Gli autori ringraziano il Dr. Minghan Tong e S. Kato per topi e gentilmente fornendo reagenti. Ringraziamo i membri del laboratorio Zou per utili discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni da 973 programma dal Ministero cinese della scienza e tecnologia (MOST) [2014CB964704 e 2015CB964503], programma di ricerca clinica dell'ospedale di 9 persone, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Grazie per l'aiuto della funzione di memoria per biologia cellulare e funzione di memoria per biologia chimica, CAS Center for Excellence in molecolare di Cell Science, Shanghai Institute di biochimica e biologia cellulare, Accademia cinese delle scienze.

Tutte le procedure relative agli animali sono state eseguite secondo il protocollo approvato dal pannello amministrativo, Stanford su cura degli animali di laboratorio (APLAC) e sono state approvate dal comitato di uso della Shanghai Istituto di biochimica e cellulare e cura degli animali Biologia.
1. preparazione
<ol><li>Generare degli osteoclasti specifico Raptor eliminazione topi (Raptorfl/fl; Ctsk-cre, aldilà RapCtsk) dall'accoppiamento Raptorfl/fl topi con Ctsk-cre topi. Utilizzare i mouse Raptorfl/fl come controllo WT in questo studio.</li>
	<li>Dispone di un contenitore con ghiaccio per mantenere isolato dell'osso.</li>
	<li>
Preparare il terreno di coltura.
	<ol>
<li>Preparare il terreno di coltura α-MEM completando il minimo essenziale alfa medio (α-MEM) 1 x glutammina, penicillina-streptomicina e 10% di siero fetale di vitello.</li>
		<li>Preparare il supporto di induzione di macrofago del midollo osseo costituito da 50 mL di medium di α-MEM e M-CSF a 20 ng/mL.</li>
		<li>Preparare il supporto di induzione di osteoclasto consistente di M-CSF e RANKL a 20 ng/mL, rispettivamente, in 50 mL di terreno di α-MEM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare i buffer seguenti prima della colorazione della trappola.
	<ol>
<li>Preparare la soluzione di fix composto da 6,5 mL di acetone, 2,5 mL di soluzione di citrato e 0,8 mL di soluzione (vol/vol) formaldeide al 37%.</li>
		<li>Preparare la trappola soluzione di colorazione.<ol>
<li>Preriscaldare la acqua deionizzata a 37 ° C.</li>
			<li>Aggiungere 100 µ l di soluzione di base fast garnet GBC e 100 µ l di soluzione di nitrito di sodio in una microprovetta 1,5 mL e mescolare capovolgendo delicatamente per 30 s. lasciate il composto riposare per 2 min.</li>
			<li>Preriscaldare la 9 mL di acqua deionizzata a 37 ° C. Aggiungere 200 µ l di soluzione di diazotized fast garnet GBC base dal punto 1.4.2.2, 100 µ l di soluzione di fosfato del naftolo AS-BI, 400 µ l di soluzione di acetato e 200 µ l di soluzione di tartrato.</li>
			<li>Mantenere la trappola macchiatura soluzione di miscela in un bagno di acqua a 37 ° C.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare il tampone di seguenti prima di quantificazione di attività di trappola del terreno di coltura.
	<ol>
<li>Preparare il tampone di tartrato (50 mL): 2 mL di acido L-tartarico 0,33 M, 48 mL di 0,33 M tartrato di sodio bibasico disidratare. Regolare il pH a 4.9.</li>
		<li>Preparare 4-nitrofenil fosfato disodico (pNPP) tampone (200 mL): 1,502 g di glicina, 41 mg di MgCl2, 27,2 mg di ZnCl2e 180 mL di acqua deionizzata. Regolare il pH a 10.4 con 3 M NaOH e il volume di 200 mL con acqua deionizzata.</li>
		<li>Preparare il tampone di pNPP con substrato fosfatasi (per una piastra a 96 pozzetti): 49,37 mg di substrato fosfatasi e 175 µ l di tampone di pNPP di passaggio 1.5.2.</li>
		<li>Preparare il tampone substrato (9 mL/96 pozzetti): 6,24 mL di acqua deionizzata, 360 μL di soluzione di acetato e 2,4 mL di tampone tartrato. Mescolare Vortex e preriscaldate a 37 ° C prima dell'uso.</li>
		<li>Aggiungere 90 μL di tampone di pNPP con fosfatasi substrate(1.5.3) a 9ml di substrato preriscaldato buffer(1.5.4) per fare una miscela di substrato e vortexare per 10 s.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. dissezione (giorno -1)
<ol><li>Eutanasia 3 topi femminili della WT e RapCtsk del one-month-old di CO2 separatamente. Eseguire l'inalazione di CO2 con attrezzature adeguate da personale addestrato.</li>
