מטרת הליך זה היא לספק הדרכה לייצור, התגבשות ונחישות מבנית של האדם IKK1-אלפא על מנת להבין את הבסיס המקניסטי של פונקציית האיתות שלה ולהקים פלטפורמות לעיצוב תרופות רציונלי. שיטה זו אמורה לסייע לחוקרים לקבוע את המבנה של IKK1, אשר יספק תשובות לשאלות מפתח בתחום האיתות החיסוני. טכניקה זו מתארת נתיב יעיל להשגת גבישים של חלבוני IKK, שהם עקשנים למדי להתגבש ולספק מידע קריטי שונים להתגבר על צווארי בקבוק בקביעת המבנים.
בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו, כי יצירת כמויות מיליגרם של חלבון מסיס, מתנהג היטב, דורש ביטוי שלה בתאי חרקים, התגבשות יכולה להיעשות תחת רק חלון צר מאוד של תנאים. הליך ההחלפה המולקולרית המשמש לקביעת המבנה של IKK1 יכול להיות גם מסובך מאוד, במיוחד בשל מאפיין הסטה לקוי של הגבישים, לא באתר של היחידה האסימטרית המכילה מולקולות IKK1 רבות בהיעדר מודלים מתאימים לחיפוש. הדגימו את הנהלים יהיו קייל שומט וסונג'ילה הוצ'קיס, סטודנטים מהמעבדה שלי.
ביום הראשון, צלחת Sf9 תאים בשני מיליליטר של Sf903 תא חרק בינוני, בכל באר של צלחת שש בארות דגירה ב 27 מעלות צלזיוס. מעבר התאים כאשר הם מגיעים לצפיפות של 2-3 פעמים 10 לשישה תאים למיליליטר בהשעיה על ידי דילול זה למדיה טרייה, בצפיפות של בערך שש פעמים 10 עד חמש. ביום השני, לדלל שמונה microliters של Sf9 reagent transfection ב 100 microliters של SF-903 או מדיום חרקים של גרייס.
ואז מערבולת את התערובת בקצרה. בצינור נפרד, לדלל מיקרוגרם אחד של bacmid רקומביננטי מטוהר ערכה ב 100 microliters של אותו מדיום. ערבבו את הדנ"א המדולל ואת ה-transfection reagent.
לאחר דגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 עד 30 דקות, להסיר את המדיום מן האגם. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום טרי. לאחר מכן, מוסיפים את תערובת reagent transfection DNA מדולל dropwise על התאים, התאמת גודל טיפה כך שהוא לא לנתק תאים חסידים.
לאחר שש שעות, להוסיף 1.5 מיליליטר של מדיום טרי על גבי התאים. דגירה התאים ב 27 מעלות צלזיוס, בדיקת בארות מעת לעת כל 12 שעות לסימנים של זיהום ויראלי. ביום החמישי, להסיר את התאים המכילים בינוני, 60 עד 72 שעות לאחר ההדבקה.
לאחר העברת המדיום לצינורות, צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 500 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס. בסיום, שמור את העל-טבעי, שהוא מחסנית הווירוסים P1. ביום הראשון, תן שימוש חוזר כדורי התא שלו-IKK1 שהוכן בעבר ב 40 מיליליטר של חיץ תזה.
מניחים את ההשעיה התא על קרח lyse התאים על ידי sonication ב 60%-70% מחזורי חובה וחמישה עד 10 פולסים של משך 30 שניות במרווח גדול מדקה אחת. להבהיר את lysate על ידי צנטריפוגה גדול או שווה ל 28, 000 גרם במשך 45 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הכנת שף ניקל-NTA אגרוז, על פי פרוטוקול הטקסט, לחמק חלבון אלפא IKK1 מתויג שלו תחת זרימת הכבידה באמצעות 20 מיליליטר של מאגר אלוטיון.
לאסוף שבר אחד עד 1.5 מיליליטר. לאחר שילוב השברים המכילים את החלבון, לעכל את המדגם עם פרוטאז TEV לילה בארבע מעלות צלזיוס. בבוקרו של היום השני, הדגירה את החלבון עם מילימולר אחד של ATP, בנוכחות מגנזיום כלורי, בטא גליצרופוספט, נתרן פלואוריד ונתרן אורתוובנה במשך שעה אחת ב 27 מעלות צלזיוס.
לאחר הדגירה, מסננים את ת פתרון החלבון באמצעות מסנן 0.45 מיקרון. לאחר מכן לטעון כשישה מיליליטר של המדגם על לעמודת אי הכללת גודל הכנה 120 מיליליטר, מחובר למערכת כרומטוגרפיה נוזלית אוטומטית. לאחר שיווי המשקל, הפעל את הכרומטוגרפיה של אי-הכללת הגודל בקצב זרימה של מיליליטר לדקה ואאסוף שברים של שני מיליליטר.
במהלך הריצה, לפקח על elution ב 280 ו 254 ננומטר. לאחר משיכת שברים טהורים, להתרכז 30 קילודלטון, צנטריפוגה ניתוק משקל מולקולרי, בעקבות הוראות היצרן. לאחר מכן מחלקים 25 מיקרוליטר aliquots של חלבון מרוכז והקפאת פלאש בחנקן נוזלי.
