يشكر المؤلفون الدكتور Minghan تونغ وكاتو س. يرجى توفير الكواشف والفئران. ونشكر أعضاء المختبر زو لإجراء مناقشات مفيدة. هذا العمل كان تدعمها جزئيا في المنح من 973 برنامج من الوزارة الصينية للعلوم والتكنولوجيا (معظم) [2014CB964704 و 2015CB964503]، "برنامج البحوث السريرية" لمستشفى الشعب التاسع، "شانغهاي جياو تونغ جامعة كلية الطب". شكرا لمساعدة "المرافق الأساسية" لبيولوجيا الخلايا والمرافق الأساسية "علم الأحياء الكيميائية"، والأكاديمية الصينية للعلوم في مركز للتفوق في مجال العلوم الخلية الجزيئية، معهد شانغهاي للكيمياء الحيوية وبيولوجيا الخلايا، الأكاديمية الصينية للعلوم.

جميع الإجراءات المتصلة بالحيوانات أجريت وفقا للبروتوكول الذي وافق عليه "الفريق الإداري ستانفورد" في العناية بالحيوانات المختبرية (أبلاك) ووافقت عليها بالعناية بالحيوان واستخدام اللجنة لمعهد شانغهاي للكيمياء الحيوية وخلية علم الأحياء.
1-إعداد
<ol><li>توليد اوستيوكلاست محددة رابتور الحذف الفئران (رابتورfl/فلوريدا؛ كتسك-لجنة المساواة العرقية، الآخرة الرابكتسك) قبل التزاوج فئران رابتورfl/fl مع الفئران كتسك-لجنة المساواة العرقية . استخدام الفئران رابتورfl/fl كعنصر التحكم بالوزن في هذه الدراسة.</li>
	<li>تحتوي حاوية مع الجليد للحفاظ على العظام معزولة.</li>
	<li>
تعد الثقافة المتوسطة.
	<ol>
<li>إعداد متوسطة الثقافة α-الفنزويلية باستكمال الحد الأدنى المتوسط أساسي ألفا (α-MEM) مع البنسلين والستربتوميسين، 1 x الجلوتامين ومصل العجل الجنين 10%.</li>
		<li>إعداد نخاع العظام بلعم التعريفي المتوسط تتألف من 50 مل المتوسطة α-الفنزويلية والخدمات القطرية م في 20 نانوغرام/مليلتر.</li>
		<li>إعداد اوستيوكلاست التعريفي المتوسط تتألف من M-CSF ورانكل في 20 نانوغرام/ملليلتر، على التوالي، في 50 مل متوسطة α-الفنزويلية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
إعداد المخازن المؤقتة التالية قبل تلطيخ فخ.
	<ol>
<li>إعداد حل تتكون من 6.5 مل الأسيتون، 2.5 مل من سترات الحل و 0.8 مل من محلول الفورمالديهايد (المجلد/المجلد) 37 في المائة.</li>
		<li>إعداد فخ تلطيخ الحل.<ol>
<li>بريوارم المياه إلى 37 درجة مئوية.</li>
			<li>إضافة 100 ميليلتر العقيق سريع GBC قاعدة الحل و 100 ميليلتر من حل نتريت الصوديوم في microtube 1.5 مل ومزيج من انعكاس لطيف لإجازة س. 30 المخلوط الوقوف لمدة دقيقة 2.</li>
			<li>بريوارم 9 مل مياه إلى 37 درجة مئوية. إضافة 200 ميليلتر ديازوتيزيد سريعة العقيق GBC الحل الأساسي من الخطوة 1.4.2.2، 100 ميليلتر نافثول AS-ثنائي فوسفات الحل و 400 ميليلتر من حل خلات 200 ميليلتر من طرطرات الحل.</li>
			<li>تبقى في فخ تلطيخ حل الخليط في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
إعداد المخزن المؤقت التالية قبل مصيدة النشاط الكمي للثقافة المتوسطة.
	<ol>
<li>إعداد طرطرات المخزن المؤقت (50 مل): 2 مل حمض الطرطير ل م 0.33، مل 48 من طرطرات الصوديوم 0.33 متر مائي يذوي. قم بضبط قيمة pH إلى 4.9.</li>
		<li>تحضير 4-نيتروفينيل فوسفات ثنائي الصوديوم (بنب) المخزن المؤقت (200 مل): 1.502 ز جليكاين، 41 ملغ مجكل2و 27.2 ملليغرام من زنكل2و 180 مل من المياه. ضبط قيمة pH إلى 10.4 مع 3 م هيدروكسيد الصوديوم والحجم إلى 200 مل مع المياه.</li>
		<li>إعداد المخزن المؤقت بنب مع الركازة الفوسفاتيز (للوحة 96-بئر واحدة): 49.37 مغ من الركازة الفوسفاتيز وميليلتر 175 من المخزن المؤقت بنب الخطوة 1.5.2.</li>
		<li>تعد الركيزة المخزن المؤقت (9 مل/96-بئر لوحة): 6.24 مل من المياه، ميكروليتر 360 من خلات الحل، و 2.4 مل طرطرات المخزن المؤقت. مزيج من دوامة ويسخن عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.</li>
		<li>إضافة ميكروليتر 90 من المخزن المؤقت بنب مع الفوسفاتيز substrate(1.5.3) إلى 9 مل من الركازة مسخن buffer(1.5.4) لجعل الخليط الركيزة ودوامه لمدة 10 ق.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2-تشريح (اليوم-1)
