Авторы благодарят доктор Minghan Тонг и S. Като за любезно предоставление реагентов и мышей. Мы благодарим членов Цзоу лаборатории для полезных обсуждений. Эта работа частично поддержали грантов из 973 программы из китайского министерства науки и технологии (большинство) [2014CB964704 и 2015CB964503], программы клинических исследований 9 людей больницы, Шанхай Jiao Tong школы медицины университета. Спасибо за помощь Фонда основной клеточной биологии и основной объект для химической биологии, CAS центр передового опыта в области науки для молекулярной клеток, Шанхайский Институт биохимии и клеточной биологии, Китайской академии наук.

Все процедуры, связанные с животными, были выполнены в соответствии с протоколом, утвержденным в Стэнфордском административной панели на лабораторных животных уход (APLAC); и были одобрены животное уход и использование Комитета Шанхайского института биохимии и ячейки Биология.
1. Подготовка
<ol><li>Генерировать остеокластов конкретных Raptor удаления мышей (Raptorfl/fl; Ctsk-cre, далее, рэпCtsk) путем скрещивания Raptorfl/fl мышей с Ctsk-cre мышей. Используйте мышь Raptorfl/fl как WT управления в данном исследовании.</li>
	<li>Иметь контейнер со льдом, чтобы держать изолированных кости.</li>
	<li>
Подготовка питательной среды.
	<ol>
<li>Подготовьте α-MEM питательной среды, дополняющего минимальных основных средних альфа (α-MEM) с 1 x глутамина, пенициллин стрептомицином и 10% плода телячьей сыворотки.</li>
		<li>Подготовьте костного макрофагов индукции среднего, состоящий из 50 мл α-MEM средних и M-CSF в 20 нг/мл.</li>
		<li>Подготовка среднего индукции остеокластов, состоящий из M-CSF и RANKL на 20 нг/мл, соответственно, 50 мл α-MEM среды.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Подготовьте следующие буферы до окрашивания ЛОВУШКУ.
	<ol>
<li>Подготовьте исправление раствор, состоящий из 6,5 мл ацетона, 2,5 мл раствора цитрата и 0,8 мл раствора формальдегида (vol/vol) 37%.</li>
		<li>Подготовьте ловушек, окрашиванию решение.<ol>
<li>Prewarm деионизованной воды 37 ° C.</li>
			<li>Добавить 100 мкл быстро граната GBC базового решения и 100 мкл раствора нитрита натрия в 1,5 мл микропробирок и смешивать, нежный инверсии для 30 s. оставить смесь стоять за 2 мин.</li>
			<li>Prewarm 9 мл деионизованной воды 37 ° C. Добавьте 200 мкл diazotized быстро граната GBC базового решения от шага 1.4.2.2, 100 мкл раствора фосфат Нафтол AS-би, 400 мкл раствора ацетата и 200 мкл тартрата раствор.</li>
			<li>Держите ЛОВУШКУ, окрашивание раствора смесь на водяной бане при температуре 37 ° C.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Подготовьте следующие буфера перед ЛОВУШКУ активности количественная оценка питательной среды.
	<ol>
<li>Подготовить тартрата буфера (50 мл): 2 мл L-винной кислоты 0,33 М, 48 мл 0,33 М натрия тартрата двуосновной обезвоживанию. Отрегулируйте значение pH 4,9.</li>
		<li>Подготовка 4-нитрофенил фосфат динатрия (pNPP) буфера (200 мл): 1.502 g глицина, 41 мг MgCl2, 27,2 мг ZnCl2и 180 мл деионизованной воды. Отрегулируйте значение пэ-аша для 10.4 с 3 M NaOH и объем до 200 мл деионизированной водой.</li>
		<li>Подготовка pNPP буфер с фосфатазы субстрата (для одного 96-луночных Латы): 49.37 мг фосфатазы субстрат и 175 мкл буфера pNPP шага 1.5.2.</li>
		<li>Подготовка субстрата буфера (9 мл/96-луночных Латы): 6.24 мл деионизированной воды, 360 мкл раствора ацетата, а 2,4 мл тартрата буфера. Mix вихря и разогреть при 37 ° C перед использованием.</li>
