Les auteurs remercient Dr Minghan Tong et S. Kato pour souris et réactifs fournissant gracieusement. Nous remercions les membres du laboratoire Zou pour des discussions fructueuses. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de 973 de programme du ministère chinois de la Science et la technologie (MOST) [2014CB964704 et 2015CB964503], programme de recherche clinique du Hospital 9e populaire, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Merci pour l’aide du laboratoire central de biologie cellulaire et Core Facility for Chemical Biology, no CAS Centre d’Excellence en cellule moléculaire Science, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Académie chinoise des Sciences.

Toutes les procédures relatives aux animaux ont été réalisés conformément au protocole approuvé par la Commission Administrative de Stanford sur Laboratory Animal Care (APLAC) et ont été approuvés par le Comité de l’utilisation de la Shanghai Institut de biochimie et de la cellule et animalier Biologie.
1. préparation
<ol><li>Générer des souris de suppression des Raptor spécifiques ostéoclastes (Raptorfl/fl; Ctsk-cre, au-delà RapCtsk) en s’accouplant souris Raptorfl/fl Ctsk-cre des souris. Utilisez les souris Raptorfl/fl sous le contrôle du poids dans cette étude.</li>
	<li>Avoir un récipient rempli de glace pour garder des os isolés.</li>
	<li>
Préparer le milieu de culture.
	<ol>
<li>Préparez milieu de culture de α-MEM en complétant le minimum indispensable moyen alpha (α-MEM) avec 1 x glutamine, pénicilline-streptomycine et 10 % de sérum de veau foetal.</li>
		<li>Préparer la moelle osseuse macrophage induction milieu composé de 50 mL de milieu de α-MEM et de M-CSF à 20 ng/mL.</li>
		<li>Préparer le milieu d’induction ostéoclastes composée de M-CSF et RANKL à 20 ng/mL, respectivement, dans 50 mL de milieu de α-MEM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparez les tampons suivants avant la coloration du piège.
	<ol>
<li>Préparer la solution de correction composée de 6,5 mL d’acétone, 2,5 mL de solution de citrate et 0,8 mL de solution de formaldéhyde (vol/vol) de 37 %.</li>
		<li>Préparer le piège solution de coloration.<ol>
<li>Préchauffer l’eau déionisée à 37 ° C.</li>
			<li>Ajouter 100 µL de solution de base rapide grenat GBC et 100 µL de solution de nitrite de sodium dans un microtube de 1,5 mL et mélanger doucement par retournements d’autorisation s. 30 le mélange reposer pendant 2 min.</li>
			<li>Réchauffer au préalable les 9 mL d’eau désionisée à 37 ° C. Ajouter 200 µL de solution de base de GBC diazoté rapide grenat de l’étape 1.4.2.2, 100 µL de solution de phosphate naphthol AS-BI, 400 µL de solution d’acétate et 200 µL de solution de tartrate.</li>
			<li>Garder le piège de la coloration de la solution de mélange dans un bain-marie à 37 ° C.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparer le tampon suivant avant la quantification de l’activité du piège du milieu de culture.
	<ol>
<li>Préparer le tampon de tartrate (50 mL) : 2 mL d’acide L-tartrique 0,33 M, 48 mL de 0,33 M de tartrate de sodium dibasique déshydrater. Ajuster le pH à 4,9.</li>
		<li>Préparer un tampon 4-nitrophényl phosphate disodique (pNPP) (200 mL) : 1,502 g de glycine, 41 mg de MgCl2, 27,2 mg ZnCl2et 180 mL d’eau désionisée. Ajuster le pH à 10.4 avec 3 M NaOH et le volume à 200 mL d’eau désionisée.</li>
		<li>Préparer les pNPP du tampon de substrat de phosphatase (pour une plaque de 96 puits) : 49,37 mg de substrat de phosphatase et 175 µL de tampon de pNPP d’étape 1.5.2.</li>
		<li>Préparer le tampon de substrat (9 plaque à 96 puits/mL) : 6,24 mL d’eau désionisée, 360 μL de solution d’acétate et 2,4 mL de tampon de tartrate. La composition de vortex et préchauffer à 37 ° C avant utilisation.</li>
		<li>Ajouter 90 μL de tampon de pNPP avec phosphatase substrate(1.5.3) dans 9ml de substrat préchauffé buffer(1.5.4) pour faire un mélange de substrat et vortexer pendant 10 s.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. dissection (jour -1)