<ol><li>Euthanize 3 واحد شهرا الإناث WT و الرابكتسك الفئران CO2 بشكل منفصل. أداء استنشاق أول أكسيد الكربون2 مع المعدات المناسبة من الموظفين المدربين.</li>
	<li>تزج الفئران 6 في كوب مع 100 مل من 75 ٪ الإيثانول (المجلد/المجلد) لمدة 5 دقائق منع التلوث البكتيري ومن ثم ضع على لوح تشريح في موقف ضعيف. إجراء شق في الأعلى من الساق عمودياً وتشريح الجلد على طول أطرافهم هند مع مقص العيون.</li>
	<li>قطع في الرباط المفصلي الورك مع المقص وانخلاع أطرافه هند من الجذع.</li>
	<li>قطع في الرباط مفصلي الركبة وتنأى بعناية في الساق والفخذ من الركبة. إزالة الأنسجة اللينة بلطف مع المقص.</li>
	<li>ضع كل العظام الوراثي واحد في واحد بالماوس في كل من صفيحة ستة آبار جيدا مع 2 مل من α-الفنزويلية على الجليد. ملاحظة: للحفاظ على بقاء الخلية، ينبغي إبقاء العظام في هذه الظروف لأقل من 1 ح.</li>
</ol>3-عزل (اليوم-1)
<ol><li>سد بئر واحدة من صفيحة ستة-جيدا مع 75% إيثانول (3 مل) والآبار الأخرى 5 مع α-الفنزويلية المتوسطة (3 مل).</li>
	<li>وضع جميع عظام الوراثي واحد في الغسيل الإيثانول للعظام 15 ق ويغسل 5 مرات مع المتوسطة α-الفنزويلية لمدة 10 ثانية في كل مرة.</li>
	<li>قطع ابيفيسيس مع مقص وإدراج إبرة حقنه 0.45 ملم في تجويف وتدفق نخاع العظام خارجاً مع المتوسطة α-الفنزويلية في أنبوب 50 مل أجهزة الطرد مركزي.</li>
	<li>مسح تجويف العظام باستخدام نفس الأسلوب من الطرف الآخر من العظام. كرر مرتين على الأقل يغسل تجويف العظام جيدا حتى العظم شاحب.</li>
	<li>الطرد المركزي نخاع العظام للحصول على بيليه خلية في 800 x ز و 4 درجات مئوية عن أدنى 5 Aspirate المادة طافية.</li>
	<li>أضف 3 مل من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء في أنبوب الطرد المركزي وماصة بلطف ريسوسبيند نخاع العظام. الاحتفاظ بالانبوب الطرد المركزي على الجليد لمدة 8 دقائق خلايا الدم الحمراء.</li>
	<li>إضافة 6 مل متوسطة α-الفنزويلية في أنبوب الطرد المركزي لإيقاف تحلل الخلية. الطرد المركزي في 500 x ز و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ونضح المادة طافية.</li>
	<li>ريسوسبيند في 3 مل من α-الفنزويلية الثقافة المتوسطة ووضع الخلايا في لوحة ستة آبار (ماوس واحدة عموما كل بئر).</li>
	<li>احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO 5% بين عشية وضحاها.</li>
</ol>4-الطلاء (يوم 0)
<ol><li>نقل المادة طافية إلى أنبوب الطرد مركزي 15 مل لجمع الخلايا فاتحة في صباح اليوم التالي.</li>
	<li>الطرد المركزي في 800 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ونضح المادة طافية.</li>
	<li>ريسوسبيند في 4 مل من α-الفنزويلية الثقافة المتوسطة.</li>
	<li>تأخذ 20 ميليلتر من الحل خلية وتخلط مع 20 ميليلتر تريبان الأزرق. إضافة 10 ميليلتر من المخلوط إلى قاعة فرز الأصوات والحصول على عدد خلايا كل مل من محلول.</li>
	<li>إضافة وحدة تخزين مناسبة من α-الفنزويلية الثقافة المتوسطة للحصول على حل خلية من خلايا/مل 500,000.</li>
	<li>إضافة 500 ميليلتر و 50 ميليلتر من نخاع العظام بلعم التعريفي المتوسطة في كل بئر لوحة 24-جيدا ولوحة 96، حسنا، على التوالي.</li>
	<li>إضافة 500 ميليلتر و 50 ميليلتر من حل الخلية في كل بئر لوحة 24-جيدا ولوحة 96، حسنا، على التوالي.</li>
	<li>احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO 5% لمدة 3 أيام.</li>
</ol>5-التمايز (3-7 أيام)
<ol><li>ثلاثة أيام بعد الطلاء، جمع 50 ميليلتر المتوسطة من كل بئر من 96-جيدا--اللوحة وتجميد في-20 درجة مئوية، وثم نضح المتوسطة المتبقية.</li>
	<li>أضف 1 مل و 100 ميليلتر اوستيوكلاست التعريفي المتوسطة في كل بئر من صفيحة 24-جيدا وطبق 96، حسنا، على التوالي.</li>
	<li>احتضان في 37 درجة مئوية لمدة يومين.</li>
