Die Autoren danken Dr. Minghan Tong und S. Kato für freundlicherweise die Reagenzien und Mäuse. Wir danken die Mitgliedern des Zou Lab für nützliche Diskussionen. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch Zuschüsse von 973-Programm aus dem chinesischen Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST) [2014CB964704 und 2015CB964503], klinische Forschungsprogramm des 9. Volks Krankenhaus, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Danke für die Hilfe von Core Facility für Zellbiologie und Core Facility für chemische Biologie, CAS Zentrum für Exzellenz in der molekularen Zelle Wissenschaft, Shanghai Institut für Biochemie und Zellbiologie, Chinese Academy of Sciences.

Alle Verfahren in Bezug auf die Tiere wurden nach dem Protokoll von der Stanford-Verwaltungs-Panel auf Laboratory Animal Care (APLAC) genehmigt durchgeführt und wurden durch die Animal Care and Use Committee des Shanghai Institute für Biochemie und Zelle genehmigt Biologie.
1. Vorbereitung
<ol><li>Generieren von Osteoklasten bestimmte Raptor Löschung Mäuse (Raptorfl/fl; Ctsk-Cre, jenseits CtskRap) bei der Paarung Raptorfl/fl -Mäuse mit Ctsk-Cre Mäuse. Verwenden Sie die Raptorfl/fl -Mäuse als WT-Kontrolle in dieser Studie.</li>
	<li>Haben Sie einen Behälter mit Eis, isolierte Knochen zu halten.</li>
	<li>
Kulturmedium vorzubereiten.
	<ol>
<li>Bereiten Sie α-MEM Kulturmedium durch Ergänzung minimale wesentliche mittlere Alpha (α-MEM) mit 1 X Glutamin, Penicillin-Streptomycin und 10 % fetalen Kälberserum vor.</li>
		<li>Vorbereiten des Knochenmarks Makrophagen Induktion Medium bestehend aus 50 mL α-MEM Medium und M-CSF bei 20 ng/mL.</li>
		<li>Bereiten Sie Osteoklasten Induktion Medium bestehend aus M-CSF und RANKL bei 20 ng/mL, bzw., in 50 mL α-MEM Medium vor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiten Sie die folgenden Puffer vor der Falle zu beflecken.
	<ol>
<li>Bereiten Sie Fix-Lösung bestehend aus 6,5 mL Aceton, 2,5 mL Citrat-Lösung und 0,8 mL 37 % (Vol/Vol) Formaldehyd-Lösung.</li>
		<li>Bereiten Sie TRAP Färbelösung vor.<ol>
<li>Prewarm deionisiertes Wasser auf 37 ° C.</li>
			<li>100 µL schnell Granat GBC Basislösung und 100 µL Natrium Nitrit-Lösung in einem 1,5 mL Reaktionscup und mischen durch sanfte Umkehrung für 30 S. lassen die Mischung für 2 min stehen.</li>
			<li>Prewarm 9 mL entionisiertem Wasser auf 37 ° C. Fügen Sie 200 µL des Diazotized schnell Granat GBC Basislösung aus Schritt 1.4.2.2, 100 µL Naphthol AS-BI-Phosphat-Lösung, 400 µL Acetat-Lösung und 200 µL Tartrat-Lösung.</li>
			<li>Halten Sie die Falle Färbelösung Mischung in einem Wasserbad bei 37 ° C.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiten Sie den folgenden Puffer vor der Falle Aktivität Quantifizierung Kulturmedium.
	<ol>
<li>Bereiten Sie Tartrat Puffer (50 mL): 2 mL 0,33 M L-Weinsäure Säure, 48 mL 0,33 M-Natrium-Tartrat Diabas-entwässern. Stellen Sie den pH-Wert auf 4,9.</li>
		<li>4-Nitrophenyl Binatrium (pNPP) Phosphatpuffer (200 mL) vorbereiten: 1,502 g Glycin, 41 mg MgCl2, 27,2 mg ZnCl2und 180 mL entionisiertem Wasser. Stellen Sie den pH-Wert auf 10.4 mit 3 M NaOH und die Lautstärke auf 200 mL mit entionisiertem Wasser.</li>
		<li>Vorbereiten der pNPP Puffer mit Phosphatase Substrat (einer 96-Well-Platte): 49,37 mg Phosphatase Substrat und 175 µL pNPP Puffers von Schritt 1.5.2.</li>
		<li>Bereiten Sie Substratpuffer (9 mL/96-Well-Platte): 6,24 mL deionisiertes Wasser, 360 μL der Acetat-Lösung und 2,4 mL Tartrat Puffer. Mischen von Wirbel und Heizen Sie bei 37 ° C vor dem Gebrauch.</li>
		<li>9ml vorgeheizten Substrat buffer(1.5.4) um eine Substratmischung und Wirbel für 10 90 μL pNPP Puffer mit Phosphatase substrate(1.5.3) hinzufügen s.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Präparation (Tag-1)
<ol><li>Einschläfern Sie 3 ein-Monat-alte weibliche WT und RapCtsk Mäuse durch CO2 getrennt. Durchführen Sie CO2 -Inhalation mit geeigneter Ausrüstung von geschultem Personal.</li>
