تم تمويل هذا البحث بجائزة NIFA وزارة الزراعة عام 2015-67015-23488 لمخروط روجر. يشكر المؤلفون الدكتور رونالد فيلبس عن وصف لمعايير اختيار الأسهم الحضنة في شريط الفيديو. الأسود أحمد وكريم خليل يود أن يشكر مكتب التربية والثقافة المصرية في واشنطن العاصمة لتمويل أبحاث الدكتوراه.

الكتاب يعلن أن أي تعارض في المصالح.

وقدم بروتوكول مفصل ل microinjection أجنة سمك السلور قناة لتحقيق الضربة القاضية الجينات. الحقن بالبروتين كريسبر/Cas9 في صفار البيض هي أبسط بكثير ويوفر الوقت ولا تتطلب تدريبا مكثفا بالمقارنة مع ميكروينجيكتينج بلاستوديسك الجنين خلية واحدة، وهي تقنية شائعة لمعظم نقل الجينات والجينات التحرير مع الأس...

Microinjection أسلوب مختبرية شائعة المستخدمة لتسليم كمية صغيرة من مادة مثل الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، والبروتين، والجزيئات الكبيرة الأخرى في الخلايا أو الأجنة من خلال زجاج شعرية1. Microinjection تتم باستخدام إعداد المعدات الخاصة بما في ذلك من ميكروينجيكتور، ميكرومانيبولاتور، و مجهر2. وقد استخدمت التقنية باحثون وراثيا تعديل العديد من الكائنات الحية من خلال توليد الوراثي والجينات بالضربة القاضية، والعلاج الجيني، بهدف فهم ديناميات المكونات داخل الخلايا3،4 , 5.
سمك السلور قناة (Ictalurus punctatus) من أنواع سمك السلور الأكثر شعبية في تربية الأحياء المائية وأنشطة الصيد الترفيهي في الولايات المتحدة. هناك حاجة متزايدة لدراسة الجينوم الوظيفي في سمك السلور القناة، وتسلسل الجينوم الكامل لسمك السلور قناة يعزز فائدة التقدم الذي أحرز مؤخرا في أدوات التحرير الجينوم6،7. فهم وظيفة الجينات ليس من شأنه أن يثري البحوث التي تجري على سمك السلور، بل قد يؤدي أيضا إلى زيادة فعالية برامج التحسين الوراثي لتعزيز صناعة سمك السلور. حالما يتم تحديد الجينات الحاسمة لسمة معينة للفائدة، يمكن استخدامها لتحسين وراثيا إنتاج سمك السلور عن طريق تحرير الجينوم لتوليد الآليلات مفيدة، التحديد لهذه الآليلات، قمع الآليلات الضارة، نقل الآليلات مفيدة من خلال ترانسجينيسيس أو بعض تركيبة من هذه الخيارات. الجمع بين الجينات أفضل لمختلف الصفات المفيدة تجارياً من مختلف الأنواع في الأسماك أحد أن يحسن الإنتاجية والربحية ل عمليات إنتاج الأسماك8كثيرا.
خروج المغلوب الجينات أسلوب مباشر لدراسة وظائف الجينات في فيفو. سوف وراثة الطفرات على مستوى الحمض النووي من قبل الأجيال القادمة التي سوف تسهل دراسة آثارها في مختلف الأجيال. الجينوم مختلف أدوات التحرير تم المتقدمة بما في ذلك الزنك الإصبع نوكليسيس (زفنس)، النسخ المستجيب المنشط--مثل نوكليسيس (تالينس)، وتجمع بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة المتناوب يكرر/كريسبر-المرتبطة البروتين 9 (كريسبر/Cas9 ) نظام9،10،،من1112.
نظام كريسبر/Cas9 هو أداة قوية وفعالة التي تم استخدامها لتحرير الجينوم تسلسل الحمض النووي بما في ذلك خروج المغلوب الجينات في الأسماك إلى الجيش الملكي النيبالي تسترشد خاصة بالموقع الحمض النووي انشقاق5،13. يتألف النظام من دليل رنا (جرنة)، الذي يحدد تسلسل المستهدفة في الجينوم وإنزيم اندونوكليسي الحمض النووي، Cas9. يمكن تصميم نظام كريسبر/Cas9 لاستهداف أي تسلسل في الجينوم مع العديد من المزايا زفنس وتالينس: (1) انخفاض التكاليف الهندسية (2) أسهل ملزمة محددة (3) أكثر من دليل الحمض النووي الريبي لتسلسل المستهدفة، وتخفيض الطفرات خارج الهدف (4) يمكن استهداف سلاسل متعددة مع جرنة مختلفة في نفس الوقت (5) معدل الطفرات عالية في الجينات التي يمكن أن لا تكون المتحولة بواسطة تالينس، وتحسين الخط (6) انتقال معدل الطفرات ليصل إلى 6-fold عند زفنس وتالينس14، بالمقارنة 15،16،،من1718.
هو الأسلوب البديل الرئيسي ل microinjection انهانسر، التي تطبق فيها النبضات الكهربائية للأجنة أو الخلايا لزيادة نفاذية الغشاء وامتصاص الجزيئات البيولوجية19،20. عدة من الأسماك المحورة وراثيا تم إنشاؤها باستخدام انهانسر مثل الميداكا (Oryzias latipes)، الزرد (دانيو rerio)، سلمون شينوك (Oncorhynchus تشاويتشا)، وسمك السلور القناة، الشبوط (Sparus صربا)، و المشتركة الكارب (Cyprinus carpio)21،،من2223،24،،من2526.
وقد استخدمت انهانسر توفير البروتين بلازميد الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، و Cas9 لخروج المغلوب الجينات. في خلايا الثدييات، Cas9/جرنة بلازميد الحمض النووي، مرناً Cas9/جرنة، ومجمعات البروتين/جرنة Cas9 تم تسليمها باستخدام انهانسر وكانت المعدلات الطفرات أعلى باستخدام مجمعات البروتين/جرنة Cas9 لمعظم شروط اختبار انهانسر27. حبليات أسسيديان (سيونا إينتيستيناليس)، كانت تالينس الإعراب عن نيات اليكتروبوراتيد في البيض المخصب للحث على خروج المغلوب من جينات متعددة28. وكانت زفنس الإعراب عن نيات بلازميد اليكتروبوراتيد لضرب الهرمون في سمك السلور القناة29. ومع ذلك، بمجرد إدخال في الخلية، سوف تحتاج ثوابت بلازميد نسخها للجيش الملكي النيبالي وترجم إلى البروتينات الوظيفية قبل أن يمكن توجيهها بتسلسل الحمض النووي المطلوب، والمرجح أن تأخير وقت الطفرات microinjection من الجيش الملكي النيبالي بالمقارنة مع/ البروتين. كما يتم وضع جنين، يزيد الطفرات تأخر mosaicism المؤسسين حقن. وباﻹضافة إلى ذلك، التعبير المعدلة وراثيا غير المحتمل أن يحقق مستوى التعبير الممكنة مع microinjection، خفض كفاءة الطفرات.