	<li>جمع 50 ميليلتر من المتوسطة من كل بئر ونضح المتوسطة المتبقية.</li>
	<li>إضافة اوستيوكلاست التعريفي المتوسطة في كل بئر.</li>
	<li>احتضان في 37 درجة مئوية لمدة يوم واحد. ملاحظة: عند هذه النقطة من الوقت، ينبغي أن ينظر الآكلة الكبيرة، مولتينوكليتيد تحت مجهر مقلوب (الشكل 2A).</li>
	<li>إذا لم تعتبر الآكلة، تغيير المتوسطة التعريفي اوستيوكلاست ومراقبة يومية حتى تعتبر الآكلة.</li>
	<li>جمع 50 ميليلتر من المتوسطة من كل بئر من لوحة 96-جيدا بعد أن شكلت الآكلة.</li>
</ol>6-طرطرات تلطيخ مقاومة حمض الفوسفاتيز (TRAP)
ملاحظة: قد تكون الآكلة ناضجة موجودة بعد 6-7 أيام في المختبر الثقافة (الخطوة 4).
<ol><li>نضح متوسطة ويغسل 3 مرات بلطف مع 1 x PBS.</li>
	<li>إصلاح الخلايا في كل من لوحة 96-جيدا جيدا مع 100 ميليلتر من حل لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>بعد التثبيت، نضح في الحل وتغسل بلطف 3 مرات بالمياه بريوارميد إلى 37 درجة مئوية. نضح المياه.</li>
	<li>إضافة 100 ميليلتر من فخ وصمة عار في كل من لوحة 96-جيدا جيدا ووضع اللوحة في حاضنة في 37 درجة مئوية و 30 دقيقة ودرع من الضوء.</li>
	<li>بعد تلطيخ، نضح وصمة عار فخ واغسل 3 مرات بلطف مع المياه.</li>
	<li>صورة الآكلة استخدام مجهر مقلوب في 40 X التكبير.</li>
</ol>7-فخ النشاط الكمي للثقافة المتوسطة
<ol><li>جمع 30 ميليلتر الثقافة طافية من كل بئر من لوحة 96-جيدا من الخطوة 5-1، 5.4 و 5.8؛ استخدام 30 ميليلتر من غير مثقف اوستيوكلاست التعريفي المتوسطة كعنصر سلبي. وضع العينات في صفيحة 96-بئر جديدة.</li>
	<li>إضافة ميكروليتر 90 من الركازة mixture(1.5.5) في كل من لوحة 96-جيدا جيدا.</li>
	<li>ضع اللوحة في حاضنة في 37 درجة مئوية ح 1 ودرع من الضوء.</li>
	<li>وقف رد الفعل بإضافة 50 ميليلتر من هيدروكسيد الصوديوم م 3 في كل من لوحة 96-جيدا جيدا.</li>
	<li>قياس ثيبسوربانسي في الطول الموجي 405 نانومتر.</li>
</ol>8-الغربية النشاف
ملاحظة: بعد 6-7 أيام للثقافة في المختبر في لوحة 24-جيدا، يجب أن تكون الآكلة ناضجة مرئية.
<ol><li>نضح المتوسطة.</li>
	<li>قبل تبريده يغسل برفق مع 1 × برنامج تلفزيوني 3 مرات.</li>
	<li>نضح PBS.</li>
	<li>إضافة 100 ميليلتر من 1 × الحزب الديمقراطي الصربي تحلل العازلة التي تحتوي على مبطلات المانع كوكتيل.</li>
	<li>ليساتيس الحرارة عند 105 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وأجهزة الطرد المركزي في 000 12 × ز و 4 درجات مئوية للحد الأدنى 10 جمع سوبيرناتانتس التي تحتوي على بروتينات.</li>
	<li>فصل في ليساتيس الذي يحتوي على 30 ميكروغرام من البروتين بنسبة 10 في المائة الحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة11 وثم نقل إلى غشاء فلوريد (PVDF) الفينيليدن.</li>
	<li>كتلة الأغشية مع الحليب الخالي 5% لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>احتضان الأغشية مع رابتور المضادة، المضادة-P-S6، S6 مكافحة، مكافحة-β-أكتين في إضعاف 1:1,000 في اللبن الخالي 5% في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.</li>
	<li>غسل الأغشية مع "تريس مخزنة المالحة" مع توين-20 (تبسة) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>كرر الخطوة 8.9 مرتين.</li>
	<li>احتضان الأغشية مع الفجل البيروكسيديز (HRP)-مترافق الأجسام المضادة مفتش الماوس المضادة أو أرنب في إضعاف 1:5,000 في 5% لبن الخالي من أجل ح 1 في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>غسل الأغشية 3 مرات مع تبسة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>للكشف عن تشيميلومينيسسينت، إضافة الركازة HRP تشيميلومينيسسينت الغربية في الأغشية واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. استنزاف الركيزة الزائدة وفضح البقع لفيلم الأشعة السينية.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).