<ol><li>Euthanasier 3 souris WT et RapCtsk femelles d’un mois par le CO2 séparément. Effectuer de CO2 par inhalation avec un équipement approprié par personnel qualifié.</li>
	<li>Immerger 6 souris dans un bécher de 100 ml d’éthanol à 75 % (vol/vol) pendant 5 min prévenir la contamination bactérienne et puis placer sur une planche de dissection dans une position couchée. Faire une incision à la distale du tibia verticalement et disséquer la peau le long de la patte avec des ciseaux ophtalmique.</li>
	<li>Couper le ligament articulaire de l’articulation de la hanche avec des ciseaux et disloquer les membres postérieurs du tronc.</li>
	<li>Couper le ligament articulaire de l’articulation du genou et dissocier soigneusement le tibia et le fémur de l’articulation du genou. Retirez doucement les tissus mous avec des ciseaux.</li>
	<li>Placer tous les os d’un génotype dans des souris dans chaque puits d’une plaque de six puits avec 2 mL de α-MEM sur la glace. Remarque : Afin de préserver la viabilité des cellules, l’OS doivent être conservé dans ces conditions pendant moins de 1 h.</li>
</ol>3. isolation (jour -1)
<ol><li>Remplissez-le d’un puits d’une plaque de six puits avec 75 % d’éthanol (3 mL) et les 5 autres puits moyen α-MEM (3 mL).</li>
	<li>Mettez tous les os d’un génotype dans le lavage de l’éthanol pour 15 s et laver les OS 5 fois avec milieu de α-MEM 10 s chaque fois.</li>
	<li>Couper les épiphyses avec le ciseaux et insérer une aiguille de seringue de 0,45 mm dans la cavité et flush moelle osseuse dehors avec moyen de α-MEM dans un tube à centrifuger de 50 mL.</li>
	<li>Rincer la cavité osseuse à l’aide de la méthode même de l’autre extrémité de l’OS. Répétez l’opération au moins deux fois pour laver la cavité de l’OS jusqu'à ce que l’os sont pâle.</li>
	<li>Centrifuger la moelle osseuse pour obtenir un culot cellulaire à 800 x g et 4 ° C pendant 5 min. aspirer le surnageant.</li>
	<li>Ajouter 3 mL de tampon de lyse des globules rouges dans le tube à centrifuger et pipette doucement pour remettre en suspension de la moelle osseuse. Maintenir le tube à centrifuger sur glace pendant 8 min à lyser les globules rouges.</li>
	<li>Ajouter 6 mL de milieu de α-MEM dans le tube à centrifuger pour arrêter la lyse cellulaire. Centrifuger à 500 x g et 4 ° C pendant 10 min et aspirer le surnageant.</li>
	<li>Resuspendre dans 3 mL de milieu de culture de α-MEM et placer les cellules dans une plaque de six puits (généralement une souris / puits).</li>
	<li>Incuber à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % du jour au lendemain.</li>
</ol>4. électrodéposition (jour 0)
<ol><li>Transférer le surnageant dans un tube à centrifuger 15 mL pour recueillir les cellules seules le lendemain matin.</li>
	<li>Centrifuger à 800 x g et 4 ° C pendant 5 min et aspirer le surnageant.</li>
	<li>Resuspendre dans 4 mL de milieu de culture de α-MEM.</li>
	<li>Prenez 20 µL de la solution de la cellule et mélanger avec 20 µL du bleu Trypan. Ajouter 10 µL du mélange dans la chambre de comptage et d’obtenir le nombre de cellules par mL de solution.</li>
	<li>Ajouter un volume approprié de milieu de culture de α-MEM pour obtenir une solution portable de 500 000 cellules/mL.</li>
	<li>Ajouter 500 µL et 50 µL de milieu d’induction de la moelle osseuse macrophage dans chaque puits d’une plaque 24 puits et la plaque à 96 puits, respectivement.</li>
	<li>Ajouter 500 µL et 50 µL de solution de cellule dans chaque puits d’une plaque 24 puits et la plaque à 96 puits, respectivement.</li>
	<li>Incuber à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % pendant 3 jours.</li>
</ol>5. différenciation (3-7 jours)
<ol><li>Trois jours après l’ensemencement, recueillir 50 µL de milieu de chaque puits de la plaque à 96 puits et congeler à-20 ° C et puis aspirer le milieu résiduel.</li>
	<li>Ajouter 1 mL et 100 µL de milieu d’ostéoclastes induction dans chaque puits d’une plaque 24 puits et une plaque à 96 puits, respectivement.</li>
