من عازلة elution.
جمع 1-1.5 ملليلتر الكسور. بعد الجمع بين الكسور التي تحتوي على البروتين، هضم العينة مع بروتياز TEV بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في صباح اليوم الثاني، احتضان البروتين مع ملليمتر واحد من ATP، في وجود كلوريد المغنيسيوم، بيتا غليسيروفوسفات، فلوريد الصوديوم وعظام الصوديوم لمدة ساعة واحدة في 27 درجة مئوية.
بعد الحضانة، قم بتصفية محلول البروتين من خلال فلتر 0.45 ميكرون. ثم قم بتحميل ما يقرب من ستة ملليلترات من العينة على عمود 120 ملليلتر إعدادي حجم استبعاد، تعلق على نظام كروماتوغرافيا السائل الآلي. بعد التوازن، قم بتشغيل كروماتوغرافيا الحجم -استبعاد بمعدل تدفق من ملليلتر واحد في الدقيقة وجمع كسور مليلتر اثنين.
خلال المدى، رصد elution في 280 و 254 نانومتر. بعد سحب الكسور النقية، والتركيز في 30 كيلودالون، الوزن الجزيئي قطع المركزية المكثف، اتباع تعليمات الشركة المصنعة. ثم الاستغناء عن 25 ميكرولتر aliquots من البروتين المركز وفلاش تجميد في النيتروجين السائل.
باستخدام الروبوت، ماصة 80 إلى 100 ميكرولترات من كاشف التبلور في خزان لوحة 96 جيدا. باستخدام الروبوت تبلور، الاستغناء ومزيج 0.2 إلى 0.25 ميكرولترات من IKK1 ومجمع المانع مع نفس حجم محلول الخزان. مباشرة بعد وضع قطرات، وختم كل لوحة مع الأفلام واضحة بصريا لتجنب التبخر.
احتضان صفيحة واحدة في 18 درجة مئوية واللوحة الأخرى في أربع درجات مئوية في غرفة باردة. استخدام مجهر ستيريو مع المستقطب للتحقق من مظهر من الكريستال في كل قطرة، كل يوم، لأول سبعة أيام ثم على فترات أطول. بعد إعداد IKK1 ومُركب مثبطاته كما هو موضح سابقًا ، قم بنقل حلول البئر إلى كل بئر من 24 بئرًا.
مكان واحد إلى 1.5 ميكرولترات من حل جيدا على غطاء الزجاج النظيف. إضافة حجم متساو من IKK1 ومجمع المانع لها إلى غطاء الزجاج ومزيج بلطف عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا ثلاث إلى أربع مرات. بعد تطبيق الشحوم على حلقات كل بئر من لوحة، بدوره غطاء الزجاج أكثر من مكان على بئر مع ملقط.
ثم ختم البئر عن طريق الضغط على أسفل على غطاء الزجاج. بعد إعداد جميع قطرات في لوحة 24-جيدا، احتضان في غرفة باردة، في الظلام. أحيانا تحقق من قطرات تحت المجهر لمظهر ونمو البلورات.
بمجرد اكتمال نمو البلورات، قم بإزالة غطاء الزجاج الذي يحتوي على الكريستال بلطف وضعه على سطح صلب مع هبوط الكريستال الذي يواجه الصعود. إضافة بلطف 10 ميكرولترات من محلول كريو A على رأس قطرة ومزيج بلطف عن طريق الأنابيب بحيث لا يتم لمس الكريستال. باستخدام المجهر، وإزالة ببطء بعض السوائل من الكريستال والحفاظ على حوالي خمسة إلى ثمانية ميكرولترات من المحلول.
إضافة بلطف 2.5 إلى أربعة ميكرولترات من محلول ب التبريد على قطرة ومزيج بلطف عن طريق pipetting. غطي غطاء الزجاج بطبق صغير من بيتري لتجنب تدفق الهواء المباشر فوق الكريستال. بعد الانتظار خمس دقائق، واختيار بعناية بلورة واحدة من قطرة في cryoloop مناسبة شنت على قاعدة مناسبة.
فلاش تجميد الكريستال في النيتروجين السائل. ثم تخزين الكريستال التي تحتوي على cryoloop في عفريت مغمورة في النيتروجين السائل في قارورة ديوار حتى جاهزة لالأشعة السينية حيود في السنكروترون. بعد تجارب واسعة النطاق مع عدة متغيرات مختلفة IKK1، تم الحصول على بلورات مع بناء واحد مبتور، والتي عرضت خصائص مناسبة الأشعة السينية فقط في وجود مثبطات IKK الثاني عشر.
إن التأثير المشترك لبيانات الأشعة السينية ذات الدقة المنخفضة ذات الكثافة الضعيفة، وعدد كبير من جزيئات IKK1 في الوحدة غير المتماثلة والاختلاف التكتّاني لنموذج IKK1 أحادية االشعب- الديميريك، مقارنة بنماذج IKK2 المعروفة، جعل من الصعب الحصول على حل الاستبدال الجزيئي IKK1 وتحديد هيكله. أشارت هياكل IKK2 مختلفة إلى اتجاه مختلف بين المونمر داخل الخافتات بحيث أن المسافة بين كربونات ألفا من P578 في مجالين كيناز، في أربعة نماذج مختلفة من dimer، تختلف بين 39 و 61 انجستروم. كان الحصول على نموذج بحث مفيد ممكنًا بسبب خريطة المجهر ذات الدقة المنخفضة للتبريد ونموذج عالي الدقة للنطاقات IKK1 التي يمكن إنشاؤها استنادًا إلى بنية IKK2 عالية الدقة.
وأشار النموذج الأولي إلى اتجاه نطاق كيناز استدارة 24 درجة بالنسبة إلى أن من مونومر IKK2 وفتحة N-المحطة الطرفية من 58 انجستروم. باستخدام واحدة من التممر مع افتتاح 52-angstrom كنموذج، تم تحديد ستة خافمات في وحدة غير متناظرة. وبمجرد أن يتقن، يمكن تنفيذ هذه التقنية في بضعة أشهر، إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.
أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن الحصول على بروتين قابل للذوبان ونشط وحسن السلوك هو الخطوة الحاسمة الأولى. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم عام جيد لجميع الخطوات التي تحتاج إلى اتباعها في التفاصيل المضنية، لتكون ناجحة في بلورة وتحديد هيكل بروتين IKK1. تعلم هذا الإجراء، لا تزال هناك هياكل من البروتينات العائلية IKK الأخرى التي يمكن أيضا أن تحدد من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول إشارات كيناز-ميتوجين.