באמצעות רובוט, פיפטה 80 עד 100 מיקרוליטרים של מתגבש reagent לתוך המאגר של צלחת 96 באר. באמצעות רובוט התגבשות, לוותר ולערבב 0.2 כדי 0.25 microliters של IKK1 ואת קומפלקס מעכב שלה עם אותו נפח של פתרון המאגר. מיד לאחר הגדרת הטיפות, לאטום כל צלחת עם סרטים ברורים אופטית, כדי למנוע אידוי.
דגירה צלחת אחת ב 18 מעלות צלזיוס והצלחת השנייה בארבע מעלות צלזיוס בחדר קר. השתמש במיקרוסקופ סטריאו עם מקטב כדי לבדוק את המראה של גביש בכל טיפה, כל יום, במשך שבעת הימים הראשונים ולאחר מכן במרווחי זמן ארוכים יותר. לאחר הכנת IKK1 ואת קומפלקס המעכבים שלה כפי שתואר קודם לכן, להעביר את הפתרונות גם לכל באר של צלחת 24 היטב.
מניחים אחד עד 1.5 microliters של פתרון גם על כיסוי זכוכית נקי. מוסיפים נפח שווה של IKK1 ואת קומפלקס המעכבים שלו למכסה הזכוכית ומערבבים בעדינות על ידי צינור למעלה ולמטה שלוש עד ארבע פעמים. לאחר החלת גריז על הטבעות של כל באר של הצלחת, להפוך את כיסוי הזכוכית מעל ומקום על היטב בהתאמה עם מטלפים.
ואז לאטום את הגם על ידי לחיצה על כיסוי הזכוכית. לאחר הגדרת כל הטיפות בצלחת 24 באר, דגירה בחדר הקר, בחושך. מדי פעם לבדוק את הטיפות תחת מיקרוסקופ עבור המראה והצמיחה של גבישים.
לאחר השלמת צמיחת הגביש, הסר בעדינות את כיסוי הזכוכית המכיל את הגביש והצב אותו על משטח מוצק עם טיפת הגביש הפונה כלפי מעלה. מוסיפים בעדינות 10 מיקרוליטרים של קריו פתרון על גבי הירידה ומערבבים בעדינות על ידי צינורות כך שלא נוגעים בגביש. באמצעות מיקרוסקופ, להסיר לאט קצת נוזל מהקריסטל ולשמור על חמישה עד שמונה microliters של הפתרון.
מוסיפים בעדינות 2.5 עד 4 מיקרוליטרים של תוסף cryo B על הירידה ומערבבים בעדינות על ידי צינורות. מכסים את כיסוי הזכוכית בצלחת פטרי קטנה כדי למנוע זרימת אוויר ישירה מעל הקריסטל. לאחר המתנה של חמש דקות, בחרו בזהירות גביש אחד מהירידה בהקפאה מתאימה המותקנת על בסיס מתאים.
פלאש להקפיא את הגביש בחנקן נוזלי. לאחר מכן אחסנו את הגביש המכיל קריולואופ בדסקית שקועה בחנקן נוזלי בבקבוק דיואר עד שהם מוכנים לדיפראקציה של קרני רנטגן בסנכרון. לאחר ניסויים נרחבים עם מספר גרסאות IKK1 שונות, קריסטלים הושגו עם מבנה אחד חצוץ, אשר הציג תכונות רנטגן מתאימות רק בנוכחות מעכב IKK XII.
ההשפעה המשולבת של נתוני רנטגן ברזולוציה נמוכה עם חזקות חלשות, מספר רב של מולקולות IKK1 ביחידה הא-סימטרית וריאציה קונפורמית של המודל המונומרי-דימרי IKK1, בהשוואה לדגמי IKK2 ידועים, הקשו על השגת פתרון החלפה מולקולרית, IKK1, ולקבוע את המבנה שלו. מבנים שונים של IKK2 הצביעו על אוריינטציה בין-מונומרית שונה בתוך המטבעות שלה, כך שהמרחק בין הפחמנים האלפאים של P578 בשני תחומי הקינאז, בארבעה דגמים עמומים יותר, נע בין 39 ל -61 אנגסטרום. השגת מודל חיפוש שימושי התאפשרה בגלל מפת המיקרוסקופיה קריואלקטרון ברזולוציה נמוכה ומודל דיוק גבוה של תחומי IKK1 שיכול להיווצר בהתבסס על מבנה IKK2 ברזולוציה גבוהה.
הדגם הראשוני הצביע על אוריינטציה של תחום kinase מסתובב 24 מעלות יחסית לזה של מונומר IKK2 ופתיחה N-מסוף של 58 אנגסטרום. באמצעות אחד העמילים עם פתיחת 52 אנגסטרום כמודל, שישה dimers ביחידה אסימטרית היו ממוקמים. לאחר השליטה, טכניקה זו יכולה להתבצע בתוך כמה חודשים, אם היא מבוצעת כראוי.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי השגת חלבון מסיס, פעיל ומתנהג היטב הוא הצעד הקריטי הראשון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה כללית טובה של כל השלבים שיש לעקוב בפירוט מדוקדק, כדי להצליח להתגבש ולקבוע את המבנה של חלבון IKK1. לימוד הליך זה, יש עדיין מבנים של חלבונים משפחתיים אחרים IKK כי ניתן לקבוע גם על מנת לענות על שאלות נוספות על קינאז-מיתום איתות.