	<li>Incuber à 37 ° C pendant 2 jours.</li>
	<li>Collecter 50 µL de milieu de chaque puits et aspirer le milieu résiduel.</li>
	<li>Ajouter milieu inducteur ostéoclastes dans chaque puits.</li>
	<li>Incuber à 37 ° C pendant 1 nuit. Remarque : À ce moment, gros, multinucléées ostéoclastes devraient être considérés sous un microscope inversé (Figure 2 a).</li>
	<li>Si les ostéoclastes ne sont pas visibles, changer le milieu inducteur ostéoclastes et observer tous les jours jusqu'à ce que les ostéoclastes sont visibles.</li>
	<li>Recueillir 50 µL de milieu de chaque puits de la plaque à 96 puits après que les ostéoclastes ont formé.</li>
</ol>6. tartrate Resistant Acid Phosphatase (TRAP) coloration
Remarque : Les ostéoclastes matures peuvent être présents après 6-7 jours de la culture in vitro (étape 4).
<ol><li>Aspirer les moyen et laver doucement 3 fois avec 1 x PBS.</li>
	<li>Fixer les cellules dans chaque puits de la plaque à 96 puits avec 100 µL de solution de 30 s à température ambiante.</li>
	<li>Après fixation, aspirer la solution fix et laver doucement 3 fois avec de l’eau désionisée préchauffé à 37 ° C. Aspirer l’eau déionisée.</li>
	<li>Ajouter 100 µL de tache de piège dans chaque puits de la plaque à 96 puits et placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant 30 min et bouclier de lumière.</li>
	<li>Après coloration, aspirer la tache de piège et laver délicatement 3 fois avec de l’eau désionisée.</li>
	<li>Ostéoclastes d’image à l’aide d’un microscope inversé à un grossissement de 40 X.</li>
</ol>7. piège Quantification de l’activité du milieu de Culture
<ol><li>Récupérer le surnageant de culture 30 µL de chaque puits de la plaque à 96 puits de l’étape 5.1, 5.4 et 5.8 ; Utilisez 30 µL de milieu d’induction ostéoclastes non fermentés comme contrôle négatif. Placer les échantillons dans une nouvelle plaque de 96 puits.</li>
	<li>Ajouter 90 μl de substrat mixture(1.5.5) dans chaque puits de la plaque à 96 puits.</li>
	<li>Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 h et bouclier de lumière.</li>
	<li>Arrêter la réaction en ajoutant 50 µL de 3 M NaOH dans chaque puits de la plaque à 96 puits.</li>
	<li>Mesurer theabsorbance à la longueur d’onde de 405 nm.</li>
</ol>8. Western Blot
Remarque : Après 6-7 jours de culture in vitro la plaque 24 puits, les ostéoclastes matures doivent être visibles.
<ol><li>Aspirez le milieu.</li>
	<li>Laver doucement avec un refroidissement préalable 1 x PBS 3 fois.</li>
	<li>Aspirer le PBS.</li>
	<li>Ajouter 100 µL de 1 x SDS lyse tampon contenant inhibiteur de protéase cocktail.</li>
	<li>Lysats de chaleur à 105 ° C pendant 10 min et centrifuger à 12 000 × g et 4 ° C pendant 10 min. recueillent le surnageant contenant des protéines.</li>
	<li>Séparez les lysats contenant 30 µg de protéines en 10 % SDS-PAGE11 et puis transférer sur une membrane de Polyfluorure de vinylidène (PVDF).</li>
	<li>Bloquer les membranes avec 5 % de lait pendant 30 min.</li>
	<li>Incuber les membranes avec anti-Raptor, anti-P-S6, S6-anti, anti-β-actine à la dilution de 1 : 1 000 à 5 % de lait à 4 ° C durant la nuit.</li>
	<li>Lavage des membranes avec Tris Buffered Saline avec Tween-20 (TBST) pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Répétez l’étape 8,9 deux fois.</li>
	<li>Incuber les membranes avec la peroxydase de raifort (HRP)-conjugués d’anticorps IgG anti-souris ou lapin 1:5,000 dilution à 5 % de lait pendant 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Laver les membranes 3 fois avec un mélange TBST pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Pour la détection par chimiluminescence, ajouter Ouest substrat HRP chimiluminescent sur les membranes et incuber pendant 5 min à température ambiante. Égoutter l’excès substrat et exposer les taches à la radiographie.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).</li><li>Feng, X., McDonald, J. 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Tous les auteurs affirment qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêt.

