이 절차의 전반적인 목표는 절연 된 눈 주에서 광수용체 세포의 세포 간 전기 기록을 사용하여, 불연속 단일 전극 전환 전압 클램프 구성을 사용하여 circadian 시간의 함수로 가재 광수용체의 둔감 및 감도 회복을 연구하는 것입니다. 이 방법은 불활성화 및 회복에 있는 광수용체의 너무 많은 전기 생리적 특성의 circadian 시간 의존성과 같은 신경생물학 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 광수용체의 전기 적 활성을 측정 할 수 있다는 것입니다.
세포를 분리하는 데 어려움에도 불구하고 세포 내 밀리유를 방해하지 않고. 이 절차를 시연하는 것은 닥터 캐롤라이나 바리가 몬토야와 아라슬리 드 라 O-Maritnez, 우리의 실험실의 동료가 될 것입니다. 세포 내 전극을 준비하려면 마이크로 피펫 풀러로 유리 모세관 튜브를 당겨 작은 개구부로 얇은 팁을 얻습니다.
다음으로, 모세혈관에 의해 2.7-대구칼륨염액으로 뽑아낸 모세관 유리를 채운 다음 파이펫의 절반을 미세 한 주입 바늘로 채웁니다. 필요한 경우 전극 파이펫을 탭하여 기포를 제거합니다. 그 후, 그 홀더에 전극을 배치합니다.
홀더를 앰프헤드 스테이지에 앰프와 연결합니다. 그 다음에, 안정적인 3차원 마이크로 조작기로 전극 홀더 헤드 스테이지를 배치합니다. 목욕 용액이 끝을 덮을 때까지 전극을 낮춥다.
증폭기의 브리지 모드를 선택하고 전극 저항을 측정합니다. 저항이 약 50 메가옴인지 확인하십시오. 앰프의 단면 전압 클램프의 유지 위치 버튼과 증폭기의 마이크로전기 1 단면의 커패시턴스 중화 버튼의 좌오프 전류를 null및 보정합니다.
슈퍼 융합 시스템을 구성하기 위해 목욕 용액을 적절한 리셉터클에 부어 관개 튜브 세트에 연결하여 녹음 챔버를 연결합니다. 중력 구동 슈퍼퓨전 시스템을 사용합니다. 유량은 초당 0.5 밀리리터로 조절합니다.
챔버를 흡입 장치에 연결합니다. 진공 펌프로 용액 흡입 시스템을 조절하여 기록 챔버의 총 부피가 변하지 않도록 한다. 성인 가재의 눈 스톡을 분리하려면 미세 한 가위로 베이스에서 분리하십시오.
망막에 접근하기 위해 면도날을 사용하여 등각막에 1 평방 밀리미터를 열어 보세요. 다음으로, 망막에 개방하여 눈스톡을 레코딩 챔버 의 중앙에 놓습니다. 20 분 동안 어둠 속에서 눈 주식을 유지합니다.
마이크로 전극을 눈 주세로 평행하게 배치하여 미세전극이 망막에 접근하는 것을 중심으로 한다. 입체 현미경을 사용하여 장치를 올바른 구성에 배치합니다. 다음으로, 증폭기의 브리지 모드를 선택하여 기준과 기록 전극 사이의 전압 차이를 모니터링한다.
전극을 욕조에 내리고 망막 바로 위에 놓습니다. 현미경을 제거하고 사진 자극기 램프를 눈 주 세로 축과 평행하게 배치합니다. 그런 다음 갑작스런 전압 강하가 감지될 때까지 마이크로 전극을 천천히 낮춥춥시게 합니다.
그 후, 광수용체의 수용체 전위를 기록하기 위해 테스트 라이트 플래시를 제공합니다. 빛 유도 전류의 적절 한 기록을 얻으려면, 건강 한 광 수용 체 세포의 좋은 장애를 만드는 것이 중요 하다. 이 절차에서 데이터 수집 소프트웨어에서 지주 진폭을 선택하여 셀의 측정된 휴식 막 전위 전압을 고정합니다.
그런 다음 증폭기의 DSEVC 모드를 선택합니다. 앰프의 모드 섹션에서 SEVC 버튼을 선택하고 레버를 디스온으로 전환합니다. SEVC 위치.
전극의 속도에 의해 결정된 대로 스위칭 속도를 500 ~ 1, 000 헤르츠로 설정합니다. 그 후, 가벼운 플래시를 전달하고 연상 이온 플럭스를 관찰한다. 그런 다음 라이트 펄스 쌍을 전달하고 원하는 시간 간격 후에 두 번째 플래시를 적용합니다.
데이터 수집 소프트웨어로 10킬로헤르츠 샘플링에서 전류를 디지털화하고 오프라인 분석을 위한 데이터를 저장합니다. 여기에 표시된 것은 2펄스 프로토콜입니다. 광 자극은 0 밀리초 및 700 밀리초에 적용되었습니다.
이 그림은 둔감에서 회복을 보여줍니다. 다음은 대기 시간 복구이며, 여기에 피크 전류 복구이며, 여기에 둔감 시간 일정한 타우 복구입니다. 실험은 0시간 주기시간에 수행되었다.
이 그림은 circadian 시간의 함수로서 둔감에서 회복을 보여줍니다. 이것은 iP 복구이며, 이것은 L 복구이며, 이것은 타우 복구이며,이 그래프는 가중 된 시간 상수를 보여줍니다. Biphasic 프로세스는 화살표로 표시됩니다.
일단 마스터되면 제대로 수행되면 이 기술은 2시간 후에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 낮은 소음과 낮은 누출 전류, 광수용체 장애를 목표로 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 약리학적 분석과 같은 다른 방법은 특정 채널, 수용체 또는 신호 경로의 참여와 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 할 수 있습니다.
개발 후, 이 기술은 광수용체 세포의 전기 생리학적 특성의 circadian 시간 의존성을 탐구하는 신경생물학의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다. 이 비디오를 시청한 후 세포내 기록 기술을 사용하여 빛 활성화 된 트랜스듀션 전류의 둔감화 및 회복을 연구하는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야합니다.