	<li>Immergere 6 topi in un becher con 100 mL di etanolo al 75% (vol/vol) per 5 min prevenire la contaminazione batterica e poi posto su una tavola di dissezione in posizione supina. Fare un'incisione presso il distale della tibia verticalmente e sezionare la pelle lungo l'arto con forbici oftalmiche.</li>
	<li>Tagliare il legamento articolare dell'articolazione dell'anca con le forbici e dislocare le zampe dal tronco.</li>
	<li>Tagliare il legamento articolare dell'articolazione del ginocchio e attentamente dissociare la tibia e femore al giunto di ginocchio. Rimuovere delicatamente il tessuto molle con le forbici.</li>
	<li>Posizionare tutte le ossa di un genotipo in un mouse a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con 2 mL di α-MEM sul ghiaccio. Nota: Per mantenere la vitalità cellulare, l'osso dovrebbe essere mantenuto in queste condizioni per meno di 1 h.</li>
</ol>3. isolamento (giorno -1)
<ol><li>Riempire un pozzetto di una piastra di sei pozzetti con etanolo di 75% (3 mL) e le altre 5 pozzi con mezzo di α-MEM (3 mL).</li>
	<li>Mettere tutte le ossa di un genotipo nel lavaggio di etanolo per 15 ossa s e lavare 5 volte con mezzo di α-MEM per 10 s ogni volta.</li>
	<li>Tagliare delle epifisi con la forbice e inserire un ago di siringa di 0,45 mm la cavità e a filo del midollo osseo fuori con il mezzo di α-MEM in una provetta da centrifuga da 50 mL.</li>
	<li>Sciacquare la cavità dell'osso usando lo stesso metodo da altra estremità dell'osso. Ripetere almeno due volte per lavare accuratamente la cavità dell'osso fino a quando l'osso è pallido.</li>
	<li>Centrifugare il midollo osseo per ottenere un pellet cellulare a 800 x g e a 4 ° C per 5 min, aspirare il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 3 mL di tampone di lisi delle cellule di anima rosse nella provetta da centrifuga e pipetta dolcemente per risospendere il midollo osseo. Tenere la provetta da centrifuga sul ghiaccio per 8 min a lisare cellule rosse del sangue.</li>
	<li>Aggiungere 6 mL di terreno di α-MEM nella provetta da centrifuga per interrompere lisi cellulare. Centrifugare a 500 x g e a 4 ° C per 10 min e aspirare il supernatante.</li>
	<li>Risospendere in 3 mL di terreno di coltura di α-MEM e inserire le celle in una piastra a 6 pozzetti (generalmente un mouse per pozzetto).</li>
	<li>Incubare a 37 ° C in un incubatore a CO2 5% durante la notte.</li>
</ol>4. placcatura (giorno 0)
<ol><li>Trasferire il surnatante in una provetta per centrifuga 15 mL per raccogliere le cellule non attaccate la mattina successiva.</li>
	<li>Centrifugare a 800 x g e a 4 ° C per 5 min e aspirare il supernatante.</li>
	<li>Risospendere in 4 mL di terreno di coltura di α-MEM.</li>
	<li>Prendere 20 µ l della soluzione cella e mescolare con 20 µ l di Trypan Blue. Aggiungere 10 µ l della miscela nella camera di conteggio e ottenere il conteggio delle cellule per mL di soluzione.</li>
	<li>Aggiungere un volume adeguato di α-MEM di coltura per ottenere una soluzione di cella di 500.000 cellule/mL.</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l e 50 µ l di terreno di induzione di midollo osseo del macrofago in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e piastra a 96 pozzetti, rispettivamente.</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l e 50 µ l di soluzione di cella in ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e piastra a 96 pozzetti, rispettivamente.</li>
	<li>Incubare a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 per 3 giorni.</li>
</ol>5. differenziazione (giorni 3-7)
<ol><li>Tre giorni dopo il placcaggio, raccogliere medio di 50 µ l di ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti e congelare a-20 ° C e quindi aspirare il mezzo residuo.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL e 100 µ l degli osteoclasti induzione media in tutti i pozzetti di una piastra a 24 pozzetti e una piastra a 96 pozzetti, rispettivamente.</li>
	<li>Incubare a 37 ° C per 2 giorni.</li>
	<li>Raccogliere 50 µ l di terreno da ogni pozzetto e aspirare il mezzo residuo.</li>
