Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Diesensibilisierung und Empfindlichkeitsrückgewinnung von Krebsphotorezeptoren als Funktion der zirkadianen Zeit zu untersuchen, wobei interzelluläre elektrische Aufzeichnungen von Photorezeptorzellen in isolierten Augenbeständen verwendet werden, wobei die diskontinuierliche Konfiguration der geschalteten Spannungsspannung mit einer EinzigenElektrode verwendet wird. Diese Methode kann helfen, schlüsselhafte Fragen im neurobiologischen Bereich zu beantworten, wie die zirkadiane Zeitabhängigkeit so vieler elektrophysiologischer Eigenschaften von Photorezeptoren bei Inaktivierung und Genesung. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Messung der elektrischen Aktivität von Photorezeptoren ermöglicht.
Trotz der Schwierigkeit, Zellen zu isolieren und ohne das intrazelluläre Milieu zu stören. Die Ärzte Carolina Barriga-Montoya und Araceli de la O-Maritnez, Mitarbeiter unseres Labors, demonstrieren dieses Verfahren. Um die intrazelluläre Elektrode vorzubereiten, ziehen Sie das Glaskapillarrohr mit einem Mikropipette-Puller, um eine dünne Spitze mit einer kleinen Öffnung zu erhalten.
Als nächstes füllen Sie das gezogene Kapillarglas mit 2,7-molaren Kaliumchlorid-Lösung durch Kapillarität und dann füllen Sie die Hälfte der Pipette mit einer feinen Injektionsnadel. Tippen Sie bei Bedarf auf die Elektrodenpipette, um Luftblasen zu beseitigen. Danach legen Sie die Elektrode auf ihren Halter.
Schließen Sie den Halter mit der Verstärkerkopfbühne an den Verstärker an. Danach positionieren Sie die Elektrodenhalter-Kopfstufe mit einem stabilen 3-D-Mikromanipulator. Senken Sie die Elektrode, bis die Badlösung ihre Spitze bedeckt.
Wählen Sie den Brückenmodus des Verstärkers aus und messen Sie den Elektrodenwiderstand. Stellen Sie sicher, dass der Widerstand etwa 50 Megaohm beträgt. Null den Offsetstrom und kompensieren kapazitive Transienten über die Haltepositionstaste in der Schnittspannungsklemme des Verstärkers und die Kapazitätsneutralisationstaste im Abschnitt Mikroelektrode 1 des Verstärkers.
Um das Superfusionssystem zu konstruieren, gießen Sie die Badlösung in eine geeignete Buchse und schließen Sie sie an einen Bewässerungsschlauchsatz an, wodurch die Aufnahmekammer angeschlossen wird. Verwenden Sie ein schwerkraftgetriebenes Superfusionssystem. Regulieren Sie den Durchfluss auf 0,5 Milliliter pro Sekunde.
Schließen Sie die Kammer an eine Saugvorrichtung an. Regulieren Sie das Lösungssaugsystem mit einer Vakuumpumpe so, dass das Gesamtvolumen der Aufnahmekammer nicht variiert. Um den Augenbestand eines erwachsenen Krebses zu isolieren, lösen Sie ihn mit einer feinen Schere von der Basis.
Machen Sie eine Öffnung von einem Quadratmillimeter in der dorsalen Hornhaut mit einer Rasierklinge, um auf die Netzhaut zuzugreifen. Als nächstes legen Sie den Augenstock in der Mitte der Aufnahmekammer mit der Öffnung zur Netzhaut nach oben. Halten Sie das Auge in der Dunkelheit für 20 Minuten.
Platzieren Sie die Mikroelektrode parallel zu den Augenbeständen Längsachse so, dass die Mikroelektrode zentriert ist, um auf die Netzhaut zuzugreifen. Verwenden Sie ein stereoskopisches Mikroskop, um die Geräte in der richtigen Konfiguration zu platzieren. Überwachen Sie als Nächstes den Spannungsunterschied zwischen der Referenz- und der Aufnahmeelektroden, indem Sie den Brückenmodus des Verstärkers auswählen.
Senken Sie die Elektrode in das Bad und legen Sie sie direkt über die Netzhaut. Entfernen Sie das Mikroskop und positionieren Sie die Photostimulatorlampe parallel zu den Augenbeständen Längsachse. Dann senken Sie langsam die Mikroelektrode, bis ein plötzlicher Spannungsabfall erkannt wird.
Anschließend liefern Sie einen Testlichtblitz, um das Rezeptorpotenzial des Photorezeptors aufzuzeichnen. Um geeignete Aufnahmen von lichtentlockten Strömen zu erhalten, ist es wichtig, eine gute Beeinträchtigung einer gesunden Photorezeptorzelle zu machen. Klemmen Sie bei diesem Verfahren die Spannung am gemessenen ruhenden Membranpotential der Zelle, indem Sie die Halteamplitude in der Datenerfassungssoftware auswählen.
Wählen Sie dann den DSEVC-Modus des Verstärkers aus. Wählen Sie im Modusbereich des Verstärkers die SEVC-Taste aus und schalten Sie den Hebel auf den Discont um. SEVC-Position.
Stellen Sie die Schaltrate auf 500 bis 1.000 Hertz ein, die durch die Elektrodegeschwindigkeit bestimmt wird. Danach liefern Sie einen Lichtblitz und beobachten Sie den evozierten Ionenfluss. Dann liefern Sie ein Paar Lichtimpulse und wenden Sie den zweiten Blitz nach einem gewünschten Zeitintervall an.
Digitalisieren Sie die Ströme bei 10-Kilohertz-Sampling mit der Datenerfassungssoftware und speichern Sie die Daten für die Offline-Analyse. Hier ist ein Zwei-Puls-Protokoll zu sehen. Lichtreize wurden bei null Millisekunden und 700 Millisekunden angewendet.
Diese Abbildung zeigt die Erholung von der Desensibilisierung. Hier ist Latenz-Recovery, hier ist Peak-Strom-Recovery, und hier ist die Deensitisierungzeit konstante Tau-Wiederherstellung. Die Experimente wurden zu null Stunden zirkadianer Zeit durchgeführt.
Diese Abbildung zeigt die Erholung von der Desensibilisierung als Funktion der zirkadianen Zeit. Dies ist iP-Wiederherstellung, dies ist L-Wiederherstellung, und dies ist Tau-Wiederherstellung, und dieses Diagramm zeigt die gewichteten Zeitkonstanten. Biphasische Prozesse sind mit einem Pfeil markiert.
Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn es richtig gemacht wird. Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, zu denken, für eine geringe Geräuschentwicklung und geringe Leckage Strom, Photorezeptor Beeinträchtigung zielen. Nach diesem Verfahren können andere Methoden, wie pharmakologische Assays, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie die Einbeziehung bestimmter Kanäle, Rezeptoren oder Signalwege.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Neurobiologie, um die zirkadiane Zeitabhängigkeit der elektrophysiologischen Eigenschaften von Photorezeptorzellen zu erforschen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Diesensibilisierung und Wiederherstellung des lichtaktivierten Transduktionsstroms mit der intrazellulären Aufzeichnungstechnik untersuchen können.