		<li>Добавление 9 мл разогретой субстрата buffer(1.5.4) сделать смеси субстрата и вихревые для 10 90 мкл буфера pNPP с фосфатазы substrate(1.5.3) s.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Вскрытие (день -1)
<ol><li>Усыпить 3 1 месяц старый самок мышей WT и рэпCtsk CO2 отдельно. Выполняйте CO2 ингаляции с соответствующим оборудованием, квалифицированным персоналом.</li>
	<li>Погружайте 6 мышей в стакан с 100 мл 75% этанола (vol/vol) 5 мин для предотвращения бактериального загрязнения и затем разместить на доске рассечение в лежачем положении. Сделать надрез на дистальном голени вертикально и вскрыть кожу вдоль задних конечностей офтальмологический ножницами.</li>
	<li>Вырезать суставных связок тазобедренного сустава с ножницами и вывихнуть задних конечностей из ствола.</li>
	<li>Вырезать суставных связок коленного сустава и аккуратно отделить голени и бедра от коленного сустава. Аккуратно удалите мягких тканей с ножницами.</li>
	<li>Поместите все кости одной генотипа в одной мыши в каждой скважине шести хорошо плита с 2 мл α-MEM на льду. Примечание: Для сохранения жизнеспособности клеток, кости должны храниться в этих условиях для менее 1 ч.</li>
</ol>3. изоляция (день -1)
<ol><li>Заполните одно также шесть ну плиты с 75% этанола (3 мл) и другие 5 скважин с α-MEM среднего (3 мл).</li>
	<li>Положите все кости одной генотипа в этанол мыть за 15 s и мыть кости 5 раз с α-MEM средой для 10 s каждый раз.</li>
	<li>Cut off эпифизов с ножницами и вставьте иглу шприца 0,45 мм в полости и флеш костного мозга, с α-MEM среднего в 50-мл пластиковых пробирок.</li>
	<li>Промойте полость кости, используя тот же метод из другого конца кости. Повторите по крайней мере дважды, чтобы вымыть полость кости до тех пор, пока кости бледно.</li>
	<li>Центрифуга костного мозга для получения клеток лепешки на 800 x g и 4 ° C за 5 мин аспирата супернатант.</li>
	<li>Добавьте 3 мл буфера lysis красных кровяных клеток в пластиковых пробирок и очистка нежно ресуспензируйте костного мозга. Держите пластиковых пробирок на льду на 8 минут, чтобы лизировать красных кровяных клеток.</li>
	<li>Добавьте 6 мл α-MEM среды в пластиковых пробирок остановить лизис клеток. Центрифуга 500 x g и 4 ° C на 10 минут и удалить супернатант.</li>
	<li>Ресуспензируйте в 3 мл α-MEM питательной среды и место клетки в шести ну плиту (обычно один мышь за хорошо).</li>
	<li>Инкубируйте при 37 ° C в 5% CO2 инкубатора на ночь.</li>
</ol>4. обшивка (день 0)
<ol><li>Передать супернатант пластиковых пробирок 15мл собирать неприсоединенной клетки на следующее утро.</li>
	<li>Центрифуга на 800 x g и 4 ° C на 5 мин и удалить супернатант.</li>
	<li>Ресуспензируйте в 4 мл α-MEM питательной среды.</li>
	<li>Возьмите 20 мкл раствора клеток и смешать с 20 мкл Трипановый синий. Добавить 10 мкл смеси в Счетной палате и получить количество клеток в мл раствора.</li>
	<li>Добавьте соответствующий объем α-MEM питательной среды для получения клеток решение 500000 клеток/мл.</li>
	<li>Добавьте 500 мкл и 50 мкл костного макрофагов индукции среды в каждой скважине 24-Ну и 96-луночных крышку, соответственно.</li>
	<li>Добавьте 500 мкл и 50 мкл раствора клеток в каждой скважине 24-Ну и 96-луночных крышку, соответственно.</li>
	<li>Инкубируйте 3 дней при 37 ° C в 5% CO2 инкубатора.</li>
</ol>5. Дифференциация (3-7 дней)
<ol><li>Через три дня после покрытия, собирать 50 мкл среднего от каждой скважины 96-хорошо пластины и заморозить при температуре-20 ° C, затем аспирационная остаточного среднего.</li>