	<li>Aggiungere mezzo induzione degli osteoclasti in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Incubare a 37 ° C per 1 giorni. Nota: A questo punto del tempo, grandi, multinucleated osteoclasti dovrebbero essere visto sotto un microscopio invertito (Figura 2A).</li>
	<li>Se non si vedono gli osteoclasti, cambiare il mezzo di induzione degli osteoclasti e osservare quotidianamente fino a quando gli osteoclasti sono visti.</li>
	<li>Raccogliere 50 µ l di terreno da ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti dopo gli osteoclasti sono formate.</li>
</ol>6. tartrato fosfatasi acida resistente (TRAP) colorazione
Nota: Gli osteoclasti maturi possono essere presenti dopo 6-7 giorni di coltura in vitro (passaggio 4).
<ol><li>Medio di aspirare e lavare delicatamente 3 volte con 1x PBS.</li>
	<li>Fissare le cellule in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti con 100 µ l di soluzione di correzione per 30 s a temperatura ambiente.</li>
	<li>Dopo la fissazione, aspirare la soluzione di fix e lavare delicatamente 3 volte con acqua deionizzata preriscaldata a 37 ° C. Aspirare acqua deionizzata.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di macchia TRAP in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti e posizionare la piastra in un incubatore a 37 ° C per 30 min e scudo dalla luce.</li>
	<li>Dopo la colorazione, aspirare la macchia di trappola e delicatamente lavare 3 volte con acqua deionizzata.</li>
	<li>Osteoclasti immagine utilizzando un microscopio invertito a 40 ingrandimenti.</li>
</ol>7. trappola attività quantificazione del terreno di coltura
<ol><li>Raccogliere il supernatante di coltura di 30 µ l di ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti dal passaggio 5.1, 5.4 e 5.8; Utilizzare 30 µ l di terreno di induzione di osteoclasto non coltivate come controllo negativo. Posizionare i campioni in una nuova piastra a 96 pozzetti.</li>
	<li>Aggiungere 90 μL di mixture(1.5.5) di substrato in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti.</li>
	<li>Posizionare la piastra in un incubatore a 37 ° C per 1 h e scudo dalla luce.</li>
	<li>Fermare la reazione aggiungendo 50 µ l di 3 M NaOH in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti.</li>
	<li>Misurare la theabsorbance alla lunghezza d'onda di 405 nm.</li>
</ol>8. Western Blotting
Nota: Dopo 6-7 giorni di cultura in vitro della piastra a 24 pozzetti, osteoclasti maturi dovrebbero essere visibili.
<ol><li>Aspirare il mezzo.</li>
	<li>Lavare delicatamente con pre-raffreddata 1X PBS 3 volte.</li>
	<li>Aspirare il PBS.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di 1 x SDS lysis buffer contenente l'inibitore della proteasi cocktail.</li>
	<li>Lisati di calore a 105 ° C per 10 min e centrifugare a 12.000 × g e 4 ° C per 10 min. raccogliere i surnatanti contenenti proteine.</li>
	<li>Separare i lisati contenenti 30 µ g di proteina di 10% SDS-PAGE11 e poi il trasferimento ad una membrana di polivinilidene fluoruro (PVDF).</li>
	<li>Bloccare le membrane con 5% latte scremato per 30 min.</li>
	<li>Incubare le membrane con anti-Raptor, anti-P-S6, anti-S6, anti-β-actina a diluizione 1:1,000 in 5% latte scremato a 4 ° C durante la notte.</li>
	<li>Lavare le membrane con Tris isotonico con Tween-20 (TBST) per 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 8,9 due volte.</li>
	<li>Incubare le membrane con perossidasi di rafano (HRP)-coniugato gli anticorpi di IgG anti-topo o coniglio alla diluizione di 1:5,000 in 5% latte scremato per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare le membrane 3 volte con TBST per 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Per rilevazione chemiluminescente, aggiungere substrato chemiluminescente occidentale di HRP sulle membrane e incubare per 5 min a temperatura ambiente. Drenare il substrato in eccesso ed esporre le macchie a pellicola di raggi x.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).</li><li>Feng, X., McDonald, J. 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Tutti gli autori dichiarano che non hanno conflitti di interesse.

