Bu prosedürün amacı, sinyalleme işlevinin mekanistik temelini anlamak ve rasyonel ilaç tasarımı için platformlar oluşturmak için insan IKK1-alfaüretiminin, kristalizasyonunun ve yapısal tayinine rehberlik etmektir. Bu yöntem, araştırmacıların bağışıklık sinyali alanındaki anahtar sorgulara yanıt sağlayacak IKK1'in yapısını belirlemelerine yardımcı olmalıdır. Bu teknik, kristalizasyona karşı oldukça refrakter olan IKK proteinlerinin kristallerini elde etmek ve yapıların belirlenmesinde darboğazların üstesinden gelmek için çeşitli kritik bilgiler sağlamak için düzenli bir yolu tanımlar.
Genellikle, bu yönteme yeni bireyler mücadele edecek, çözünür miligram miktarlarda üreten, iyi beslenmiş protein, böcek hücrelerinde ifadesini gerektirir, ve kristalizasyon koşulları sadece çok dar bir pencere altında yapılabilir. IKK1'in yapısının belirlenmesinde kullanılan moleküler değiştirme prosedürü, özellikle uygun arama modelleri yokluğunda birçok IKK1 molekülünü içeren asimetrik ünitenin yerinde değil, kristallerin kötü sapma özelliği nedeniyle çok zor olabilir. Prosedürleri gösteren kyle Shumate ve Sonjiala Hotchkiss, benim laboratuvar öğrencileri olacak.
İlk gün, plaka Sf9 hücreleri Sf903 böcek hücre orta iki mililitre, altı kuyuplaka her kuyuda ve 27 santigrat derece kuluçka. Hücreleri, mililitre başına altı hücreye 2-3 çarpı 10'luk bir yoğunluğa ulaştıklarında, süspansiyondaki altı hücreye, taze ortama seyrelterek, yaklaşık altı kat 10 ile beş arasında bir yoğunlukta geçirin. İkinci gün, SF-903 veya Grace's Insect Medium'un 100 mikrolitresinde sekiz mikrolitre Sf9 transfeksiyon reaktifini seyreltin.
Sonra kısa bir süre karışımı girdap. Ayrı bir tüpte, aynı ortamda 100 mikrolitre kit-saflaştırılmış rekombinant bakteri bir mikrogram seyreltin. Seyreltilmiş DNA ve transfeksiyon reaktifini birleştirin.
15-30 dakika oda sıcaklığında kuluçkadan sonra, kuyudan orta çıkarın. Sonra taze orta bir mililitre ekleyin. Daha sonra, seyreltilmiş DNA transfeksiyon reaktif karışımı damla hücreleri üzerine damla, bu yapışık hücreleri yerinden etmez şekilde damla boyutunu ayarlayarak ekleyin.
Altı saat sonra, hücrelerin üstüne taze orta 1,5 mililitre ekleyin. Hücreleri 27 derecede kuluçkaya yatırın, kuyuları periyodik olarak her 12 saatte bir viral enfeksiyon belirtileri için kontrol edin. Beşinci gün, 60 ila 72 saat sonrası enfeksiyon içeren hücreleri kaldırın.
Tüpler içine orta transfer sonra, 500 kez g ve dört derece santigrat beş dakika santrifüj. Bittiğinde, P1 virüs yığını olan supernatant kaydedin. İlk gün, daha önce hazırlanmış Olan-IKK1 hücre peletini 40 mililitre lysis tamponu içinde yeniden askıya alın.
Hücre süspansiyonunu buza yerleştirin ve bir dakikadan daha uzun bir aralıkla %60 ila %70 görev döngüsü ve 5 ila 10 darbe 30 saniyelik bir süre içinde sonication ile hücreleri lyse. 4 santigrat derecede 45 dakika için 28,000 g'dan daha fazla veya eşit santrifüj ile lysate'yi netleştirin. Bir Nikel-NTA Agarose reçin hazırladıktan sonra, metin protokolüne göre, 20 mililitre elüsyon tamponu kullanarak yerçekimi akışı altında His-tagged IKK1 alfa proteinini eleyin.
Bir ila 1,5 mililitre kesirler toplayın. Protein içeren kesirleri birleştirdikten sonra, dört santigrat derece bir gecede TEV proteaz ile örnek sindirmek. İkinci günün sabahında, magnezyum klorür, beta-gliserofosfat, sodyum florür ve sodyum orthovanadate varlığında 27 santigrat derece bir saat boyunca, ATP bir milimolar ile protein kuluçka.
Kuluçkadan sonra protein çözeltisini 0,45 mikron filtreden filtreleyin. Daha sonra, otomatik sıvı kromatografi sistemine bağlı 120 mililitrelik preparatif boyut dışlama sütununa numunenin yaklaşık altı mililitresini yükleyin. Equilibration sonra, dakikada bir mililitre akış hızında boyut dışlama kromatografi çalıştırın ve iki mililitre kesirler toplamak.
Çalışma sırasında, 280 ve 254 nanometre de elütion izleyin. Saf fraksiyonları çektikten sonra, üreticinin talimatlarına uyarak, 30 kiloluk, moleküler ağırlık kesme santrifüj konsantratörüne konsantre olun. Sonra konsantre protein ve sıvı nitrojen flaş-dondurma 25-mikrolitre aliquots dağıtmak.