</li><li>Feng, X., McDonald, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorders+of+bone+remodeling.">Disorders of bone remodeling.</a> Annu Rev Pathol. 6, 121-145 (2011).</li><li>Boyce, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+osteoclast+biology+reveal+potential+new+drug+targets+and+new+roles+for+osteoclasts.">Advances in osteoclast biology reveal potential new drug targets and new roles for osteoclasts.</a> J Bone Miner Res. 28 (4), 711-722 (2013).</li><li>Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., McManus, L. M., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+osteoclast-like+cells+and+their+progenitors+in+cultures+of+feline+marrow+mononuclear+cells.">Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells.</a> J Cell Biol. 99 (2), 471-480 (1984).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93 (2), 165-176 (1998).</li><li>Wong, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRANCE+is+a+novel+ligand+of+the+tumor+necrosis+factor+receptor+family+that+activates+c-Jun+N-terminal+kinase+in+T+cells.">TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in T cells.</a> J Biol Chem. 272 (40), 25190-25194 (1997).</li><li>Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR:+from+growth+signal+integration+to+cancer,+diabetes+and+ageing.">mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (1), 21-35 (2011).</li><li>Bhaskar, P. T., Hay, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+TORCs+and+Akt.">The two TORCs and Akt.</a> Dev Cell. 12 (4), 487-502 (2007).</li><li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Regulatory-associated+Protein+of+mTOR+(Raptor)/Mammalian+Target+of+Rapamycin+Complex+1+(mTORC1)+Signaling+in+Osteoclasts+Increases+Bone+Mass+by+Inhibiting+Osteoclast+Differentiation+in+Mice.">Inactivation of Regulatory-associated Protein of mTOR (Raptor)/Mammalian Target of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) Signaling in Osteoclasts Increases Bone Mass by Inhibiting Osteoclast Differentiation in Mice.</a> J Biol Chem. 292 (1), 196-204 (2017).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+culture+and+resorption+assays.">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).</li><li>Tevlin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+derivation+from+mouse+bone+marrow.">Osteoclast derivation from mouse bone marrow.</a> J Vis Exp. (93), e52056 (2014).</li><li>Xing, L., Boyce, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANKL-based+osteoclastogenic+assays+from+murine+bone+marrow+cells.">RANKL-based osteoclastogenic assays from murine bone marrow cells.</a> Methods Mol Biol. 1130, 307-313 (2014).</li><li>Hsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+receptor+family+member+RANK+mediates+osteoclast+differentiation+and+activation+induced+by+osteoprotegerin+ligand.">Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 3540-3545 (1999).</li><li>Underwood, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+where+comes+the+osteoclast?.">From where comes the osteoclast?.</a> J Pathol. 144 (4), 225-226 (1984).</li><li>Wein, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+bone+resorption+in+mice+by+Schnurri-3.">Control of bone resorption in mice by Schnurri-3.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8173-8178 (2012).</li></ol>