	<li>Tauchen Sie 6 Mäuse in ein Becherglas mit 100 mL 75 % Ethanol (Vol/Vol) für 5 min, bakterielle Kontamination zu verhindern und dann auf eine Dissektion Brett in Rückenlage legen. Machen Sie einen Schnitt an der distalen Tibia vertikal und sezieren Sie die Haut entlang der hinteren Gliedmaßen mit ophthalmologischen Schere.</li>
	<li>Geschnitten Sie das Gelenke Ligament des Hüftgelenks mit einer Schere und verrücken Sie der hinteren Gliedmaßen aus dem Kofferraum.</li>
	<li>Schneiden Sie die artikuläre Bandverletzungen des Kniegelenks und trennen Sie sorgfältig zu, der Tibia und Femur aus dem Kniegelenk. Entfernen Sie vorsichtig das Weichgewebe mit einer Schere.</li>
	<li>Legen Sie alle Knochen ein Genotyp in einem einzigen Mausklick in jede Vertiefung eine sechs-Well-Platte mit 2 mL α-MEM auf Eis. Hinweis: Um die Zellviabilität zu erhalten, sollte der Knochen unter diesen Bedingungen weniger als 1 h gehalten werden.</li>
</ol>3. Isolation (Tag-1)
<ol><li>Einen Brunnen von einer sechs-Well-Platte mit 75 % Ethanol (3 mL) und die weiteren 5 Bohrungen mit α-MEM Medium (3 mL) füllen.</li>
	<li>Setzen Sie alle Knochen von einem Genotyp in der Ethanol-Wäsche für 15 s und waschen Knochen 5 Mal mit α-MEM Medium für 10 s jedes Mal.</li>
	<li>Die Epiphysen mit der Schere abgeschnitten und 0,45 mm Spritze Nadel in den Hohlraum und Flush Knochenmark, mit α-MEM Medium in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Spülen Sie den Knochenhohlraum mit der gleichen Methode vom anderen Ende des Knochens. Mindestens zweimal wiederholen Sie, um den Knochenhohlraum gründlich waschen, bis der Knochen blass ist.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Knochenmark um eine Zelle Pellet bei 800 X g und 4 ° C für 5 min. Absaugen der Überstand zu erhalten.</li>
	<li>Fügen Sie 3 mL der roten Blutzelle Lysis Puffer in die Zentrifugenröhrchen und Pipette vorsichtig auf das Knochenmark Aufschwemmen. Halten Sie die Zentrifugenröhrchen für 8 min zu den Erythrozyten zu lysieren auf Eis.</li>
	<li>Fügen Sie 6 mL α-MEM Medium in die Zentrifugenröhrchen, Zelle Lysis zu stoppen. Bei 500 x g und 4 ° C für 10 min Zentrifugieren und den Überstand abgesaugt.</li>
	<li>In 3 mL Kulturmedium α-MEM Aufschwemmen Sie und legen Sie die Zellen in einem sechs-Well-Platte (in der Regel eine Maus pro Well).</li>
	<li>Über Nacht bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator inkubieren.</li>
</ol>(4) Beschichtung (Tag 0)
<ol><li>Übertragen des Überstands auf eine 15 mL Zentrifugenröhrchen, die ungebunden Zellen am nächsten Morgen zu sammeln.</li>
	<li>Bei 800 x g und 4 ° C für 5 min Zentrifugieren und den Überstand abgesaugt.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie in 4 mL Kulturmedium α-MEM.</li>
	<li>20 µL der Zelle Lösung nehmen und mischen mit 20 µL Trypan blau. Die Zählkammer 10 µL der Mischung hinzu und erhalten Sie die Zellzahl pro mL Lösung.</li>
	<li>Fügen Sie einem entsprechenden Volumen α-MEM Kulturmedium eine Zelle Lösung von 500.000 Zellen/mL zu erhalten.</li>
	<li>Fügen Sie 500 µL und 50 µL Knochenmark Makrophagen Induktion Medium in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte und 96-Well-Platte, beziehungsweise.</li>
	<li>Fügen Sie 500 µL und 50 µL der Zelle Lösung in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte und 96-Well-Platte, beziehungsweise.</li>
	<li>3 Tage bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator inkubieren.</li>
</ol>5. Differenzierung (3-7 Tage)
<ol><li>Drei Tage nach der Beschichtung, kassiere 50 µL Medium in jede Vertiefung der 96-Well-Platte und bei-20 ° C eingefroren und aspirieren Sie passives Medium.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL und 100 µL Osteoklasten Induktion Medium in jedem Brunnen von einer 24-Well-Platte und einer 96-Well-Platte, beziehungsweise.</li>
	<li>2 Tage bei 37 ° C inkubieren.</li>
	<li>Kassiere in jede Vertiefung 50 µL Medium und aspirieren Sie passives Medium.</li>