Il dosaggio di osteoclastogenico è il metodo più utilizzato per isolare e cultura gli osteoclasti in vitro12,13. Mentre diversi induzioni degli osteoclasti RANKL-base sono stati descritti13,14,15, lo studio presente ha descritto un protocollo con alcune modifiche sulla base dei metodi precedenti.
Nello studio precedente, saggi erano...

Dell'osso è un organo mutevole ed è ristrutturato da osteoblasti e osteoclasti per tutta la vita. Gli osteoclasti sono responsabili del riassorbimento di matrice mineralizzata e osteoblasti sintetizzano e secernono nuovo osso matrici1. L'equilibrio tra la formazione dell'osso e riassorbimento dell'osso è cruciale per salute dell'osso, compreso il mantenimento di ossa massa e la risposta alla stimolazione e lesioni. Se questo equilibrio viene interrotto, può verificarsi una serie di malattie metaboliche dell'osso, compreso l'osteoporosi e le malattie parodontali. In queste malattie, perdita di massa ossea derivante da riassorbimento osteoclastic dell'osso supera l'osso formando la capacità di osteoblasti2,3. Così, al fine di sviluppare obiettivi farmaceutici per il trattamento di patologie ossee come l'osteoporosi, è fondamentale per capire la generazione e la biologia di osteoclasti4.
Gli osteoclasti sono cellule multinucleated giganti uniche situate in o vicino alla superficie dell'osso e appartengono alla famiglia del monocito/macrofago1. Ibbotson K. J. et al. segnalato un metodo per generare osteoclast-come le cellule in vitro con mezzo contenente 1,25-diidrossi-vitamina D35. L'identificazione del fattore di stimolazione della macrofago-colonia (M-CSF) e attivatore del recettore per il ligando di nuclear factor-κ B (RANKL) come fattori essenziali della formazione degli osteoclasti è aumentato drammaticamente l'efficienza di osteoclastogenesi in vitro 1 , 6 , 7. la capacità di cultura osteoclasti in vitro ha migliorato la nostra comprensione della generazione e regolamento degli osteoclasti.
La destinazione dei mammiferi/meccanicistica rapamycin (mTOR) funzioni in due complessi strutturalmente e funzionalmente distinte, vale a dire mTORC1 e mTORC28,9. I due complessi della multi-proteina sono distinti gli uni dagli altri a causa dei loro diversi componenti e substrati a valle. mTORC1 contiene la proteina unica regolamentazione-collegata di mTOR (Raptor), mentre mTORC2 contiene il compagno rapamicina-insensibile di mTOR (Rictor)9. mTORC1 è in grado di integrare e trasmettere segnali importanti per regolare la crescita cellulare, la proliferazione e la differenziazione. Recentemente, abbiamo dimostrato che mTORC1 svolge un ruolo chiave nella rete di riassorbimento dell'osso catabolico dall'eliminazione di Raptor per inattivare mTORC1 in osteoclasti10. Tuttavia, i meccanismi di fondo richiedono ulteriore studio. Nel presente studio, un metodo basato su RANKL osteoclastogenico è stato usato per generare gli osteoclasti da derivate da midollo osseo macrofagi (saggi) di wild-type (WT) e topi RapCtsk e di studiare l'influenza di inattivazione di mTORC1 su osteoclasto formazione.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Raptorfl/fl mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>013188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ctsk-cre mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-022-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>BioInd</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse M-CSF protein</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>Q3U4F9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse RANKL protein</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>Q3TWY5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>302643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Garnet GBC Base solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrite Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naphthol AS-BI Phosphate Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tartrate solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tartaric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tartrate dibasic dehydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>s4797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase substrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Raptor</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ribosomal protein S6</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-actin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-130300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde</td>
			<td>Xilong scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>00000367MSDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX71</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-mm Syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito forcep</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rankl-based osteoclast culture assay of mouse bone marrow to investigate the role of mtorc1 in osteoclast formation