كوسيلة لإدخال أدوات التحرير الجينوم في الخلايا، microinjection مزايا عديدة على مدى انهانسر. ويمكن إدخال الجينوم تحرير جزيئات موثوق في الخلايا أو الأجنة من خلال microinjection30. هناك حاجة أقل مواد الحقن. فمن السهل لتحديد كميات المواد التي تحقن. تحقيق طفرة أعلى يمكن أن تكون معدلات مع mosaicism منخفضة في الأسماك مؤسس الذي من شأنه أن يحسن نقل الخط من الطفرات و1. أقل مؤسس الأسماك تحتاج إلى تحليل لإنتاج الجيل الأول، نظراً لارتفاع معدل التحور. في انهانسر، المزيد من الأسماك مؤسس بحاجة إلى تحليل مما يزيد من التكاليف. ومع ذلك، بقاء الأجنة سلور قناة ميكروينجيكتيد أقل من اليكتروبوراتيد منها، على الرغم من أن هذا يمكن التغلب عليها عن طريق حقن الأجنة أكثر31،32. في القناة سمك السلور وبقاء الأجنة ميكروينجيكتيد صفار البيض تراوحت من 16 إلى 55%، اعتماداً على الجينات المستهدفة وجرعة البروتين جرنة/Cas932.
من الناحية الفنية تطالب microinjection العادية أجنة سمك السلور ومضيعة للوقت، ومع ذلك، بروتوكول microinjection بروتين كريسبر/Cas9 سريعة وفعالة ويرد لاجنة سمك السلور قناة. يتطلب هذا البروتوكول أقل من الوقت والخبرة منذ حل البروتين كريسبر/Cas9 يحقن صفار البيض من إحدى خلايا الأجنة. يمكن حقن مئات بويضات المخصبة في ح 1 (تقريبا الوقت اللازم لانقسام الخلية الأولى تحدث). للتحقق من البروتوكول، خرج اثنين من الجينات المتعلقة بقابلية المرض في قناة سمك السلور وعدد القتلى/انترلوكين 1 مستقبلات المجال التي تحتوي على محول جزيء (TICAM1) الجين والجين يكتين (ربل) ملزمة rhamnose. 1 تيكام تشارك في مسار الإشارات بدأها عدد القتلى مثل مستقبلات (TLR) 3. 1 تيكام كان هائلا في سمك السلور القناة، upregulated عقب التحدي البكتيرية مع إيكتالوري ادواردسيلا، بينما كان دوونريجولاتيد في سمك السلور الزرقاء، الأنواع المقاومة إيكتالوري هاء-33. ربل تلعب دوراً هاما في الإصابة المبكرة مع كولومناري فلافوباكتيريوم، المسبّب للمرض كولومناريس، حيث الحادة وسجلت upregulation قوية في سلالة كولومناريس عرضه قناة قرموط بالمقارنة مع 34من سلالة كولومناريس المقاوم.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="520">
	<tbody>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:136px;">Reproboost implant</td>
			<td style="width:115px;">Center of Marine Biotechnology</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:136px;">TRICAINE-S</td>
			<td style="width:115px;">Western Chemical. Inc.</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:136px;">Phenol red</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:99px;">P0290</td>
			<td style="width:171px;">0.5%, sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:136px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:115px;">Olympus</td>
			<td style="width:99px;">213709</td>
			<td style="width:171px;">For visualizing the eggs during microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:136px;">Microinjector</td>
			<td style="width:115px;">ASI-Applied Scientific Instrumentation&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Model MPPI-3</td>
			<td style="width:171px;">For the delivery of the injection material into the embryos</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:136px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:115px;">ASI-Applied Scientific Instrumentation&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Model MM33&#160;</td>
			<td style="width:171px;">For holding and controlling the movement of the injection needle.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:136px;">Eppendorf Microloader</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:99px;">5242956.003</td>
			<td style="width:171px;">For loading injection solution into microinjection needles.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:136px;">Vertical needle puller</td>
			<td style="width:115px;">David Kopf Instruments</td>
			<td style="width:99px;">Model 720</td>
			<td style="width:171px;">For pulling microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:136px;">Cas9 protein</td>
			<td style="width:115px;">PNA Bio Inc.&#160;</td>
			<td style="width:99px;">CP01</td>
			<td style="width:171px;">Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:136px;">Expand High FidelityPLUS PCR System</td>
			<td style="width:115px;">&#160;Roche Diagnostics, USA</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:136px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:115px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:136px;">Petri dish</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:99px;">25384-302</td>
			<td style="width:171px;">For holding the embryos during the microinjection.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:136px;">Crisco</td>
			<td style="width:115px;">The J.M. Smucker Company</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:136px;">Holtfreter`s solution</td>
			<td style="width:115px;">Home Made</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:136px;">Doxycycline hyclate USP (monohydrate)</td>
			<td style="width:115px;">Letco Medical</td>
			<td style="width:99px;">690904</td>
			<td style="width:171px;">Antibiotic added to Holtfreter&#39;s solution to 10 ppm to prevent bacterial infections.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of crispr/cas9 protein into channel catfish, ictalurus punctatus, embryos for gene editing

