يوفر بروتوكولنا مسارا لكل من التكامل الدقيق والكشف البصري البسيط عن تعديلات كريسبر، بالإضافة إلى مثال على التنميط الظاهري بعد التحرير. الميزة الرئيسية لهذا النهج هي سهولة اكتشاف تعديلات كريسبر ، مما يسمح بتحديد فعال ومبسط للتعديلات الناجحة. يسمح هذا النهج بتوليد وتوصيف بسيط للمتغيرات المرتبطة بالأمراض في الزرد.
هنا ، نحن نفحص متلازمة فترة QT الطويلة. من الممكن بعد ذلك استكشاف دراسات المتابعة حول العلاجات الصيدلانية. ابدأ بتصميم دليلين sgRNA لاستئصال تسلسل الموقع المستهدف عن طريق تحديد أورثولوج الزرد للجين محل الاهتمام.
استخدم Ensembl لتحديد موقع الهدف داخل تسلسل الجينات محل الاهتمام ، بما في ذلك تسلسل الكيلوقاعدة الجانبي المستخدم في صنع القالب. استخدم أداة برمجية للتصميم مثل CRISPOR وحدد أنواع Danio rerio وإنزيم Cas. بالنسبة لنهج sgRNA ، اختر sgRNA واحدا قبل exon المستهدف و sgRNA ثانيا داخل المصب المباشر intron.
تأكد من أن sgRNAs المحددة لها خصوصية عالية وربط منخفض متوقع خارج الهدف. استخدم تصنيفات كريسبر لتحديد الأدلة ذات الحد الأدنى من الربط خارج الهدف. حدد الآن المواقع المحتملة الأكثر احتمالا خارج الهدف للتنميط الجيني لتسلسل سانجر القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل.
بعد اختيار اثنين من sgRNAs ، احصل على المكمل العكسي لكل منهما ، واثنين من oligos التكميلية التي تسبق الطفرة واثنين من oligos التكميلية في اتجاه مجرى الطفرة. أضف مواقع تقييد متوافقة على كل oligo لدمج الدليل في البلازميد المختار. لدمج تسلسلات الدليل المحددة في بلازميد DR274 ، قم بإنشاء نتوء باستخدام موقع تقييد BSA1 خمسة رئيسي وهندسة مواقع التعرف على BSA1 في الأطراف الخمسة الرئيسية للأدلة.
بعد ذلك ، صمم القالب الخارجي ل HDR في الزرد عن طريق اختيار جزأين متتاليين يحيطان بجين مراسل YFP الوريدي M الموجود في بلازميد PKHR5. قسم القالب إلى جزأين لإدراجه على جانبي جين مراسل YFP الوريدي M. تأكد من أن موقع الانقسام في intron لتجنب قطع تسلسل الترميز.
دمج جميع التعديلات المطلوبة المذكورة في المخطوطة لتسهيل الاستنساخ في بلازميد PKHR5. حقن الأجنة في مرحلة الخلية الواحدة في حوالي 40 دقيقة بعد الإخصاب. بعد ثلاثة أيام من الإخصاب ، تخدير يرقة الزرد عن طريق نقلها إلى طبق بتري 25 ملم يحتوي على 0.3٪ MS222 حتى تفقد رد فعلها الذاتي.
بمجرد التخدير ، انقل اليرقة إلى بئر صفيحة مكونة من 24 بئرا. باستخدام مجهر قادر على اكتشاف GFP أو YFP ، قم بفحص مضان جين المراسل في عيون اليرقة. بعد التقاط صور اليرقة ، قم بتوثيق وجود أو عدم وجود التعبير الجيني للمراسل.
لتأكيد التحرير الجيني الدقيق والدقيق ل HDR ، قم بإجراء التنميط الجيني عن طريق تخدير اليرقة أولا بعد ثلاثة أيام من الإخصاب كما هو موضح سابقا وعزل الحمض النووي الجينومي من مشبك الذيل باستخدام طريقة hotshot. أضف مشبك الذيل المستأصل إلى 15 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 25 ملليمولار واحتضنه 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، ثم تحييده ب 1.5 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك تريس. جهاز طرد مركزي بمعدل 13،800 مرة G لمدة 30 ثانية ، ويحتفظ بالمادة الطافية التي تحتوي على الحمض النووي الجينومي المستخرج.
استعادة اليرقة في وسائط E3 وإعادتها إلى نظام الإسكان إذا كان المقصود إجراء مزيد من الدراسة. باستخدام الحمض النووي الجينومي المستخرج كقالب ، قم بإجراء تسلسل سانجر القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل للمواقع المستهدفة والمحتملة خارج الهدف. تأكد من أن تصميم التمهيدي المستهدف يلتقط موقع الطفرة وأقرب موقع ربط sgRNA.
صمم برايمر تسلسل منفصل للكشف عن الانتقال من ذراع التماثل المدرج والجين المستهدف لتأكيد الاندماج في الجين محل الاهتمام. تصميم الاشعال لتسلسل أفضل ثلاثة مواقع محتملة خارج الهدف. تجميع التنميط الجيني داخل وخارج الهدف ، ومعدل ضربات القلب ، وأبعاد التامور ، والتنميط الظاهري لتخطيط القلب ، وبيانات الجينات التي يمكن التعرف عليها لكل سمكة زرد.
لوحظ التعبير الجيني للمراسل الوريدي YFP M في الجزر ، حيث عمل كمراسل إيجابي لتكامل القالب الناجح. تم العثور على الأسماك الإيجابية لجين المراسل لديها التعديل الدقيق G2A الذي يقدم متغير R56Q في ZKCNH6A. يظهر هنا قياس أبعاد التامور كنسبة من منطقة العين.
لوحظ اتجاه بطء القلب مع زيادة وذمة التامور المرتبطة باضطرابات إعادة استقطاب القلب في أسماك الزرد في اليرقات المحررة بجين R56Q. يظهر هنا تسجيل تخطيط القلب من قلب يرقة الزرد بعد ثلاثة أيام من الإخصاب. الجانب الأكثر أهمية في هذا النهج هو تصميم الدليل ، كما هو الحال غالبا في إجراءات كريسبر.
الأدلة الفعالة ضرورية لتعديلات كريسبر الناجحة. يمكن اتباع طرق CRISPR البديلة مما يسمح بمزيد من الدقة أو الوظائف الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إدخال جينات كبيرة مثل مجمع التحرير الرئيسي الذي يوفر نظام تحرير مستحث في الجسم الحي.