	<li>Fügen Sie Osteoklasten Induktion Medium in jede Vertiefung.</li>
	<li>1 Tag bei 37 ° C inkubieren. Hinweis: Zu diesem Zeitpunkt sollten große, mehrkernigen Osteoklasten unter einem inversen Mikroskop (Abbildung 2A) eingesehen werden.</li>
	<li>Wenn Osteoklasten nicht gesehen werden, verändern Sie die Osteoklasten Induktion Medium und täglich zu beobachten Sie, bis die Osteoklasten zu sehen sind.</li>
	<li>Sammeln Sie 50 µL Medium aus jeder Quelle des 96-Well-Platte, nachdem Osteoklasten gebildet haben.</li>
</ol>6. Tartrat resistente saure Phosphatase (TRAP) Färbung
Hinweis: Reifen Osteoklasten können nach 6-7 Tagen der in-vitro- Kultur (Schritt 4) vorhanden sein.
<ol><li>Aspirieren Sie Medium und waschen Sie vorsichtig 3mal mit 1 X PBS.</li>
	<li>Beheben Sie die Zellen in jede Vertiefung der 96-Well-Platte mit 100 µL Lösung für 30 s bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Aspirieren Sie nach der Fixierung die Lösung und waschen Sie sanft 3 Mal mit entionisiertem Wasser auf 37 ° c vorgewärmt Deionisiertes Wasser abzusaugen.</li>
	<li>Fügen Sie 100 µL der TRAP Fleck in jede Vertiefung der 96-Well-Platte hinzu und platzieren Sie die Platte in einem Inkubator bei 37 ° C für 30 min und Schild aus Licht.</li>
	<li>Nach dem Färben, Aspirieren des TRAP-Flecks und 3 Mal mit entionisiertem Wasser sanft waschen.</li>
	<li>Bild Osteoklasten mit einem inversen Mikroskop bei 40 X Vergrößerung.</li>
</ol>(7) Falle Aktivität Quantifizierung Kulturmedium
<ol><li>Sammle 30 µL Kultur Überstand von jedem Bohrloch der 96-Well-Platte aus Schritt 5.1, 5.4 und 5.8; Verwenden Sie 30 µL-kultivierte Osteoklasten Induktion Medium als die negativ-Kontrolle. Legen Sie die Proben in einer neuen 96-Well-Platte.</li>
	<li>Fügen Sie 90 μL der Substrat-mixture(1.5.5) in jede Vertiefung der 96-Well-Platte.</li>
	<li>Legen Sie die Platte in einem Inkubator bei 37 ° C für 1 h und Schild aus Licht.</li>
	<li>Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 50 µL 3 M NaOH in jede Vertiefung der 96-Well-Platte.</li>
	<li>Messen Sie Theabsorbance bei der Wellenlänge von 405 nm.</li>
</ol>(8) Western Blotting
Hinweis: Nach 6-7 Tagen der in-vitro- Kultur in der 24-Well-Platte, sollte Reifen Osteoklasten sichtbar sein.
<ol><li>Aspirieren Sie das Medium.</li>
	<li>Waschen Sie sanft mit vorgekühlten 1 x PBS 3 Mal.</li>
	<li>Aspirieren Sie PBS.</li>
	<li>100 µL 1 x SDS Lyse Puffer mit Protease-Inhibitor cocktail hinzufügen.</li>
	<li>Sammeln Hitze Lysates bei 105 ° C für 10 min und Zentrifuge bei 12.000 × g und 4 ° C für 10 min. die Überstände, die Proteine enthalten.</li>
	<li>Trennen Sie die Lysates mit 30 µg Protein durch 10 % SDS-PAGE11 und übertragen Sie dann auf eine Polyvinylidene Fluorid (PVDF) Membran.</li>
	<li>Die Membranen mit 5 % Magermilch für 30 min zu blockieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Membranen mit Anti-Raptor, Anti-P-S6, Anti-S6, Anti-β-Aktin in 1:1,000 Verdünnung über Nacht in 5 % fettfreie Milch bei 4 ° C.</li>
	<li>Waschen Sie die Membranen mit Tris gepufferte Kochsalzlösung mit Tween-20 (TBST) für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 8,9 zweimal.</li>
	<li>Die Membranen mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) inkubieren-konjugierten Anti-Maus oder Kaninchen-IgG-Antikörper bei 1:5,000 Verdünnung in 5 % Magermilch für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen Sie die Membranen 3 Mal mit TBST für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Für die Erkennung von Chemolumineszenz westlichen Chemolumineszenz HRP Substrat auf den Membranen hinzufügen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Abtropfen Sie das überschüssige Substrat und setzen Sie die Flecken auf Röntgenfilm.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).</li><li>Feng, X., McDonald, J. 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Alle Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte.