تم تسلسل الجينوم الكامل من سمك السلور القناة، Ictalurus punctatus،، مما يؤدي إلى المزيد من الفرص لدراسة وظيفة الجينات سلور قناة. وقد استخدمت الجينات بالضربة القاضية لدراسة هذه وظائف الجينات في فيفو. بانتظام مجمع إينتيرسباسيد في البروتين قصيرة المتناوب يكرر/كريسبر المرتبطة 9 (كريسبر/Cas9) نظام أداة قوية تستخدم لتحرير الجينوم تسلسل الحمض النووي لتغيير وظيفة الجينات. بينما كان النهج التقليدي لإدخال مرناً كريسبر/Cas9 في الأجنة خلية مفردة من خلال microinjection، وهذا يمكن أن يكون عملية بطيئة وغير فعالة في سمك السلور. ويرد هنا، بروتوكول مفصل ل microinjection أجنة سمك السلور قناة مع البروتين كريسبر/Cas9. بإيجاز، كانت البيض والحيوانات المنوية إخصاب المجمعة ومصطنعة ثم يقوم. ونقل البويضات المخصبة إلى طبق بتري يحتوي على الحل هولتفريتير. معايرة حجم الحقن وثم دليل استهداف الكشف/Cas9 تم ميكروينجيكتيد عدد القتلى/انترلوكين 1 مستقبلات المحتوية على المجال محول جزيء (تيكام 1) الجينات وملزمة rhamnose يكتين (ربل) الجينات في صفار البيض الأجنة خلية واحدة. خروج المغلوب الجينات كانت ناجحة حيث تم تأكيد إينديلس بتسلسل الحمض النووي. شملت فراميشيفت التعديلات تسلسل البروتين المتوقعة بسبب هذه الطفرات واقتطاع البروتين بسبب codons توقف سابق لأوانه.

