Цель этой процедуры заключается в том, чтобы обеспечить руководство для производства, кристаллизации и структурной решимости человека IKK1-альфа для того, чтобы понять механистическую основу своей сигнальной функции и создать платформы для рационального проектирования наркотиков. Этот метод должен помочь исследователям определить структуру IKK1, которая даст ответы на ключевые вопросы в области иммунной сигнализации. Этот метод описывает обтекаемый путь к получению кристаллов белков IKK, которые являются довольно огнеупорными для кристаллизации и предоставления различной критической информации в преодолении узких мест в определении структур.
Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться, потому что генерации миллиграммовых количеств растворимого, хорошо себя белок, требует его выражения в клетках насекомых, и кристаллизации может быть сделано только в очень узком окне условий. Процедура молекулярной замены, используемая при определении структуры IKK1, также может быть очень сложной, особенно из-за плохого свойства отклонения кристаллов, а не в месте асимметричного блока, содержащего много молекул IKK1 в отсутствие соответствующих моделей поиска. Демонстрацией процедур будут Кайл Шумат и Сонджиала Хотчкис, студенты из моей лаборатории.
На первый день, пластины Sf9 клетки в двух миллилитров Sf903 насекомых клеточной среды, в каждом хорошо из шести хорошо пластины и инкубировать при 27 градусов по Цельсию. Прохождение клеток, когда они достигают плотности от двух до трех раз от 10 до шести клеток на миллилитр в подвеске, разбавляя его свежими средствами массовой информации, при плотности примерно шесть раз от 10 до пяти. На второй день разбавляют восемь микролитров трансфектного реагента Sf9 в 100 микролитров SF-903 или Grace's Insect Medium.
Затем вихрь смесь кратко. В отдельной трубке разбавьте один микрограмм очищенной комплектом рекомбинантной бакмиды в 100 микролитров той же среды. Объедините разбавленную ДНК и трансфектный реагент.
После инкубации при комнатной температуре в течение 15-30 минут, удалите среду из колодец. Затем добавьте один миллилитр свежей среды. Затем добавьте разбавленную смесь трансфекции ДНК на клетки, регулируя размер капли таким образом, чтобы она не вытесняла клетки-адепты.
Через шесть часов добавьте 1,5 миллилитров свежей среды поверх клеток. Инкубировать клетки при 27 градусах по Цельсию, периодически проверяя колодцы каждые 12 часов на наличие признаков вирусной инфекции. На пятый день удалите среду, содержащую клетки, через 60-72 часа после заражения.
После переноса среды в трубки, центрифуга в течение пяти минут при 500 раз г и четыре градуса по Цельсию. После завершения, сохранить супернатант, который является P1 вирус стек. В первый день, resuspend ранее подготовленных Его-IKK1 ячейки гранулы в 40 миллилитров лиза буфера.
Поместите подвеску клетки на лед и высасыв клетки с помощью звуковых данных на 60%-70% циклов и от пяти до 10 импульсов 30-секундной продолжительности с интервалом более одной минуты. Уточните лисат центрифугой при большем или равном 28 000 г в течение 45 минут при четырех градусах Цельсия. После подготовки никель-НТА Агароза смолы, в соответствии с текстовым протоколом, elute его помечены IKK1 альфа-белка под гравитационным потоком с использованием 20 миллилитров элюционного буфера.
Соберите от 1 до 1,5 миллилитров фракций. После объединения фракций, содержащих белок, переварить образец с TEV protease ночь на четыре градуса по Цельсию. Утром второй день инкубировать белок с одним миллимоляном АТФ, в присутствии хлорида магния, бета-глицерофосфата, фтора натрия и ортованата натрия в течение одного часа при 27 градусах Цельсия.
После инкубации фильтруем белковый раствор через фильтр 0,45 микрона. Затем загрузите около шести миллилитров образца на 120-миллилитровую препаративную колонку с исключением размеров, прикрепленную к автоматизированной жидкой хроматографической системе. После эквилибрации запустите хроматографию с исключением размеров со скоростью потока в один миллилитр в минуту и соберите двухми миллилитровые фракции.
Во время бега монитор elution на 280 и 254 нанометров. Потянув чистые фракции, сосредоточьтесь в 30-килодальтонном молекулярном центробежном концентраторе, следуя инструкциям производителя. Затем обойтись без 25-микролитровых алицитов концентрированного белка и флэш-заморозки в жидком азоте.