	<li>Добавьте 1 мл и 100 мкл остеокластов индукции среднего в каждую лунку 24-ну плиты и плиты 96-луночных, соответственно.</li>
	<li>Инкубируйте при 37 ° C в течение 2 дней.</li>
	<li>Собирать 50 мкл среды от каждой скважины и аспирационная остаточного среднего.</li>
	<li>Добавьте остеокластов индукции среднего в каждой скважине.</li>
	<li>Инкубируйте при 37 ° C, за 1 день. Примечание: В этот момент времени, большие, многоядерные остеокласты следует рассматривать под инвертированным микроскопом (рис. 2A).</li>
	<li>Если не видны остеокласты, измените среднего индукции остеокластов и наблюдать ежедневно, пока не видел остеокластов.</li>
	<li>Соберите 50 мкл среды от каждой скважины 96-луночных пластины после того, как сформировались остеокластов.</li>
</ol>6. тартрата пятнать устойчивостью кислой фосфатазы (ловушка)
Примечание: Зрелые остеокластов может присутствовать после 6-7 дней в vitro культуры (шаг 4).
<ol><li>Аспирационная среднего и мыть нежно 3 раза с ПБС.</li>
	<li>Исправить ячейки в каждой скважине 96-луночных пластины с 100 мкл раствора исправление для 30 s при комнатной температуре.</li>
	<li>После фиксации аспирационная решения и мыть нежно 3 раза с деионизированную воду подогретую до 37 ° C. Аспирационная деионизированную воду.</li>
	<li>100 мкл ЛОВУШКУ пятно в каждой скважине 96-луночных пластины и место пластину в инкубаторе при 37 ° C 30 мин и щит от света.</li>
	<li>После окрашивания, аспирационная ЛОВУШКУ пятно и осторожно промойте деионизованной воды 3 раза.</li>
	<li>Остеокласты изображения с помощью инвертированного микроскопа при 40 кратном.</li>
</ol>7. ЛОВУШКУ активности количественная оценка питательной среды
<ol><li>Сбор 30 мкл культуры супернатанта от каждой скважины 96-луночных пластины из шага 5.1, 5.4 и 5.8; Используйте 30 мкл-культивированный остеокластов индукции среды как отрицательный контроль. Поместите образцы в новой 96-луночных пластины.</li>
	<li>Добавление 90 мкл mixture(1.5.5) субстрата в каждой скважине 96-луночных пластины.</li>
	<li>Место пластину в инкубаторе при 37 ° C 1 h и щит от света.</li>
	<li>Остановите реакции, добавляя 50 мкл 3 M NaOH в каждой скважине 96-луночных пластины.</li>
	<li>Измерения theabsorbance на длине волны 405 нм.</li>
</ol>8. западный Blotting
Примечание: После 6-7 дней в vitro культуры в пластину 24-Ну, Зрелые остеокласты должны быть видны.
<ol><li>Аспирационная среды.</li>
	<li>Мыть нежно с предварительно охлажденный 1 x PBS 3 раза.</li>
	<li>Аспирационная PBS.</li>
	<li>100 мкл 1 x SDS лизис буфера содержащий ингибитор протеазы коктейль.</li>
	<li>Лизатов тепла при 105 ° C 10 мин и центрифуги на 12 000 × g и 4 ° C на 10 мин собирать supernatants, содержащие белки.</li>
	<li>Отдельные лизатов, содержащие 30 мкг белка на 10% SDS-PAGE11 и затем передать винилидена фторида (PVDF) мембраны.</li>
	<li>Блокировать мембраны с 5% обезжиренное молоко за 30 мин.</li>
	<li>Инкубации мембран с анти ящера, анти P-S6, анти S6, анти β-актина в 1:1,000 разрежения в 5% обезжиренное молоко при температуре 4 ° C на ночь.</li>
	<li>Вымойте мембраны с трис буфер солевой с Tween-20 (TBST) для 10 мин при комнатной температуре.</li>
	<li>Повторите шаг 8,9 дважды.</li>
	<li>Инкубации мембран с пероксидазой хрена (ПХ)-конъюгированных IgG антитела анти мыши или кролика на 1:5,000 разрежения в 5% обезжиренное молоко в течение 1 ч при комнатной температуре.</li>
	<li>Вымойте мембраны 3 раза с TBST 10 мин при комнатной температуре.</li>