لإثبات فعالية البروتوكول microinjection، كانت ميكروينجيكتيد جرناس مصممة لاستهداف قناة سمك السلور مستقبلات عدد القتلى/انترلوكين 1 التي تحتوي على المجال محول جزيء (TICAM1) الجينات وملزمة rhamnose يكتين (ربل) الجينات.
تيكام 1 تسلسل الحمض النوو?...

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing at JoVE.com

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

ويقدم بروتوكول microinjection بسيطة وفعالة لتحرير الجينات في أجنة سمك السلور قناة باستخدام نظام كريسبر/Cas9. في هذا البروتوكول، دليل الكشف وكانت ميكروينجيكتيد Cas9 البروتين في صفار البيض الأجنة خلية واحدة. وقد تم التحقق من صحة هذا البروتوكول بانقطاع قناة سمك السلور اثنين من الجينات المتصلة بجهاز المناعة.

Microinjection كريسبر/Cas9 البروتين في أجنة سمك السلور القناة، Ictalurus punctatus، لتحرير الجينات

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

microinjection-crisprcas9-protein-into-channel-catfish-ictalurus

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Statistics

Genetics

Unit 1

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Control Charts

SCIENTISTS IN ACTION

14.8K Views.  Auburn University. ويقدم بروتوكول microinjection بسيطة وفعالة لتحرير الجينات في أجنة سمك السلور قناة باستخدام نظام كريسبر/Cas9. في هذا البروتوكول، دليل الكشف وكانت ميكروينجيكتيد Cas9 البروتين في صفار البيض الأجنة خلية واحدة. وقد تم التحقق من صحة هذا البروتوكول بانقطاع قناة سمك السلور اثنين...

