この手順の目的は、シグナル伝達機能の機構基盤を理解し、合理的な薬物設計のためのプラットフォームを確立するために、ヒトIKK1-αの生産、結晶化、構造決定のためのガイダンスを提供することです。この方法は、研究者が免疫シグナル伝達の分野で主要なクエリへの答えを提供するIKK1の構造を決定するのに役立ちます。この技術は、結晶化に対して難治性であり、構造を決定する際のボトルネックを克服する上で様々な重要な情報を提供するIKKタンパク質の結晶を得るための合理化された経路を記述する。
一般的に、この方法に新しい個人は、可溶性の、行き届いたタンパク質のミリグラム量を生成するので、昆虫細胞でその発現を必要とし、結晶化は非常に狭い条件の窓の下でのみ行うことができるので、苦労します。IKK1の構造を決定する際に使用される分子置換手順は、特に結晶の偏向特性が悪いため、適切な検索モデルがない場合に多くのIKK1分子を含む非対称ユニットの部位ではなく、非常に難しい場合があります。手順を実証するには、カイル・シュマテとソンジアラ・ホッチキス(私の研究室の学生)がいます。
1日目には、Sf903昆虫細胞培地2ミリリットルのSf9細胞を6ウェルプレートの各ウェルにプレートし、摂氏27度でインキュベートする。細胞を2~3倍の密度に達すると、1ミリリットル当たり6個の細胞を新鮮な培地に希釈し、約6倍の濃度で5個まで通過する。2日目には、SF-903またはグレースの昆虫培地の100マイクロリットルにSf9トランスフェクション試薬の8マイクロリットルを希釈します。
その後、混合物を短時間渦液します。別のチューブで、同じ媒体の100マイクロリットルにキット精製組換えバクミドの1マイクログラムを希釈します。希釈したDNAとトランスフェクション試薬を組み合わせます。
室温で15~30分間インキュベートした後、ウェルから培地を取り出します。その後、新鮮な媒体の1ミリリットルを追加します。次に、希釈したDNAトランスフェクション試薬混合物を細胞上に滴下して添加し、接着細胞を外さないようなドロップサイズを調整する。
6時間後、細胞の上に新鮮な培地を1.5ミリリットル加えます。細胞を摂氏27度でインキュベートし、ウイルス感染の兆候がないか12時間ごとに定期的に井戸をチェックする。5日目に、感染後60〜72時間の細胞を含む培地を取り除く。
培地をチューブに移した後、500倍gと摂氏4度で5分間遠心分離機。終了したら、P1ウイルススタックである上清を保存します。1日目に、以前に調製したHis-IKK1細胞ペレットを40ミリリットルのリシスバッファーに再中断する。
細胞懸濁液を氷の上に置き、60%〜70%のデューティサイクルで超音波処理し、1分以上の間隔で30秒の持続時間の5〜10パルスで細胞をライスします。摂氏4度で45分間、28,000g以上で遠心分離により、リセートを明らかにする。テキストプロトコルに従ってニッケルNTAアガロース樹脂を調製した後、20ミリリットルの溶出バッファーを使用して重力流下でHisタグ付きIKK1アルファタンパク質を溶出する。
1から1.5ミリリットルの分数を収集します。タンパク質を含む分画を組み合わせた後、摂氏4度で一晩TEVプロテアーゼでサンプルを消化する。2日目の朝、塩化マグネシウム、β-グリセロリン酸、フッ化ナトリウム、オルトバナジン酸ナトリウムの存在下で、27°Cで1時間、ATPの1ミリモルでタンパク質をインキュベートします。
インキュベーション後、0.45ミクロンのフィルターを介してタンパク質溶液を濾過します。その後、サンプルの約6ミリリットルを120ミリリットルの調製サイズ排除カラムに積み込み、自動液体クロマトグラフィーシステムに取り付けます。平衡後、サイズ排除クロマトグラフィーを1分間に1ミリリットルの流量で実行し、2ミリリットル分数を収集します。
走行中、280および254ナノメートルで溶出を監視します。純粋な分画を引っ張った後、メーカーの指示に従って、30キロダルトン、分子量カットオフ遠心濃縮器に濃縮します。次に、濃縮タンパク質の25マイクロリットルのアリコートを分配し、液体窒素中でフラッシュフリーズします。