Die Osteoclastogenic-Assay ist die am weitesten verbreitete Methode zur Isolierung und Kultur Osteoklasten in-vitro-12,13. Während mehrere RANKL-basierte Osteoklasten Induktionen beschrieben13,14,15gewesen sein, beschrieben die vorliegende Studie ein Protokoll mit einigen Änderungen basierend auf den bisherigen Methoden.
In der vora...

Knochen ist ein ständig wechselnden Organ und wird von Osteoblasten und Osteoklasten zeitlebens umgebaut. Osteoklasten sind verantwortlich für mineralisierten Matrix Resorption und Osteoblasten zu synthetisieren und sezernieren neue Knochen Matrizen1. Die Balance zwischen Knochenabbau und Knochenaufbau ist entscheidend für die Knochengesundheit, einschließlich der Wartung der Knochen Masse und Reaktion auf Stimulation und Verletzungen. Wenn dieses Gleichgewicht gestört ist, kann eine Reihe von metabolischen Knochenerkrankungen wie Osteoporose und parodontale Erkrankungen auftreten. Bei diesen Erkrankungen übersteigt Knochen Masse Verlust infolge osteoclastic Knochenabbau Knochen bilden Kapazität von Osteoblasten2,3. So um pharmazeutische Ziele zur Behandlung von Skeletterkrankungen wie Osteoporose zu entwickeln, ist es wichtig zu verstehen, die Erzeugung und die Biologie der Osteoklasten4.
Osteoklasten sind einzigartige mehrkernigen Riesenzellen befindet sich an oder nahe der Knochenoberfläche und gehören zu der Familie Monocyte/Makrophagen-1. Ibbotson K. J. Et al. eine Methode zur Erzeugung Osteoklasten-wie Zellen in Vitro mit 1,25-Dihydroxy-Vitamin D35-haltigem Medium berichtet. Die Identifizierung von Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) und Rezeptor Aktivator für nukleare Faktor κ B Ligand (RANKL) als wesentliche Faktoren der Osteoklasten Bildung hat dramatisch zugenommen, die Effizienz der Osteoclastogenesis in vitro 1 , 6 , 7. die Möglichkeit, Kultur Osteoklasten in Vitro hat unser Verständnis der Generation und Regulierung der Osteoklasten verbessert.
Das Säugetier/mechanistischen Ziel von Rapamycin (mTOR) Funktionen in zwei strukturell und funktionell unterschiedliche komplexe, nämlich mTORC1 und mTORC28,9. Die zwei Multi-Protein-komplexe sind aufgrund ihrer unterschiedlichen Komponenten und nachgelagerten Substrate voneinander. mTORC1 enthält das einzigartige regulatorischen-assoziierten Protein mTOR (Raptor), während mTORC2 Rapamycin-unempfindliche Begleiter von mTOR (Rictor)9enthält. mTORC1 können integrieren und übertragen wichtige Signale, Zellwachstum, Proliferation und Differenzierung zu regulieren. Vor kurzem haben wir gezeigt, dass diese mTORC1 spielt eine Schlüsselrolle im Netzwerk der katabolen Knochenabbau durch Löschen des Raptor , mTORC1 in Osteoklasten10zu inaktivieren. Jedoch bedürfen die zugrunde liegenden Mechanismen weiterer Untersuchungen. In der vorliegenden Studie wurde eine Osteoclastogenic RANKL-basierte Methode Osteoklasten aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen (BMMs) der Wildtyp (WT) und RapCtsk Mäuse zu generieren und Untersuchung des Einflusses von mTORC1 Inaktivierung auf Osteoklasten verwendet. Bildung.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Raptorfl/fl mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>013188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ctsk-cre mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-022-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>BioInd</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse M-CSF protein</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>Q3U4F9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse RANKL protein</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>Q3TWY5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>302643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Garnet GBC Base solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrite Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naphthol AS-BI Phosphate Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tartrate solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tartaric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tartrate dibasic dehydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>s4797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase substrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Raptor</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ribosomal protein S6</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-actin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-130300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde</td>
			<td>Xilong scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>00000367MSDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX71</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-mm Syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito forcep</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rankl-based osteoclast culture assay of mouse bone marrow to investigate the role of mtorc1 in osteoclast formation