	<li>Хемилюминесцентный детектор добавить Западной Хемилюминесцентный субстрат HRP на мембранах и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре. Слейте излишки субстрата и разоблачить помарки для рентгеновской пленки.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).</li><li>Feng, X., McDonald, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorders+of+bone+remodeling.">Disorders of bone remodeling.</a> Annu Rev Pathol. 6, 121-145 (2011).</li><li>Boyce, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+osteoclast+biology+reveal+potential+new+drug+targets+and+new+roles+for+osteoclasts.">Advances in osteoclast biology reveal potential new drug targets and new roles for osteoclasts.</a> J Bone Miner Res. 28 (4), 711-722 (2013).</li><li>Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., McManus, L. M., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+osteoclast-like+cells+and+their+progenitors+in+cultures+of+feline+marrow+mononuclear+cells.">Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells.</a> J Cell Biol. 99 (2), 471-480 (1984).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93 (2), 165-176 (1998).</li><li>Wong, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRANCE+is+a+novel+ligand+of+the+tumor+necrosis+factor+receptor+family+that+activates+c-Jun+N-terminal+kinase+in+T+cells.">TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in T cells.</a> J Biol Chem. 272 (40), 25190-25194 (1997).</li><li>Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR:+from+growth+signal+integration+to+cancer,+diabetes+and+ageing.">mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (1), 21-35 (2011).</li><li>Bhaskar, P. T., Hay, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+TORCs+and+Akt.">The two TORCs and Akt.</a> Dev Cell. 12 (4), 487-502 (2007).</li><li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Regulatory-associated+Protein+of+mTOR+(Raptor)/Mammalian+Target+of+Rapamycin+Complex+1+(mTORC1)+Signaling+in+Osteoclasts+Increases+Bone+Mass+by+Inhibiting+Osteoclast+Differentiation+in+Mice.">Inactivation of Regulatory-associated Protein of mTOR (Raptor)/Mammalian Target of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) Signaling in Osteoclasts Increases Bone Mass by Inhibiting Osteoclast Differentiation in Mice.</a> J Biol Chem. 292 (1), 196-204 (2017).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+culture+and+resorption+assays.">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).</li><li>Tevlin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+derivation+from+mouse+bone+marrow.">Osteoclast derivation from mouse bone marrow.</a> J Vis Exp. (93), e52056 (2014).</li><li>Xing, L., Boyce, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANKL-based+osteoclastogenic+assays+from+murine+bone+marrow+cells.">RANKL-based osteoclastogenic assays from murine bone marrow cells.</a> Methods Mol Biol. 1130, 307-313 (2014).</li><li>Hsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+receptor+family+member+RANK+mediates+osteoclast+differentiation+and+activation+induced+by+osteoprotegerin+ligand.">Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 3540-3545 (1999).</li><li>Underwood, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+where+comes+the+osteoclast?.">From where comes the osteoclast?.</a> J Pathol. 144 (4), 225-226 (1984).</li><li>Wein, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+bone+resorption+in+mice+by+Schnurri-3.">Control of bone resorption in mice by Schnurri-3.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8173-8178 (2012).</li></ol>