Используя робота, пипетка от 80 до 100 микролитров кристаллизации реагента в резервуар 96-ну пластины. Используя кристаллизацию робота, обойтись и смешать от 0,2 до 0,25 микролитров IKK1 и его тормозной комплекс с тем же объемом раствора резервуара. Сразу же после установки капель, печать каждой пластины с оптически чистой пленки, чтобы избежать испарения.
Инкубировать одну пластину при 18 градусах по Цельсию, а другую тарелку при четырех градусах по Цельсию в холодной комнате. Используйте стерео микроскоп с поляризатором, чтобы проверить появление кристалла в каждой капле, каждый день, в течение первых семи дней, а затем с более длительными интервалами. После подготовки IKK1 и его ингибитор комплекса, как описано ранее, передать хорошо решения для каждой колодец 24-хорошо пластины.
Поместите от 1 до 1,5 микролитров раствора хорошо на чистую стеклянную крышку. Добавьте равный объем IKK1 и его ингибиторный комплекс в стеклянную крышку и аккуратно перемешайте, трубя вверх и вниз три-четыре раза. После нанесения смазки на кольца каждого колодец пластины, поверните стеклянную крышку и поместите на соответствующий колодец с типсами.
Затем запечатайте колодец, нажав на стеклянную крышку. После настройки всех капель в 24-хорошо пластины, инкубировать в холодной комнате, в темноте. Иногда проверяйте капли под микроскопом на внешний вид и рост кристаллов.
После того, как рост кристалла завершен, аккуратно удалите стеклянную крышку, содержащую кристалл, и поместите его на твердую поверхность с хрустальным падением вверх. Аккуратно добавьте 10 микролитров раствора крио А поверх капли и аккуратно перемешайте с помощью пипетки, чтобы кристалл не коснулся. Используя микроскоп, медленно удалить жидкость из кристалла и держать около пяти-восьми микролитров раствора.
Аккуратно добавьте от 2,5 до четырех микролитров раствора крио В на каплю и аккуратно перемешайте с помощью пипетки. Обложка стеклянная крышка с небольшой чашкой Петри, чтобы избежать прямого воздушного потока над кристаллом. Прожгов пять минут, тщательно выберите один кристалл из капли в соответствующем криолупе, установленном на надлежащей основе.
Вспышка заморозить кристалл в жидком азоте. Затем храните кристалл, содержащий криолуп, в шайбе, погруженной в жидкий азот, в колбе Dewar до готовности к рентгеновской дифракции на синхротроне. После обширных испытаний с несколькими различными вариантами IKK1 кристаллы были получены с одной усеченной конструкцией, которая отображала подходящие рентгеновские свойства только в присутствии ингибитора IKK XII.
Совокупный эффект рентгеновских данных низкого разрешения со слабой интенсивности, большое количество молекул IKK1 в асимметричной единице и конформациальная вариация мономерно-димерикальной модели IKK1, по сравнению с известными моделями IKK2, затухлили получение молекулярно-заместительного раствора IKK1 и определение его структуры. Различные структуры IKK2 указывали на различную межмономерную ориентацию в пределах своих димеров, так что расстояние между альфа-углеродами P578 в двух областях киназы, в четырех различных моделях димера, варьировалось между 39 и 61 ангстремами. Получение полезной модели поиска стало возможным благодаря карте криоэлектронные микроскопии с низким разрешением и высокото точности модели доменов IKK1, которые могут быть созданы на основе структуры IKK2 с высоким разрешением.
Первоначальная модель указывала на ориентацию домена киназы на 24 градуса по сравнению с мономером IKK2 и N-терминальным отверстием 58 ангстремов. Используя один из димеров с 52-ангстрем открытия в качестве модели, шесть димеров в асимметричный блок были расположены. После освоения, эта техника может быть выполнена в течение нескольких месяцев, если она выполняется должным образом.
При попытке этой процедуры, важно помнить, что получение растворимого, активного и хорошо себя белок является первым важным шагом. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее общее понимание всех шагов, которые должны следовать в кропотливой детали, чтобы быть успешным в кристаллизации и определения структуры белка IKK1. Изучая эту процедуру, все еще существуют структуры других белков семьи IKK, которые также могут быть определены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы о сигнализации киназы-митогена.