Osteoklasten sind einzigartige Knochen-resorbierbarem Zellen, die von der Monocyte/Makrophagen-Linie des Knochenmarks zu unterscheiden. Dysfunktion von Osteoklasten kann eine Reihe von metabolischen Knochenerkrankungen wie Osteoporose führen. Um pharmazeutische Ziele für die Vermeidung von krankhaften Knochenschwund Masse zu entwickeln, müssen die Mechanismen, durch die Osteoklasten aus Vorstufen unterscheiden, verstanden werden. Die Fähigkeit zu isolieren und eine große Anzahl von Osteoklasten in-vitro- Kultur ist entscheidend, um die Rolle bestimmter Gene in Osteoklasten Differenzierung bestimmen. Inaktivierung von Säugetieren/mechanistischen Ziel von Rapamycin Komplex 1 (TORC1) in Osteoklasten kann Osteoklasten Anzahl verringern und Knochenmasse zu erhöhen; jedoch bedürfen die zugrunde liegenden Mechanismen weiterer Untersuchungen. In der vorliegenden Studie wird ein RANKL-basiertes Protokoll zu isolieren und Kultur Osteoklasten aus Maus Knochenmark und Untersuchung des Einflusses von mTORC1 Inaktivierung auf Osteoklasten Formation beschrieben. Dieses Protokoll führte erfolgreich eine große Anzahl von riesigen Osteoklasten in der Regel innerhalb einer Woche. Löschen von Raptor beeinträchtigt Osteoklasten Bildung und nahm die Aktivität des sekretorischen Tartrat-resistente saure Phosphatase, anzeigend, dass mTORC1 für Osteoklasten Bildung entscheidend.

Mit Hilfe dieses Protokolls, wurden eine große Anzahl von riesigen Osteoklasten am 6. Tag gesehen; Wenn riesige Osteoklasten nicht gesehen werden, möglicherweise einen weiteren Tag der Osteoklasten Differenzierung benötigt (Abbildung 1). Erfolgreiche Osteoklasten Bildung bestätigte Falle Färbung (Abbildung 2A). Osteoklasten waren Wein rot/violett Riesenzellen mit mehr als 3 Kerne. Mehr als 250 Osteoklasten wurden in jede Ver...

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A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zum isolieren und Kultur Osteoklasten in Vitro aus Maus Knochenmark und zur Untersuchung der Rolle von Säugetieren/mechanistischen Ziel von Rapamycin Komplex 1 in Osteoklasten-Formation.

Ein RANKL-basierte Osteoklasten Kultur Assay der Maus Knochenmark zu untersuchen, die Rolle von mTORC1 in Osteoklasten Bildung

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.8K Aufrufe.  National Clinical Research Center of Stomatology. Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zum isolieren und Kultur Osteoklasten in Vitro aus Maus Knochenmark und zur Untersuchung der Rolle von Säugetieren/mechanistischen Ziel von Rapamycin Komplex 1 in Osteoklasten-Formation.

