המטרה הכוללת של הליך זה היא ללמוד desensitization והתאוששות רגישות של photoreceptors סרטנים כפונקציה של הזמן הביולוגי, באמצעות הקלטות חשמליות בין תאיים של תאים photoreceptor במלאי עיניים מבודד, באמצעות אלקטרודה אחת רציפה עברה תצורת מתח מתח. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה, כגון התלות בזמן הביולוגי של כל כך הרבה תכונות אלקטרו-פיזיולוגיות של פוטורצפטורים בהשבתה והתאוששות. היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא שהיא מאפשרת מדידה של הפעילות החשמלית של פוטורצפטורים.
למרות הקושי לבודד תאים ומבלי להפריע למילייה תאי. הדגמת הליך זה יהיו הרופאים קרולינה Barriga-Montoya ו Araceli דה לה O-Maritnez, עמיתים לעבודה של המעבדה שלנו. כדי להכין את האלקטרודה תאית, למשוך את צינור נימי זכוכית עם מושך micropipette כדי לקבל קצה דק עם פתח קטן.
לאחר מכן, למלא את זכוכית נימי משך עם 2.7-טוחן אשלגן כלורי פתרון על ידי נימים ולאחר מכן, למלא חצי פיפטה עם מחט הזרקה בסדר. במידת הצורך, הקש על פיפטה אלקטרודה כדי לחסל בועות אוויר. לאחר מכן, מניחים את האלקטרודה על המחזיק שלה.
חבר את המחזיק לשלב ראש המגבר עם המגבר. לאחר מכן, מקם את שלב הראש של מחזיק האלקטרודה עם מיקרומניפולטור תלת-מית יציב. מנמיך את האלקטרודה עד שתסתר האמבטיה מכסה את הקצה שלה.
בחר את מצב הגשר של המגבר ולמדוד את ההתנגדות אלקטרודה. ודא כי ההתנגדות היא כ 50 מגה-הם. בטל את זרם ההיסט ופצה על ארעיים קיבוליים באמצעות לחצן מיקום ההחזקה במהדק מתח המקטע של המגבר ולחצן נטרול הקיבוליות בחלק Microelectrode 1 של המגבר.
כדי לבנות את מערכת היתוך סופר, יוצקים את פתרון האמבטיה לתוך כלי קיבול מתאים ולחבר אותו סט צינורות השקיה, ובכך לחבר את תא ההקלטה. השתמש במערכת עירוי-על מונחית כבידה. לווסת את קצב הזרימה ל 0.5 מיליליטר לשנייה.
חבר את התא להתקן יניקה. לווסת את מערכת יניקת הפתרון עם משאבת ואקום באופן כזה שהנפח הכולל של תא ההקלטה אינו משתנה. כדי לבודד את מלאי העיניים של סרטנים בוגרים, נתק אותו מהבסיס עם זוג מספריים עדין.
הפוך פתח של מילימטר מרובע אחד בקרנית הגב באמצעות סכין גילוח כדי לגשת לרשתית. לאחר מכן, מניחים את מלאי העיניים במרכז תא ההקלטה עם הפתח לרשתית הפונה כלפי מעלה. שמור את מלאי העין בחושך במשך 20 דקות.
מניחים את המיקרו-אלקטרוד במקביל לציר האורך של מניות העין באופן כזה שהמיקרו-אלקטרוד מרוכז כדי לגשת לרשתית. השתמש במיקרוסקופ סטריאוסקופי כדי למקם את ההתקנים בתצורה הנכונה. לאחר מכן, נטר את הפרש המתח בין ההפניה לבין אלקטרודות ההקלטה על-ידי בחירת מצב הגשר של המגבר.
מנמיך את האלקטרודה לאמבטיה ומ מניח אותה ממש מעל הרשתית. הסר את המיקרוסקופ ומקם את מנורת פוטוטימולטור במקביל לציר האורך של מניות העין. לאחר מכן, מנמיך באיטיות את המיקרו-אלקטרוד עד לגילוי ירידת מתח פתאומית.
לאחר מכן, לספק הבזק אור הבדיקה כדי להקליט את פוטנציאל הקולטן של photoreceptor. כדי להשיג הקלטות מתאימות של זרמים מעוררי אור, זה קריטי כדי להפוך פגיעה טובה של תא פוטורצפטור בריא. בהליך זה, מהדקים את המתח בפוטנציאל הממברנה הנמדד של התא על ידי בחירת משרעת מחזיקה בתוכנת רכישת הנתונים.
לאחר מכן, בחר את מצב DSEVC של המגבר. במקטע המצב של המגבר, בחר בלחצן SEVC והבריד את הידית לדיסקונט. עמדת SEVC.
הגדר את קצב המיתוג ל- 500 עד 1,000 הרץ, כפי שנקבע על-ידי מהירות האלקטרודה. לאחר מכן, לספק הבזק אור ולצפות שטף היונים עורר. לאחר מכן, לספק זוג פולסים אור ולהחיל את ההבזק השני לאחר מרווח הזמן הרצוי.
הפוך את הזרמים לדיגיטליים בדגימה של 10 קילוהרץ באמצעות תוכנת רכישת הנתונים ושמור את הנתונים לניתוח לא מקוון. מוצג כאן הוא פרוטוקול שני פעימות. גירויים קלים יישמו באפס אלפיות שנייה ו-700 אלפיות שנייה.
נתון זה מציג את ההתאוששות מניתוח רגישות. הנה התאוששות השהיה, הנה התאוששות זרם שיא, והנה זמן רגישות התאוששות טאו מתמדת. ניסויים בוצעו באפס שעות בסביבות הזמן הביולוגי.
נתון זה מציג את ההתאוששות מניתוק רגישות כפונקציה של הזמן הביולוגי. זוהי התאוששות iP, זוהי התאוששות L, וזה התאוששות טאו, וגרף זה מראה את קבועי הזמן משוקלל. תהליכים ביפאיים מסומנים בחץ.
לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות בעוד שעתיים, אם זה נעשה כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לכוון רעש נמוך זרם דליפה נמוכה, פגיעה פוטורצפטור. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות, כמו בדיקות פרמקולוגיות, ניתן לעשות על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו מעורבות של ערוצים מסוימים, קולטנים, או איתות מסלולים.
לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הנוירוביולוגיה לחקור את התלות בזמן הביולוגי של תכונות אלקטרופיזיולוגיות של תאי פוטורצפטור. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך ללמוד רגישות והתאוששות של זרם טרנסדוקציה מופעל אור באמצעות טכניקת הקלטה תאית.