L’essai d’osteoclastogenic est la méthode la plus largement utilisée d’isoler et de culture d’ostéoclastes in vitro12,,13. Alors que plusieurs cérémonies d’installation des ostéoclastes axée sur le RANKL ont été décrits13,14,15, la présente étude décrit un protocole avec quelques modifications basées sur les méthodes précédentes.
<...

OS est un organe en constante évolution et est remodelée par les ostéoblastes et les ostéoclastes tout au long de la vie. Les ostéoclastes sont responsables de la résorption de la matrice minéralisée et ostéoblastes synthétisent et sécrètent des nouveaux OS matrices1. L’équilibre entre la résorption et formation osseuse est cruciale pour la santé osseuse, y compris l’entretien des os masse et réponse à la stimulation et de blessures. Si cet équilibre est rompu, une série de maladies métaboliques des os peut se produire, y compris l’ostéoporose et les maladies parodontales. Dans ces maladies, la perte de masse osseuse résultant de la résorption osseuse ostéoclastique dépasse les os formant la capacité des ostéoblastes2,3. Ainsi, afin d’élaborer des cibles pharmaceutiques pour traiter des troubles squelettiques telles que l’ostéoporose, il est essentiel de comprendre la génération et la biologie des ostéoclastes4.
Les ostéoclastes sont des cellules multinucléées géants uniques situés à ou près de la surface osseuse et appartiennent à la famille de monocytes/macrophages1. Ibbotson K. J. et al. a signalé une méthode pour générer des cellules semblables à des ostéoclastes in vitro avec un milieu contenant 1, 25-dihydroxy-vitamine D35. L’identification du facteur stimulant de macrophage-colony (M-CSF) et activateur du récepteur pour le ligand de facteur nucléaire-κ B (RANKL) comme facteurs essentiels de la formation des ostéoclastes a considérablement accru l’efficacité des osteoclastogenesis in vitro 1 , 6 , 7. la capacité de la culture les ostéoclastes in vitro a amélioré notre compréhension de la génération et la réglementation des ostéoclastes.
La cible mammifère/mécaniste de la rapamycine (mTOR) fonctions dans deux complexes structurellement et fonctionnellement distinctes, à savoir mTORC1 et mTORC28,9. Les deux complexes de protéines multiples sont distincts les uns des autres en raison de leurs différents composants et des substrats en aval. mTORC1 contient la protéine associée à la réglementation unique de mTOR (rapace), tandis que mTORC2 contient la rapamycine insensible compagnon de mTOR (Rictor)9. mTORC1 peut intégrer et transmettre des signaux importants pour réguler la croissance cellulaire, la prolifération et la différenciation. Récemment, nous avons démontré que mTORC1 joue un rôle clé dans le réseau de la résorption osseuse catabolique par suppression du Raptor pour inactiver les mTORC1 dans les ostéoclastes10. Cependant, les mécanismes sous-jacents nécessitent une étude plus approfondie. Dans la présente étude, une méthode axée sur le RANKL osteoclastogenic a été utilisée pour générer des ostéoclastes de macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMMs) de type sauvage (WT) et de la souris Ctsk de Rap et d’étudier l’influence de l’inactivation de mTORC1 sur les ostéoclastes formation.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Raptorfl/fl mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>013188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ctsk-cre mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-022-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>BioInd</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse M-CSF protein</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>Q3U4F9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse RANKL protein</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>Q3TWY5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>302643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Garnet GBC Base solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrite Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naphthol AS-BI Phosphate Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tartrate solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tartaric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tartrate dibasic dehydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>s4797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase substrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Raptor</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ribosomal protein S6</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-actin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-130300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde</td>
			<td>Xilong scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>00000367MSDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX71</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-mm Syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito forcep</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rankl-based osteoclast culture assay of mouse bone marrow to investigate the role of mtorc1 in osteoclast formation