جميع المؤلفون أن لديهم لا تضارب في المصالح.

تحليل أوستيوكلاستوجينيك هو الأسلوب الأكثر استخداماً لعزل والثقافة الآكلة في المختبر12،13. بينما عدة على أساس رانكل اوستيوكلاست الحث قد وصف13،،من1415، وصف هذه الدراسة بروتوكولا مع بعض التعديلات استناداً...

العظم هو هيئة دائمة التغير ويتم تشكيلها بواسطة خلايا الاوستيوبلاستس والأكلة طوال الحياة. الآكلة المسؤولة عن ارتشاف مصفوفة غضاريف وخلايا الاوستيوبلاستس توليف وتفرز مصفوفات العظام الجديدة1. التوازن بين ارتشاف العظام وتكوين العظام حاسم بالنسبة لصحة العظام بما في ذلك الحفاظ على العظام الجماهيري والاستجابة للتحفيز والإصابة. إذا تعطل هذا التوازن، قد تحدث سلسلة من أمراض العظام الأيضية، بما في ذلك مرض هشاشة العظام وأمراض اللثة. في هذه الأمراض، ويتجاوز فقدان كتلة العظام الناتجة عن ارتشاف العظام أوستيوكلاستيك العظام تشكيل قدرة خلايا الاوستيوبلاستس2،3. وهكذا، من أجل تطوير أهداف الأدوية لعلاج أمراض الهيكل العظمى مثل هشاشة العظام، أنها حاسمة لفهم جيل وعلم الأحياء من الآكلة4.
الآكلة هي خلايا مولتينوكليتيد العملاقة فريد من نوعه يقع في أو بالقرب من سطح العظام، وتنتمي إلى الأسرة بلعم الوحيدات/1. ج. ك. Ibbotson et al. وذكرت وسيلة لتوليد اوستيوكلاست-مثل الخلايا في المختبر مع المتوسطة التي تحتوي على 1, 25-ديهيدروكسي-فيتامين D35. تحديد عامل تحفيز مستعمرة بلعم (م-CSF) والمنشط مستقبلات ليجند ب النووية عامل-κ (رانكل) كعوامل أساسية في تشكيل اوستيوكلاست زاد زيادة كبيرة كفاءة أوستيوكلاستوجينيسيس في المختبر 1 , 6 , 7-القدرة على ثقافة الآكلة في المختبر قد تحسن فهمنا لتوليد وتنظيم الآكلة.
الهدف/آليا إلى الثدييات الوظائف ربمسن (mTOR) في اثنين من المجمعات المتميزة هيكلياً ووظيفيا، وهما mTORC1 و mTORC28،9. مجمعين البروتين المتعددة متميزة عن بعضها البعض بسبب مكوناتها المختلفة وركائز المتلقين للمعلومات. mTORC1 يحتوي على بروتين التنظيمية المرتبطة فريدة من mTOR (رابتور)، بينما يحتوي mTORC2 على رفيق ربمسن غير متحسسة من mTOR (Rictor)9. ويمكنك دمج mTORC1 وإرسال إشارات هامة لتنظيم نمو الخلايا وانتشارها والتمايز. في الآونة الأخيرة، أثبتنا أن mTORC1 دوراً رئيسيا في الشبكة لارتشاف العظم تقويضي بحذف رابتور لإلغاء تنشيط mTORC1 في الآكلة10. غير أن الآليات الأساسية التي تتطلب المزيد من الدراسة. في هذه الدراسة، استخدمت أسلوب المستندة إلى رانكل أوستيوكلاستوجينيك لتوليد الآكلة من المشتقة من نخاع العظم الضامة (بنغلادش) البرية من نوع (WT) والفئران الرابكتسك ، ودراسة تأثير المنظمة mTORC1 في اوستيوكلاست تشكيل.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Raptorfl/fl mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>013188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ctsk-cre mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-022-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>BioInd</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse M-CSF protein</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>Q3U4F9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse RANKL protein</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>Q3TWY5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>302643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Garnet GBC Base solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrite Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naphthol AS-BI Phosphate Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tartrate solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tartaric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tartrate dibasic dehydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>s4797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase substrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Raptor</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ribosomal protein S6</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-actin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-130300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde</td>
			<td>Xilong scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>00000367MSDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX71</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-mm Syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito forcep</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rankl-based osteoclast culture assay of mouse bone marrow to investigate the role of mtorc1 in osteoclast formation