Gli osteoclasti sono unico osso-resorbing cellule che si differenziano da monocito/macrofagica del midollo osseo. Una serie di malattie metaboliche dell'osso, compreso osteoporosi può provocare disfunzione degli osteoclasti. Per sviluppare obiettivi farmaceutici per la prevenzione della perdita di massa ossea patologica, si devono intendere i meccanismi da cui gli osteoclasti differenziano dai precursori. La capacità di isolare e un gran numero di osteoclasti in vitro della coltura è fondamentale al fine di determinare il ruolo di geni specifici nel corso del differenziamento degli osteoclasti. Inattivazione del mammiferi/meccanicistica bersaglio della rapamicina complesso 1 (TORC1) in osteoclasti può diminuire il numero degli osteoclasti e aumentare la massa ossea; Tuttavia, i meccanismi di fondo richiedono ulteriore studio. Nello studio presente, un protocollo basato su RANKL per isolare e cultura osteoclasti da midollo osseo di topo e di studiare l'influenza di inattivazione di mTORC1 sulla formazione degli osteoclasti è descritto. Questo protocollo ha provocato con successo un gran numero di osteoclasti giganti, in genere entro una settimana. Eliminazione di Raptor alterata formazione di osteoclasti ed ha fatto diminuire l'attività secretiva fosfatasi acida tartrato-resistente, che indica che mTORC1 è essenziale per la formazione degli osteoclasti.

Utilizzando il presente protocollo, un gran numero di osteoclasti giganti sono stato veduto il giorno 6; Se non si vedono gli osteoclasti giganti, un altro giorno di differenziazione di osteoclasto può essere necessari (Figura 1). Formazione di osteoclasti successo è stata confermata dalla trappola macchiatura (Figura 2A). Osteoclasts erano cellule giganti di vino rosso/viola con più di 3 nuclei. Più di 250 osteoclasti sono s...

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A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Questo manoscritto descrive un protocollo a isolare e cultura gli osteoclasti in vitro da midollo osseo di topo e di studiare il ruolo della destinazione dei mammiferi/meccanicistica della rapamicina complesso 1 nella formazione degli osteoclasti.

Un base di RANKL Osteoclast cultura Assay di midollo osseo del topo per studiare il ruolo di mTORC1 nella formazione degli osteoclasti

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.8K Views.  National Clinical Research Center of Stomatology. Questo manoscritto descrive un protocollo a isolare e cultura gli osteoclasti in vitro da midollo osseo di topo e di studiare il ruolo della destinazione dei mammiferi/meccanicistica della rapamicina complesso 1 nella formazione degli osteoclasti.