Все авторы заявляют, что они имеют без конфликта интересов.

Osteoclastogenic assay является наиболее широко используемый метод, чтобы изолировать и культуры остеокласты в пробирке12,13. Хотя несколько основанных на RANKL остеокластов индукции были описаны13,14,15, настоящее ...

Кости является постоянно меняющейся органом и перестроенный остеобластов и остеокласты на протяжении всей жизни. Остеокласты отвечают для рассасывания минерализованных матрицы и остеобластов синтезировать и выделяют новые костной матрицы1. Баланс между костную резорбцию и формирования костей имеет решающее значение для здоровья костей, включая поддержание костной массы и ответ на стимуляцию и травмы. Если этот баланс нарушается, может возникнуть ряд метаболических заболеваний костей, включая остеопороза и заболеваний пародонта. В этих заболеваний костной массы потери в результате osteoclastic костную резорбцию превышает костей, образующих потенциал остеобластов2,3. Таким образом в целях разработки фармацевтических целей для лечения скелетных расстройств, таких как остеопороз, важно понять поколения и биологии остеокласты4.
Остеокласты уникальный гигантские многоядерные клетки, расположенные на или вблизи поверхности кости и принадлежат к моноцитов/макрофагов семьи1. Ibbotson K. J. и др. сообщил метод для создания остеокластов подобных клеток в пробирке с средой, содержащей 1,25-дигидрокси витамин D35. Выявление макрофагальный колонии стимулирующий фактор (M-CSF) и рецепторов активатор для ядерного фактора κ B лиганда (RANKL) как основные факторы формирования остеокластов резко повысило эффективность osteoclastogenesis в пробирке 1 , 6 , 7. способность культуры остеокласты в vitro улучшилось наше понимание поколения и регулирование остеокластов.
Млекопитающих/механистический цель rapamycin (mTOR) функций в двух структурно и функционально различных комплексов, а именно mTORC1 и mTORC28,9. Два различных белковых комплексов отличаются друг от друга из-за их различных компонентов и ниже по течению субстратов. mTORC1 содержит уникальные регулирования связанных белков mTOR (хищника), а mTORC2 rapamycin нечувствительным компаньон mTOR (Rictor)9. mTORC1 можно интегрировать и передавать важные сигналы регулировать рост клеток, пролиферации и дифференцировки. Недавно мы продемонстрировали, что mTORC1 играет ключевую роль в сети катаболических костную резорбцию путем удаления Raptor для инактивации mTORC1 в остеокласты10. Однако основные механизмы требуют дальнейшего изучения. В настоящем исследовании на основе RANKL osteoclastogenic метод был использован для создания остеокласты из костного мозга, полученных макрофагов (BMMs) одичал типа (WT) и рэпCtsk мышей, а также изучить влияние инактивирование mTORC1 на остеокластов формирование.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Raptorfl/fl mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>013188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ctsk-cre mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-022-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>BioInd</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse M-CSF protein</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>Q3U4F9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse RANKL protein</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>Q3TWY5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>302643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Garnet GBC Base solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrite Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naphthol AS-BI Phosphate Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tartrate solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tartaric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tartrate dibasic dehydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>s4797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase substrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Raptor</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ribosomal protein S6</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-actin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-130300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde</td>
			<td>Xilong scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>00000367MSDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX71</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-mm Syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito forcep</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rankl-based osteoclast culture assay of mouse bone marrow to investigate the role of mtorc1 in osteoclast formation

Остеокласты являются уникальные кости resorbing клеток, которые отличают от линии моноцитов/макрофагов костного мозга. Дисфункция остеокластов может привести к серии метаболических заболеваний костей, включая остеопороза. Для разработки фармацевтических целей для профилактики патологических костной потери массы, необходимо понимать механизмы, которыми остеокласты дифференцировать от прекурсоров. Способность изолировать и культуры большое число остеокластов в vitro имеет решающее значение для того, чтобы определить роль конкретных генов в дифференциации остеокластов. Инактивация млекопитающих/механистический цель rapamycin комплекс 1 (TORC1) в остеокластов может уменьшить число остеокластов и увеличения костной массы; Однако основные механизмы требуют дальнейшего изучения. В настоящем исследовании описан RANKL-протокол на основе изолировать и культуры остеокласты из костного мозга мыши и изучить влияние инактивирование mTORC1 на формирование остеокластов. Этот протокол успешно привели в большое количество гигантских остеокласты, обычно в течение одной недели. Удаление Raptor нарушения формирования остеокластов и снизилась активность секреторной тартрата стойкие кислая фосфатаза, означающее что mTORC1 имеет решающее значение для формирования остеокластов.

Используя настоящий Протокол, большое количество гигантских остеокласты были замечены на день 6; Если не видны гигантских остеокласты, еще один день дифференцировки остеокластов может быть необходимо (рис. 1). Формирование успешных остеокластов был по?...

Watch this Scientific Journal Video about A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation at JoVE.com

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Эта рукопись описывает протокол к изоляции и культуры остеокласты в пробирке из костного мозга мыши и для изучения роли млекопитающих/механистический цель rapamycin комплекс 1 в формировании остеокластов.

На основе RANKL остеокластов культуры Assay из мыши костного расследовать роль mTORC1 в формировании остеокластов

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

a-rankl-based-osteoclast-culture-assay-mouse-bone-marrow-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.7K Views.  National Clinical Research Center of Stomatology. Эта рукопись описывает протокол к изоляции и культуры остеокласты в пробирке из костного мозга мыши и для изучения роли млекопитающих/механистический цель rapamycin комплекс 1 в формировании остеокластов.