الآكلة فريدة من نوعها في ريسوربينج العظام الخلايا التي تميز من نسب الوحيدات/بلعم نخاع العظام. قد يؤدي إلى اختلال وظيفي للأكلة سلسلة من الأمراض الأيضية العظام، بما في ذلك مرض هشاشة العظام. على وضع أهداف الصيدلية لمنع فقدان كتلة العظم المرضية، يجب أن يكون مفهوما أن الآليات التي تميز الآكلة من السلائف. القدرة على عزل والثقافة عددا كبيرا من الآكلة في المختبر أمر بالغ الأهمية من أجل تحديد دور جينات محددة في تمايز اوستيوكلاست. يمكن إنقاص عدد اوستيوكلاست المنظمة المستهدفة/آليا إلى الثدييات من ربمسن 1 معقدة (TORC1) في الآكلة وزيادة كتلة العظام؛ غير أن الآليات الأساسية التي تتطلب المزيد من الدراسة. ويرد في هذه الدراسة، بروتوكول المستندة إلى رانكل لعزل والثقافة الآكلة من نخاع العظام الماوس ودراسة تأثير المنظمة mTORC1 على تشكيل اوستيوكلاست. وأسفر هذا البروتوكول بنجاح عدد كبير من الآكلة العملاقة، عادة خلال أسبوع واحد. ضعف تشكيل اوستيوكلاست حذف رابتور وتناقص نشاط الافرازية الفوسفاتيز الحمضي طرطرات المقاوم، مشيراً إلى أن mTORC1 أمر حاسم لتشكيل اوستيوكلاست.

باستخدام هذا البروتوكول، شوهدت عدد كبير من الآكلة العملاقة في يوم 6؛ إذا لم تعتبر الآكلة العملاقة، قد يكون يوم واحد للتمايز اوستيوكلاست اللازمة (الشكل 1). وأكد تشكيل اوستيوكلاست نجاح مصيدة تلطيخ (الشكل 2A). وكانت الآكلة العملاقة من الخلايا ا...

Watch this Scientific Journal Video about A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation at JoVE.com

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

ويصف هذه المخطوطة بروتوكولا لعزل والثقافة الآكلة في المختبر من الماوس نخاع العظام، ودراسة دور هدف ربمسن 1 المعقدة في تشكيل اوستيوكلاست/آليا إلى الثدييات.

على أساس رانكل "اوستيوكلاست الثقافة المقايسة للماوس نخاع العظام" التحقيق في دور mTORC1 في "تشكيل اوستيوكلاست"

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

a-rankl-based-osteoclast-culture-assay-mouse-bone-marrow-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.7K Views.  National Clinical Research Center of Stomatology. ويصف هذه المخطوطة بروتوكولا لعزل والثقافة الآكلة في المختبر من الماوس نخاع العظام، ودراسة دور هدف ربمسن 1 المعقدة في تشكيل اوستيوكلاست/آليا إلى الثدييات.