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An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

Un approccio per la valutazione optogenetic Formazione di connessioni neuronali in un sistema di co-coltura

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase - a clinically approved and readily available thrombolytic drug &#8211; clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

Un metodo enzimatico per salvare cellule staminali mesenchimali da coagulata midollo osseo da analizzare

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Utilizzando Analisi confocale di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Per Indagare modulatori di Wnt e Shh morphogen gradienti

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel cell population specifically selected for growth in human serum supplemented medium. These cells are characterized by morphological, phenotypic, and molecular features distinct from MSCs and we named them Mesodermal Progenitor Cells (MPCs). MPCs are round, with a thick highly refringent core region; they show strong, trypsin resistant adherence to plastic. Failure to expand MPCs directly revealed that they are slow in cycling. This is as also suggested by Ki-67 negativity. On the other hand, culturing MPCs in standard medium designed for MSC expansion, gave rise to a population of exponentially growing MSC-like cells. Besides showing mesenchymal differentiation capacity MPCs retained angiogenic potential, confirming their multiple lineage progenitor nature. Here we describe an optimized highly reproducible protocol to isolate and characterize hBM-MPCs by flow cytometry (CD73, CD90, CD31, and CD45), nestin expression, and F-actin organization. Protocols for mesengenic and angiogenic differentiation of MPCs are also provided. Here we also suggest a more appropriate nomenclature for these cells, which has been re-named as "Mesangiogenic Progenitor Cells".

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

Isolare le cellule progenitrici Mesangiogenic (PPM) da midollo osseo umano

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.

We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.

Cultura della murini embrionali Metatarso: Un modello fisiologico di endocondrale Ossificazione

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Il trattamento di droga e<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging di osteoblasti-osteoclasti interazioni in un modello di Medaka pesce osteoporosi

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

Temporale ordinazione di espressione Dynamic Data di espressione spaziale dettagliata Mappe

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

La stimolazione di Notch segnalazione in mouse osteoclasti Precursori

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global DNA methylation level of chondrocytes is considered to be a suitable biomarker for the loss of the chondrocyte phenotype. However, results based on different experimental methods can be inconsistent. Therefore, it is important to establish a precise, simple, and rapid method to quantify global DNA methylation levels during chondrocyte dedifferentiation.
Current genome-wide methylation analysis techniques largely rely on bisulfite genomic sequencing. Due to DNA degradation during bisulfite conversion, these methods typically require a large sample volume. Other methods used to quantify global DNA methylation levels include high-performance liquid chromatography (HPLC). However, HPLC requires complete digestion of genomic DNA. Additionally, the prohibitively high cost of HPLC instruments limits HPLC&#39;s wider application.
In this study, genomic DNA (gDNA) was extracted from human chondrocytes cultured with varying number of passages. The gDNA methylation level was detected using a methylation-specific dot blot assay. In this dot blot approach, a gDNA mixture containing the methylated DNA to be detected was spotted directly onto an N+ membrane as a dot inside a previously drawn circular template pattern. Compared with other gel electrophoresis-based blotting approaches and other complex blotting procedures, the dot blot method saves significant time. In addition, dot blots can detect overall DNA methylation level using a commercially available 5-mC antibody. We found that the DNA methylation level differed between the monolayer subcultures, and therefore could play a key role in chondrocyte dedifferentiation. The 5-mC dot blot is a reliable, simple, and rapid method to detect the general DNA methylation level to evaluate chondrocyte phenotype.

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

We present a method to quantify DNA methylation based on the 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We determined the 5-mC levels during chondrocyte dedifferentiation. This simple technique could be used to quickly determine the chondrocyte phenotype in ACI treatment.

Un test a blot di 5 mc quantificando il livello di metilazione del DNA della dedifferentiation di condrociti<em&gt; In vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioingegneria dei microrganismi del midollo osseo umano nel mouse e la loro visualizzazione mediante imaging live

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Un base di RANKL Osteoclast cultura Assay di midollo osseo del topo per studiare il ruolo di mTORC1 nella formazione degli osteoclasti

PLAYLIST