Bir robot kullanarak, pipet 80 ila 100 mikrolitre bir kristalizasyon reaktifi 96-kuyu plaka rezervuar içine. Bir kristalizasyon robotu kullanarak, 0,2 ila 0,25 mikrolitre IKK1 ve inhibitör kompleksini aynı rezervuar çözeltisi hacmine sahip olarak dağıtın ve karıştırın. Damlaları ayarladıktan hemen sonra, buharlaşmayı önlemek için her plakayı optik olarak temiz filmler ile kapatın.
Bir tabağı 18 derecede, diğer tabağı da soğuk bir odada 4 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Her damla kristal görünümünü kontrol etmek için bir polarize ile bir stereo mikroskop kullanın, her gün, ilk yedi gün ve daha sonra daha uzun aralıklarla. IKK1 ve inhibitör kompleksini daha önce açıklandığı gibi hazırladıktan sonra kuyu çözümlerini 24 kuyulu bir plakanın her kuyuya aktarın.
Temiz bir cam kapak üzerine 1 ila 1,5 mikrolitre kuyu çözeltisi yerleştirin. Cam kapak kaymasına eşit hacimli IKK1 ve inhibitör kompleksini ekleyin ve üç ila dört kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak hafifçe karıştırın. Plakanın her kuyunun halkalarına gres uyguladıktan sonra, cam kapağını ters çevirin ve ilgili kuyuya forceplerle yerleştirin.
Daha sonra cam kapak üzerine bastırarak kuyuyu kapatın. 24 kuyulu tabaktaki tüm damlaları ayarladıktan sonra, soğuk odada, karanlıkta kuluçkaya yat. Bazen görünüm ve kristallerin büyüme için bir mikroskop altında damla kontrol edin.
Kristal büyüme tamamlandıktan sonra, kristali içeren cam kapak kaymasını nazikçe çıkarın ve kristal indikyukarı bakacak şekilde sağlam bir yüzeye yerleştirin. Yavaşça kriyo 10 mikrolitre damla üstüne bir çözüm ekleyin ve yavaşça kristal dokunulmaz borulama tarafından karıştırın. Bir mikroskop kullanarak, yavaş yavaş kristal bazı sıvı çıkarın ve çözeltiyaklaşık beş ila sekiz mikrolitre tutun.
Yavaşça damla üzerine cryo B çözeltisi 2,5 ila dört mikrolitre ekleyin ve yavaşça pipetleme ile karıştırın. Kristal üzerinde doğrudan hava akımını önlemek için küçük bir Petrie çanak ile cam coverslip kapağı. Beş dakika bekledikten sonra, uygun bir taban üzerine monte uygun bir kriyoloop damla tek bir kristal seçin.
Kristali sıvı nitrojenle dondurun. Daha sonra kriyoloop içeren kristali, senkrotrondaki X-ışını kırınımı için hazır olana kadar de bir Dewar şişesinde sıvı nitrojene batırılmış bir diskte saklayın. Birkaç farklı IKK1 varyantı ile yapılan kapsamlı çalışmalardan sonra kristaller, sadece IKK inhibitörü XII'nin varlığında uygun X-ışını özelliklerini gösteren tek bir kesilmiş yapı ile elde edilmiştir.
Düşük çözünürlüklü X-ışını verilerinin zayıf yoğunlukları, asimetrik birimdeki çok sayıda IKK1 molekülü ve IKK1 monomerik-dimerik modelinin konformasyonel varyasyonu, bilinen IKK2 modellerine göre moleküler replasman solüsyonu, IKK1 ve yapısını belirlemeyi zorlaştırdı. Farklı IKK2 yapıları, p578'in alfa karbonları arasındaki mesafenin iki kiazalan etki alanında, dört farklı dimer modelinde 39 ve 61 angstrom arasında değişebilmeleri için, dimer'lerinde farklı monomerler arası oryantasyon göstermiştir. Düşük çözünürlüklü kriyoelektron mikroskopi haritası ve yüksek çözünürlüklü IKK2 yapısına dayalı olarak oluşturulabilen IKK1 etki alanlarının yüksek doğruluklu modeli sayesinde yararlı bir arama modeli elde etmek mümkün oldu.
İlk model, kiyaz etki alanının bir IKK2 monomerve 58 angstroms N-terminal açılış göre 24 derece döndürülen bir yönünü gösterdi. 52-angstrom açılımı model olarak dimerlerden birini kullanarak asimetrik ünitede altı dimer saptandı. Bir kez hakim, bu teknik birkaç ay içinde yürütülebilir, düzgün yapılırsa.
Bu prosedürü denerken, çözünür, aktif ve iyi beslenmiş bir protein elde ilk kritik adım olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra IKK1 proteininin kristalize edilmesi nde ve yapısını belirlemede başarılı olmak için özenli bir detayla izlenmesi gereken tüm adımları iyi bir genel anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü öğrenmek, kiaz-mitojen sinyalizasyonu ile ilgili ek soruları cevaplamak için de belirlenebilen diğer IKK aile proteinlerinin yapıları vardır.