Video: A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

مقاربة Optogenetic لتقييم تشكيل الوصلات العصبية في نظام المشارك الثقافة

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase - a clinically approved and readily available thrombolytic drug &#8211; clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

على الطريقة الأنزيمية لانقاذ الوسيطة الخلايا الجذعية من عينات متخدر نخاع العظم

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

باستخدام تحليل متحد البؤر من<em&gt; القيطم المورق</em&gt; بالتحقيق المغيرون من WNT وShh على محدثة التخلق التدرجات

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel cell population specifically selected for growth in human serum supplemented medium. These cells are characterized by morphological, phenotypic, and molecular features distinct from MSCs and we named them Mesodermal Progenitor Cells (MPCs). MPCs are round, with a thick highly refringent core region; they show strong, trypsin resistant adherence to plastic. Failure to expand MPCs directly revealed that they are slow in cycling. This is as also suggested by Ki-67 negativity. On the other hand, culturing MPCs in standard medium designed for MSC expansion, gave rise to a population of exponentially growing MSC-like cells. Besides showing mesenchymal differentiation capacity MPCs retained angiogenic potential, confirming their multiple lineage progenitor nature. Here we describe an optimized highly reproducible protocol to isolate and characterize hBM-MPCs by flow cytometry (CD73, CD90, CD31, and CD45), nestin expression, and F-actin organization. Protocols for mesengenic and angiogenic differentiation of MPCs are also provided. Here we also suggest a more appropriate nomenclature for these cells, which has been re-named as "Mesangiogenic Progenitor Cells".

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

عزل خلايا Mesangiogenic السلف (البلدان المتوسطية الشريكة) من نخاع العظام البشرية

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.

We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.

ثقافة الفئران الجنينية الأمشاط: نموذج الفسيولوجي من غضروفي التعظم

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

علاج المخدرات و<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير من خلية بناء العظم، تآكل العظام Osteoclast التفاعلات في نموذج الميداكا السمك هشاشة العظام

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

الترتيب الزمني للبيانات التعبير الحيوي من التعبير المكاني مفصل خرائط

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

تحفيز اشارة الشق في ماوس تآكل العظام Osteoclast السلائف

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global DNA methylation level of chondrocytes is considered to be a suitable biomarker for the loss of the chondrocyte phenotype. However, results based on different experimental methods can be inconsistent. Therefore, it is important to establish a precise, simple, and rapid method to quantify global DNA methylation levels during chondrocyte dedifferentiation.
Current genome-wide methylation analysis techniques largely rely on bisulfite genomic sequencing. Due to DNA degradation during bisulfite conversion, these methods typically require a large sample volume. Other methods used to quantify global DNA methylation levels include high-performance liquid chromatography (HPLC). However, HPLC requires complete digestion of genomic DNA. Additionally, the prohibitively high cost of HPLC instruments limits HPLC&#39;s wider application.
In this study, genomic DNA (gDNA) was extracted from human chondrocytes cultured with varying number of passages. The gDNA methylation level was detected using a methylation-specific dot blot assay. In this dot blot approach, a gDNA mixture containing the methylated DNA to be detected was spotted directly onto an N+ membrane as a dot inside a previously drawn circular template pattern. Compared with other gel electrophoresis-based blotting approaches and other complex blotting procedures, the dot blot method saves significant time. In addition, dot blots can detect overall DNA methylation level using a commercially available 5-mC antibody. We found that the DNA methylation level differed between the monolayer subcultures, and therefore could play a key role in chondrocyte dedifferentiation. The 5-mC dot blot is a reliable, simple, and rapid method to detect the general DNA methylation level to evaluate chondrocyte phenotype.

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

We present a method to quantify DNA methylation based on the 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We determined the 5-mC levels during chondrocyte dedifferentiation. This simple technique could be used to quickly determine the chondrocyte phenotype in ACI treatment.

A 5-ماك دوت بلوت الفحص تحديد مستوى الحمض النووي ميثيلاتيون من تشوندروسيت التفرق<em&gt; في المختبر</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

الهندسة الحيوية من أنسنة نخاع العظام ميكرونفيرونمنتس في الماوس والتصور من خلال التصوير لايف

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

على أساس رانكل "اوستيوكلاست الثقافة المقايسة للماوس نخاع العظام" التحقيق في دور mTORC1 في "تشكيل اوستيوكلاست"

PLAYLIST