Serie: A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

Ein optogenetische Ansatz zur Abschätzung Bildung neuronaler Verbindungen in einer Co-Kultursystem

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase - a clinically approved and readily available thrombolytic drug &#8211; clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

Ein enzymatisches Verfahren zur mesenchymalen Stammzellen aus Knochenmarkproben Clotted Rettung

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Mittels konfokaler Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Um Modulatoren der Wnt und Shh Morphogen Gradienten Untersuchen

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel cell population specifically selected for growth in human serum supplemented medium. These cells are characterized by morphological, phenotypic, and molecular features distinct from MSCs and we named them Mesodermal Progenitor Cells (MPCs). MPCs are round, with a thick highly refringent core region; they show strong, trypsin resistant adherence to plastic. Failure to expand MPCs directly revealed that they are slow in cycling. This is as also suggested by Ki-67 negativity. On the other hand, culturing MPCs in standard medium designed for MSC expansion, gave rise to a population of exponentially growing MSC-like cells. Besides showing mesenchymal differentiation capacity MPCs retained angiogenic potential, confirming their multiple lineage progenitor nature. Here we describe an optimized highly reproducible protocol to isolate and characterize hBM-MPCs by flow cytometry (CD73, CD90, CD31, and CD45), nestin expression, and F-actin organization. Protocols for mesengenic and angiogenic differentiation of MPCs are also provided. Here we also suggest a more appropriate nomenclature for these cells, which has been re-named as "Mesangiogenic Progenitor Cells".

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

Isolieren von Mesangiogenic Progenitorzellen (MPL) aus menschlichem Knochenmark

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.

We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.

Kultur von murinen embryonalen Mittelfuß: ein physiologisches Modell der enchondralen Verknöcherung

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Medikamentöse Behandlung und<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging von Osteoblasten-Osteoklasten-Wechselwirkungen in Medaka-Fisch Osteoporose Modell

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

Zeitliche Reihenfolge der dynamischen Ausdruck von Daten aus Detaillierte Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

Die Stimulation der Notch-Signalweg in Maus-Osteoklasten Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global DNA methylation level of chondrocytes is considered to be a suitable biomarker for the loss of the chondrocyte phenotype. However, results based on different experimental methods can be inconsistent. Therefore, it is important to establish a precise, simple, and rapid method to quantify global DNA methylation levels during chondrocyte dedifferentiation.
Current genome-wide methylation analysis techniques largely rely on bisulfite genomic sequencing. Due to DNA degradation during bisulfite conversion, these methods typically require a large sample volume. Other methods used to quantify global DNA methylation levels include high-performance liquid chromatography (HPLC). However, HPLC requires complete digestion of genomic DNA. Additionally, the prohibitively high cost of HPLC instruments limits HPLC&#39;s wider application.
In this study, genomic DNA (gDNA) was extracted from human chondrocytes cultured with varying number of passages. The gDNA methylation level was detected using a methylation-specific dot blot assay. In this dot blot approach, a gDNA mixture containing the methylated DNA to be detected was spotted directly onto an N+ membrane as a dot inside a previously drawn circular template pattern. Compared with other gel electrophoresis-based blotting approaches and other complex blotting procedures, the dot blot method saves significant time. In addition, dot blots can detect overall DNA methylation level using a commercially available 5-mC antibody. We found that the DNA methylation level differed between the monolayer subcultures, and therefore could play a key role in chondrocyte dedifferentiation. The 5-mC dot blot is a reliable, simple, and rapid method to detect the general DNA methylation level to evaluate chondrocyte phenotype.

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

We present a method to quantify DNA methylation based on the 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We determined the 5-mC levels during chondrocyte dedifferentiation. This simple technique could be used to quickly determine the chondrocyte phenotype in ACI treatment.

Ein 5-mC-Dot-Blot-Assay, der den DNA-Methylierungsgrad der Chondrozyten-Dedifferenzierung quantifiziert<em&gt; In vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioengineering von humanisierten Knochenmark-Mikroumgebungen in der Maus und ihre Visualisierung durch Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Ein RANKL-basierte Osteoklasten Kultur Assay der Maus Knochenmark zu untersuchen, die Rolle von mTORC1 in Osteoklasten Bildung

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