الهدف العام لهذا الإجراء هو دراسة إزالة الحساسية واستعادة الحساسية من جراد البحر photoreceptors كدالة من الوقت circadian، وذلك باستخدام التسجيلات الكهربائية بين الخلايا الخلوية من الخلايا مستقبلات ضوئية في مخزونات العين المعزولة، وتوظيف القطب واحد متقطعة تحول تكوين المشبك الجهد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، مثل الاعتماد على الوقت الإيقاعي للعديد من الخصائص الكهروإيزيولوجية للمصابين بالفوتونات في التنشيط والتعافي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية، هو أنه يسمح لقياس النشاط الضوئية.مستقبلات'.
على الرغم من صعوبة عزل الخلايا ودون إزعاج الوسط داخل الخلايا. ومن بين البرهان على هذا الإجراء الطبيبان كارولينا باريغا- مونتويا وأراكيلي دي لا- ماريتنيز، زميلتا العمل في مختبرنا. لإعداد القطب داخل الخلايا، اسحب أنبوب الشعيرات الدموية الزجاجية مع جرة ميكروبيبيت للحصول على طرف رفيع مع فتحة صغيرة.
بعد ذلك ، املأ الزجاج الشعري المسحوب بمحلول كلوريد البوتاسيوم 2.7-المولر بواسطة الشعيرات الدموية ثم املأ نصف الماصة بإبرة حقن دقيقة. إذا لزم الأمر، اضغط على ماصة القطب للقضاء على فقاعات الهواء. بعد ذلك، ضع القطب على حامله.
توصيل حامل إلى مرحلة رئيس مكبر للصوت مع مكبر للصوت. بعد ذلك، ضع حامل القطب مرحلة الرأس مع ميكرومانيبولاتور 3-D مستقرة. خفض القطب حتى حمام الحل يغطي تلميح.
حدد وضع الجسر من مكبر للصوت وقياس مقاومة القطب. تأكد من أن المقاومة حوالي 50 ميغاه أوه. فارغة الحالية تعويض وعوض العابرين بالسعة باستخدام الضغط على زر موقف في مقطع الجهد المشبك من مكبر للصوت وسعة تحييد زر في Microelectrode 1 قسم من مكبر للصوت.
لبناء نظام الانصهار السوبر، صب محلول الحمام في وعاء مناسب وربطه بمجموعة أنابيب الري، وبالتالي ربط غرفة التسجيل. استخدام نظام الضخ الفائق يحركها الجاذبية. تنظيم معدل التدفق إلى 0.5 ملليلتر في الثانية الواحدة.
قم بتوصيل الغرفة بجهاز شفط. تنظيم نظام شفط الحل مع مضخة فراغ في مثل هذه الطريقة التي لا تختلف الحجم الإجمالي للغرفة تسجيل. لعزل مخزون العين من جراد البحر الكبار، وفصله عن القاعدة مع زوج من مقص غرامة.
جعل فتحة من ملليمتر مربع واحد في القرنية الظهرية باستخدام شفرة حلاقة للوصول إلى شبكية العين. بعد ذلك، ضع مخزون العين في وسط غرفة التسجيل مع مواجهة فتحة الشبكية. إبقاء مخزون العين في الظلام لمدة 20 دقيقة.
ضع المايكروكيلترودي بالتوازي مع محور العين الطولي في مثل هذه الطريقة التي تركز على microelectrode للوصول إلى شبكية العين. استخدام المجهر مجسم لوضع الأجهزة في التكوين الصحيح. بعد ذلك، مراقبة الفرق الجهد بين المرجعية وتسجيل الأقطاب الكهربائية عن طريق تحديد وضع الجسر من مكبر للصوت.
خفض القطب في الحمام ووضعها الحق على شبكية العين. إزالة المجهر ووضع مصباح phototimulator موازية لمحور العين الأسهم الطولية. ثم، ببطء خفض microelectrode حتى يتم الكشف عن انخفاض الجهد المفاجئ.
في وقت لاحق ، وتقديم فلاش ضوء الاختبار لتسجيل مستقبلات photoreceptor المحتملة. للحصول على التسجيلات المناسبة للتيارات التي أثارها الضوء، من المهم جداً أن يكون هناك ضعف جيد في خلية مستقبلات ضوئية سليمة. في هذا الإجراء، المشبك الجهد في غشاء يستريح المحتملة قياس الخلية عن طريق اختيار عقد السعة في برنامج الحصول على البيانات.
ثم حدد وضع DSEVC مكبر للصوت. في قسم الوضع في مكبر الصوت، حدد زر SEVC والتبديل في ذراع إلى Discont. موقف SEVC.
تعيين معدل التبديل إلى 500 إلى 1، 000 هرتز، كما يحددها سرعة القطب. بعد ذلك، وتقديم ومضة خفيفة ومراقبة تدفق الأيونات أثار. ثم، تقديم زوج من نبضات الضوء وتطبيق الفلاش الثاني بعد الفاصل الزمني المطلوب.
رقمنة التيارات في أخذ العينات 10 كيلوهرتز مع برنامج الحصول على البيانات وحفظ البيانات لتحليل دون اتصال. يظهر هنا بروتوكول نبضتين. تم تطبيق المحفزات الخفيفة في ميلي ثانية صفر و 700 مللي ثانية.
ويبين هذا الرقم الانتعاش من إزالة الحساسية. هنا هو الانتعاش الكمون، وهنا ذروة الانتعاش الحالي، وهنا هو الانتعاش وقت إزالة الحساسية ثابت تاو. تم إجراء التجارب في ساعة الصفر circadian الوقت.
هذا الرقم يبين الانتعاش من إزالة الحساسية كدالة من الوقت circadian. هذا هو الانتعاش iP، وهذا هو L الانتعاش، وهذا هو الانتعاش تاو، وهذا الرسم البياني يبين الثوابت الوقت المرجح. يتم وضع علامة على العمليات الثنائية بسهم.
مرة واحدة يتقن، يمكن أن يتم هذا الأسلوب في ساعتين، إذا كان ذلك صحيحا. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن تهدف إلى انخفاض مستوى الضجيج وانخفاض تسرب الحالية، وضعف مستقبلات ضوئية. بعد هذا الإجراء، يمكن القيام به أساليب أخرى، مثل الخضوع للتشباع الدوائي، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية، مثل إشراك قنوات معينة، مستقبلات، أو إشارات المسارات.
بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا العصبية لاستكشاف الاعتماد الزمني الإيقاعي للخصائص الكهروفيزيولوجية للخلايا المستقبلة الضوئية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية دراسة إزالة الحساسية واسترداد تيار النقل النشط للضوء باستخدام تقنية التسجيل داخل الخلايا.