Video: Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the identification and verification of a drug resistance gene in the Apicomplexan parasite Toxoplasma gondii, the method of Quantitative Trait Locus (QTL) mapping using a Whole Genome Sequence (WGS) -based genetic map and the method of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 -based gene editing. The approach of QTL mapping allows one to test if there is a correlation between a genomic region(s) and a phenotype. Two datasets are required to run a QTL scan, a genetic map based on the progeny of a recombinant cross and a quantifiable phenotype assessed in each of the progeny of that cross. These datasets are then formatted to be compatible with R/qtl software that generates a QTL scan to identify significant loci correlated with the phenotype. Although this can greatly narrow the search window of possible candidates, QTLs span regions containing a number of genes from which the causal gene needs to be identified. Having WGS of the progeny was critical to identify the causal drug resistance mutation at the gene level. Once identified, the candidate mutation can be verified by genetic manipulation of drug sensitive parasites. The most facile and efficient method to genetically modify T. gondii is the CRISPR/Cas9 system. This system comprised of just 2 components both encoded on a single plasmid, a single guide RNA (gRNA) containing a 20 bp sequence complementary to the genomic target and the Cas9 endonuclease that generates a double-strand DNA break (DSB) at the target, repair of which allows for insertion or deletion of sequences around the break site. This article provides detailed protocols to use CRISPR/Cas9 based genome editing tools to verify the gene responsible for sinefungin resistance and to construct transgenic parasites.

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Details are presented on how QTL mapping with a whole genome sequence based genetic map can be used to identify a drug resistance gene in Toxoplasma gondii and how this can be verified with the CRISPR/Cas9 system that efficiently edits a genomic target, in this case the drug resistance gene.

كتل رسم الخرائط و كريسبر / Cas9 تحرير لتحديد الجينات المقاومة للمخدرات في<em&gt; التوكسوبلازما غونديي</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide RNA (sgRNA) that confers specificity, the Cas9 protein cleaves both DNA strands at the targeted locus. The DNA break can trigger either non-homologous end joining (NHEJ) or homology directed repair (HDR). NHEJ can introduce small deletions or insertions which lead to frame-shift mutations, while HDR allows for larger and more precise perturbations. Here, we present protocols for generating knockout cell lines by coupling established CRISPR/Cas9 methods with two options for downstream selection/screening. The NHEJ approach uses a single sgRNA cut site and selection-independent screening, where protein production is assessed by dot immunoblot in a high-throughput manner. The HDR approach uses two sgRNA cut sites that span the gene of interest. Together with a provided HDR template, this method can achieve deletion of tens of kb, aided by the inserted selectable resistance marker. The appropriate applications and advantages of each method are discussed.

Recent advances in the ability to genetically manipulate somatic cell lines hold great potential for basic and applied research. Here, we present two approaches for CRISPR/Cas9 generated knockout production and screening in mammalian cell lines, with and without the use of selectable markers.

جيل يعتمد على الاختيار ومستقل من كريسبر / كاس 9 بوساطة جين نوكوتس في خلايا الثدييات

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

منهجية موحدة لدراسة المحدثة للطفرات في الموقع كدالة لإصلاح نقطة تحور تحفزها كريسبر/Cas9 وسودن في الخلايا البشرية

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

تعطيل الجينات ذات كفاءة عالية من الخلايا السلف مورين والبشرية المكونة للدم قبل كريسبر/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical regions, is caused by infection with Plasmodium parasites. The development of more effective drugs to combat malaria can be accelerated by improving our understanding of the biology of this complex parasite. Genetic manipulation of these parasites is key to understanding their biology; however, historically the genome of P. falciparum has been difficult to manipulate. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been utilized in malaria parasites, allowing for easier protein tagging, generation of conditional protein knockdowns, and deletion of genes. CRISPR/Cas9 genome editing has proven to be a powerful tool for advancing the field of malaria research. Here, we describe a CRISPR/Cas9 method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in P. falciparum. This method is highly adaptable to other types of genetic manipulations, including protein tagging and gene knockouts.

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

We describe a method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in Plasmodium falciparum using CRISPR/Cas9 genome editing.