Les ostéoclastes sont unique-résorption osseuse des cellules qui se différencient de la lignée des monocytes/macrophages de la moelle osseuse. Une série de maladies métaboliques des os, dont l’ostéoporose peut entraîner un dysfonctionnement des ostéoclastes. Pour développer des cibles pharmaceutiques pour la prévention de la perte de masse osseuse pathologique, faut comprendre les mécanismes par lesquels les ostéoclastes différencient des précurseurs. La capacité d’isoler et de la culture d’un grand nombre d’ostéoclastes in vitro est cruciale afin de déterminer le rôle des gènes spécifiques dans la différenciation des ostéoclastes. Inactivation de la cible mammifère/mécaniste de la rapamycine complexe 1 (TORC1) dans les ostéoclastes peut diminuer le nombre d’ostéoclastes et augmenter la masse osseuse ; Cependant, les mécanismes sous-jacents nécessitent une étude plus approfondie. Dans la présente étude, on décrit un protocole RANKL d’isoler et de culture d’ostéoclastes de moelle osseuse de souris et d’étudier l’influence de l’inactivation de mTORC1 sur la formation des ostéoclastes. Ce protocole a permis avec succès dans un grand nombre des ostéoclastes géants, en général sous huitaine. Suppression du Raptor avec facultés affaiblies de la formation des ostéoclastes et diminue l’activité de sécrétion phosphatases acides tartrate-résistantes, qui indique que mTORC1 est essentielle pour la formation des ostéoclastes.

En utilisant le présent protocole, un grand nombre des ostéoclastes géants ont été vus le jour 6 ; Si des ostéoclastes géants ne sont pas vus, un jour de plus de différenciation ostéoclastique peut être nécessaire (Figure 1). Formation des ostéoclastes réussie a été confirmée par piège coloration (Figure 2 a). Les ostéoclastes étaient des cellules géantes de rouge/pourpre vins avec plus de 3 noyaux. Plus de 2...

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A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Ce manuscrit décrit un protocole d’isolat et la culture les ostéoclastes in vitro de la moelle osseuse de souris et d’étudier le rôle de la cible mammifère/mécaniste de la rapamycine complexe 1 dans la formation des ostéoclastes.

Une base RANKL Osteoclast Culture dosage de moelle osseuse de souris pour enquêter sur le rôle de mTORC1 dans la Formation des ostéoclastes

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

a-rankl-based-osteoclast-culture-assay-mouse-bone-marrow-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.7K vues.  National Clinical Research Center of Stomatology. Ce manuscrit décrit un protocole d’isolat et la culture les ostéoclastes in vitro de la moelle osseuse de souris et d’étudier le rôle de la cible mammifère/mécaniste de la rapamycine complexe 1 dans la formation des ostéoclastes.