Video: A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

Optogenetic подход к оценке Формирование нейронные связи в совместной культуре системы

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase - a clinically approved and readily available thrombolytic drug &#8211; clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

Ферментативный метод для того чтобы спасти мезенхимальных стволовых клеток из запекшейся образцы костного мозга

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Использование конфокальной Анализ<em&gt; Xenopus Laevis</em&gt; По расследованию модуляторы Wnt и Shh морфогена градиентов

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel cell population specifically selected for growth in human serum supplemented medium. These cells are characterized by morphological, phenotypic, and molecular features distinct from MSCs and we named them Mesodermal Progenitor Cells (MPCs). MPCs are round, with a thick highly refringent core region; they show strong, trypsin resistant adherence to plastic. Failure to expand MPCs directly revealed that they are slow in cycling. This is as also suggested by Ki-67 negativity. On the other hand, culturing MPCs in standard medium designed for MSC expansion, gave rise to a population of exponentially growing MSC-like cells. Besides showing mesenchymal differentiation capacity MPCs retained angiogenic potential, confirming their multiple lineage progenitor nature. Here we describe an optimized highly reproducible protocol to isolate and characterize hBM-MPCs by flow cytometry (CD73, CD90, CD31, and CD45), nestin expression, and F-actin organization. Protocols for mesengenic and angiogenic differentiation of MPCs are also provided. Here we also suggest a more appropriate nomenclature for these cells, which has been re-named as "Mesangiogenic Progenitor Cells".

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

Разделительные Mesangiogenic клетки-предшественники (ПДК) из костного мозга человека

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.

We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.

Культура мышиных эмбриональных плюсны: физиологическую модель Эндохондральный окостенение

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Лечение наркомании и<em&gt; В Vivo</em&gt; Визуализация остеобластов-остеокластов взаимодействий в модели Оризии Рыба Остеопороз

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

Temporal Упорядочение динамических данных выражений из конкретных пространственных Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

Стимуляция Signaling Notch у мышей предшественников остеокластов

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global DNA methylation level of chondrocytes is considered to be a suitable biomarker for the loss of the chondrocyte phenotype. However, results based on different experimental methods can be inconsistent. Therefore, it is important to establish a precise, simple, and rapid method to quantify global DNA methylation levels during chondrocyte dedifferentiation.
Current genome-wide methylation analysis techniques largely rely on bisulfite genomic sequencing. Due to DNA degradation during bisulfite conversion, these methods typically require a large sample volume. Other methods used to quantify global DNA methylation levels include high-performance liquid chromatography (HPLC). However, HPLC requires complete digestion of genomic DNA. Additionally, the prohibitively high cost of HPLC instruments limits HPLC&#39;s wider application.
In this study, genomic DNA (gDNA) was extracted from human chondrocytes cultured with varying number of passages. The gDNA methylation level was detected using a methylation-specific dot blot assay. In this dot blot approach, a gDNA mixture containing the methylated DNA to be detected was spotted directly onto an N+ membrane as a dot inside a previously drawn circular template pattern. Compared with other gel electrophoresis-based blotting approaches and other complex blotting procedures, the dot blot method saves significant time. In addition, dot blots can detect overall DNA methylation level using a commercially available 5-mC antibody. We found that the DNA methylation level differed between the monolayer subcultures, and therefore could play a key role in chondrocyte dedifferentiation. The 5-mC dot blot is a reliable, simple, and rapid method to detect the general DNA methylation level to evaluate chondrocyte phenotype.

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

We present a method to quantify DNA methylation based on the 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We determined the 5-mC levels during chondrocyte dedifferentiation. This simple technique could be used to quickly determine the chondrocyte phenotype in ACI treatment.

Анализ 5-кратного точечного блоттинга Количественный анализ уровня метилирования ДНК дифференцировки хондроцитов<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Биоинжиниринг гуманизированных микроуровней костного мозга в мышах и их визуализация с помощью Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

На основе RANKL остеокластов культуры Assay из мыши костного расследовать роль mTORC1 в формировании остеокластов

PLAYLIST