"جعل طفرات مشروطة طفيل الملاريا البشرية" المنجلية "تحرير الجينات" كريسبر/Cas9

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

البروتين الذاتية في الإنسان التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent باستخدام كريسبر/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of CRISPR/Cas9 elements into the target cells by transfection is a prerequisite for efficient gene editing. This protocol demonstrates that tube electroporation (TE) machine-mediated delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP), along with single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor templates to different types of mammalian cells, leads to robust precise gene editing events. First, TE was applied to deliver CRISPR/Cas9 RNP and ssODNs to induce disease-causing mutations in the interleukin 2 receptor subunit gamma (IL2RG) gene and sepiapterin reductase (SPR) gene in rabbit fibroblast cells. Precise mutation rates of 3.57%-20% were achieved as determined by bacterial TA cloning sequencing. The same strategy was then used in human iPSCs on several clinically relevant genes including epidermal growth factor receptor (EGFR), myosin binding protein C, cardiac (Mybpc3), and hemoglobin subunit beta (HBB). Consistently, highly precise mutation rates were achieved (11.65%-37.92%) as determined by deep sequencing (DeepSeq). The present work demonstrates that tube electroporation of CRISPR/Cas9 RNP represents an efficient transfection protocol for gene editing in mammalian cells.

Presented here is a protocol for efficient CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated gene editing in mammalian cells using tube electroporation.

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein بوساطة تحرير الجينات الدقيقة عن طريق أنبوب الكهربائي

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target against T. cruzi, it is important to validate the essentiality of the target gene in the mammalian stage of the parasite, the amastigote. Amastigotes of T. cruzi replicate inside the host cell; thus, it is difficult to conduct a knockout experiment without going through other developmental stages. Recently, our group reported a growth condition in which the amastigote can replicate axenically for up to 10 days without losing its amastigote-like properties. By using this temporal axenic amastigote culture, we successfully introduced gRNAs directly into the Cas9-expressing amastigote to cause gene knockouts and analyzed their phenotypes exclusively in the amastigote stage. In this report, we describe a detailed protocol to produce in vitro derived extracellular amastigotes, and to utilize the axenic culture in a CRISPR/Cas9-mediated knockout experiment. The growth phenotype of knockout amastigotes can be evaluated either by cell counts of the axenic culture, or by replication of intracellular amastigote after host cell invasion. This method bypasses the parasite stage differentiation normally involved in producing a transgenic or a knockout amastigote. Utilization of the temporal axenic amastigote culture has the potential to expand the experimental freedom of stage-specific studies in T. cruzi.

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Here, we describe a protocol to introduce a gene knockout into the extracellular amastigote of Trypanosoma cruzi, using the CRISPR/Cas9 system. The growth phenotype can be followed up either by cell counting of axenic amastigote culture or by proliferation of intracellular amastigotes after host cell invasion.

إدخال الجين بالضربة القاضية مباشرة في مرحلة Amastigote من التريبانوسوما كروزي باستخدام نظام CRISPR/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

CRISPR-Cas9-بوساطة الجينوم التحرير في الأحرف ال الخيطية هانتييلا omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to visceral pathology. Deciphering the nature of the vector/parasite interactions is of primary importance for better understanding of Leishmania transmission to their hosts. Among the parameters controlling the sand fly vector competence (i.e. their ability to carry and transmit pathogens), parameters intrinsic to these insects were shown to play a key role. Insect immune response, for example, impacts sand fly vector competence to Leishmania. The study of such parameters has been limited by the lack of methods of gene expression modification adapted for use in these non-model organisms. Gene downregulation by small interfering RNA (siRNA) is possible, but in addition to being technically challenging, the silencing leads to only a partial loss of function, which cannot be transmitted from generation to generation. Targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 technology was recently adapted to the Phlebotomus papatasi sand fly. This technique leads to the generation of transmissible mutations in a specifically chosen locus, allowing to study the genes of interest. The CRISPR/Cas9 system relies on the induction of targeted double-strand DNA breaks, later repaired by either Non-Homologous End Joining (NHEJ) or by Homology Driven Repair (HDR). NHEJ consists of a simple closure of the break and frequently leads to small insertion/deletion events. In contrast, HDR uses the presence of a donor DNA molecule sharing homology with the target DNA as a template for repair. Here, we present a sand fly embryo microinjection method for targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 using NHEJ, which is the only genome modification technique adapted to sand fly vectors to date.

Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

This protocol details the steps of CRISPR/Cas9 targeted mutagenesis in sand flies: embryo collection, injection, insect rearing, and identification as well as selection of mutations of interest.

ذبابة الرمل (Phlebotomus باباتاسي) الجنين الميكروبيكشن ل CRISPR/Cas9 موتاجينيسيس

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...