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An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

Une approche pour l&#39;évaluation optogénétiques formation des connexions neuronales dans un système de co-culture

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Recherche

Biologie du développement

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase - a clinically approved and readily available thrombolytic drug &#8211; clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

Une méthode enzymatique pour secourir Cellules souches mésenchymateuses à partir d&#39;échantillons coagulés moelle osseuse

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Utilisation de l&#39;analyse confocale<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Chargé d&#39;enquêter sur les modulateurs de Wnt et Shh morphogène Dégradés

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel cell population specifically selected for growth in human serum supplemented medium. These cells are characterized by morphological, phenotypic, and molecular features distinct from MSCs and we named them Mesodermal Progenitor Cells (MPCs). MPCs are round, with a thick highly refringent core region; they show strong, trypsin resistant adherence to plastic. Failure to expand MPCs directly revealed that they are slow in cycling. This is as also suggested by Ki-67 negativity. On the other hand, culturing MPCs in standard medium designed for MSC expansion, gave rise to a population of exponentially growing MSC-like cells. Besides showing mesenchymal differentiation capacity MPCs retained angiogenic potential, confirming their multiple lineage progenitor nature. Here we describe an optimized highly reproducible protocol to isolate and characterize hBM-MPCs by flow cytometry (CD73, CD90, CD31, and CD45), nestin expression, and F-actin organization. Protocols for mesengenic and angiogenic differentiation of MPCs are also provided. Here we also suggest a more appropriate nomenclature for these cells, which has been re-named as "Mesangiogenic Progenitor Cells".

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

Isoler cellules progénitrices Mesangiogenic (PPM) de Human Bone Marrow

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.

We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.

Culture de murines embryonnaires Métatarsiens: un modèle physiologique de endochondrale ossification

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Traitement de la toxicomanie et<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie des ostéoblastes-ostéoclastes Interactions dans un modèle Medaka poisson Ostéoporose

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

Commande temporelle des données d&#39;expression dynamique d&#39;expression spatiale détaillée Plans

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

Stimulation de Notch Signalisation dans Souris ostéoclastes Précurseurs

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global DNA methylation level of chondrocytes is considered to be a suitable biomarker for the loss of the chondrocyte phenotype. However, results based on different experimental methods can be inconsistent. Therefore, it is important to establish a precise, simple, and rapid method to quantify global DNA methylation levels during chondrocyte dedifferentiation.
Current genome-wide methylation analysis techniques largely rely on bisulfite genomic sequencing. Due to DNA degradation during bisulfite conversion, these methods typically require a large sample volume. Other methods used to quantify global DNA methylation levels include high-performance liquid chromatography (HPLC). However, HPLC requires complete digestion of genomic DNA. Additionally, the prohibitively high cost of HPLC instruments limits HPLC&#39;s wider application.
In this study, genomic DNA (gDNA) was extracted from human chondrocytes cultured with varying number of passages. The gDNA methylation level was detected using a methylation-specific dot blot assay. In this dot blot approach, a gDNA mixture containing the methylated DNA to be detected was spotted directly onto an N+ membrane as a dot inside a previously drawn circular template pattern. Compared with other gel electrophoresis-based blotting approaches and other complex blotting procedures, the dot blot method saves significant time. In addition, dot blots can detect overall DNA methylation level using a commercially available 5-mC antibody. We found that the DNA methylation level differed between the monolayer subcultures, and therefore could play a key role in chondrocyte dedifferentiation. The 5-mC dot blot is a reliable, simple, and rapid method to detect the general DNA methylation level to evaluate chondrocyte phenotype.

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

We present a method to quantify DNA methylation based on the 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We determined the 5-mC levels during chondrocyte dedifferentiation. This simple technique could be used to quickly determine the chondrocyte phenotype in ACI treatment.

Un dosage de point à 5 mC Quantification du niveau de méthylation d&#39;ADN de la Dedifférenciation des chondrocytes<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioingénierie des microenvironnements humanisés de la moelle osseuse dans la souris et leur visualisation par imagerie en direct

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Une base RANKL Osteoclast Culture dosage de moelle osseuse de souris pour enquêter sur le rôle de mTORC1 dans la Formation des ostéoclastes

PLAYLIST