ロボットを用いて、96ウェルプレートの貯留槽に結晶化試薬のピペット80〜100マイクロリットル。結晶化ロボットを使用して、0.2~0.25マイクロリットルのIKK1とその阻害剤複合体を同じ体積のリザーバー溶液で分配して混合します。滴を設定した直後に、蒸発を避けるために光学的に透明なフィルムで各プレートを密封する。
冷たい部屋で1つのプレートを摂氏18度で、もう一方のプレートを摂氏4度でインキュベートします。偏光板付きのステレオ顕微鏡を使用して、毎日、最初の7日間、そしてより長い間隔で、各ドロップ中の結晶の外観を確認します。先に説明したようにIKK1とその阻害剤複合体を調製した後、24ウェルプレートの各ウェルにウェル溶液を移します。
1~1.5マイクロリットルのウェル溶液をきれいなガラスカバースリップに置きます。ガラスカバースリップに等量のIKK1とその阻害剤複合体を加え、上下に3〜4回ピペットで軽く混ぜます。プレートの各ウェルのリングにグリースを塗布した後、ガラスカバースリップを裏返し、各ウェルに鉗子を置きます。
その後、ガラスのカバースリップを押し下げて井戸を密封します。24ウェルプレートにすべての滴を設定した後、暗闇の中で、冷たい部屋でインキュベート。時折、結晶の外観と成長のために顕微鏡の下で滴をチェックしてください。
結晶の成長が完了したら、クリスタルを含むガラスカバースリップをそっと取り出し、クリスタルドロップを上向きにして固体表面に置きます。10マイクロリットルのクライオA溶液をドロップの上にそっと加え、結晶が触れないようにピペッティングして軽く混ぜます。顕微鏡を使用して、ゆっくりと結晶から液体を取り出し、溶液の約5〜8マイクロリットルを保ちます。
2.5~4マイクロリットルのクライオB溶液をドロップにそっと加え、ピペットで軽く混ぜます。クリスタル上の直接の気流を避けるために、小さなペトリー皿でガラスカバースリップを覆います。5分待った後、適切なベースに取り付けられた適切なクライオループのドロップから慎重に単一の結晶を選びます。
液晶を液体窒素でフラッシュフリーズします。その後、クライオループを含む結晶を、シンクロトロンでX線回折の準備ができるまで、デュワーフラスコの液体窒素に浸したパックに保管します。いくつかの異なるIKK1変異体を用いた広範な試験の後、結晶は1つの切り捨てられた構造で得られ、IKK阻害剤XIIの存在下でのみ適切なX線特性を示した。
低解像度X線データの強度の弱さ、非対称ユニットの多数のIKK1分子、およびIKK1単量体二量体モデルの立体構造変化を組み合わせることで、既知のIKK2モデルと比較して分子置換溶液IKK1を得てその構造を決定することが困難となった。異なるIKK2構造は、2つのキナーゼドメインにおけるP578のアルファ炭素間の距離が、4つの異なるダイマーモデルにおいて、39から61のオングストロームの間で変化するように、そのダイマー内で異なる単量体配向を示した。低解像型のクライオ電子顕微鏡マップと、高解像度IKK2構造に基づいて生成できるIKK1ドメインの高精度モデルにより、有用な探索モデルを得ることが可能でした。
最初のモデルは、IKK2モノマーと58オングストロームのN端子開口部に対して24度回転したキナーゼドメインの向きを示した。52オングストローム開口部を持つダイマーの1つをモデルとして使用して、非対称ユニット内に6つのダイマーが配置されました。一度習得すると、この技術は、それが適切に実行されている場合、数ヶ月で実行することができます。
この手順を試みる間、可溶性、活性および行行性の高いタンパク質の取得が最初の重要なステップであることを覚えておくことが重要です。このビデオを見た後、IKK1タンパク質の結晶化と構造の決定に成功するために、詳細に従う必要があるすべてのステップをよく理解する必要があります。この手順を学ぶと、キナーゼ-マイトゲンシグナル伝達に関する追加の質問に答えるために決定できる他のIKKファミリータンパク質の構造がまだあります。
