عميق شكرا مقدم البلاغ الدكتور أساكو Sugimoto (جامعة توهوكو) لمناقشة مفيدة لها. وكان wyIs251 هدية سخية من الدكتورة كانغ شين (جامعة ستانفورد). قدم mnIs17 كجك، الذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة "برامج الهياكل الأساسية للبحوث" (P40 OD010440). أيد هذا العمل دايتشي سانكيو مؤسسة، مؤسسة علوم المخ ومؤسسة نايتو ومنحة كاكينهي JSPS #17 ح 05010 و #16 ح 06536.

1-"إعداد نموذج" سلالة <ol><li>توليد المعدلة وراثيا C. ايليجانس الاهتمام باستخدام منهجيات المعدلة وراثيا 18. وبدلاً من ذلك، الحصول على سلالات ملائمة من مركز علم الوراثة كاينورهابديتيس (كجك). لتصور النقل محواري السلائف حويصلة متشابك، استخدم خط المعدلة وراثيا wyIs251 [بميج-13::gfp::rab-3] 7. لمراقبة ايفت، الحصول على mnIs17 [osm-6::gfp] خط المعدلة وراثيا 19. وتستخدم هذه السلالات في هذا البروتوكول- 
	ملاحظة: أما الصفيف اكستراتشروموسومال، ودمج الجينوم، أو حتى بروتينات فلورية خضراء تدق في الأشغال. لتقليل الإشارات الخلفية، استخدم المروجين خلية على حدة، بدلاً من المروجين عموم العصبية. 
	ملاحظة: يصف البروتوكولات الأخرى 20 صيانة ديدان. وأبقى سلالات في مروج OP50 اشيريشيا كولاي التغذية على نمو السلكية لوحات (NGM) متوسطة (1.7 في المائة (w/v) [اغروس]، 50 مم كلوريد الصوديوم، ببتون 0.25% (w/v)، 1 مم كاكل 2، 5 ملغ/مل الكولسترول، 25 مم خ 2 ص 4، 1 مم MgSO 4 الأطباق البلاستيك قطرها 60 ملم) في 20 درجة مئوية.</li>
	<li>تنمو الديدان عند 20 درجة مئوية على لوحات NGM في أي مرحلة من مراحل دورة حياة الديدان. 
	ملاحظة: أحد مراقبة النقل محواري وايفت في أي مرحلة. L4 الراحل للشباب البالغين عنصر تحكم إيجابية جيدة لمنشورات متعددة قد استخدمت هذه المراحل وتصور الاتجار الأحداث 14 ، ، من 21 22 ، 23-</li>
</ol> 2. إعداد 10% [اغروس] ملاحظة: العديد من البائعين تقديم منتجات مماثلة مثل أجار واجار مساحيق [اغروس]. استخدام التفريد الصف [اغروس] (جل قوة &#62; 1200 غ/سم 2). مساحيق أجار رخيصة لا تعمل بسبب الجل الناتجة ليست قوية بما فيه الكفاية لشل الديدان.
<ol><li>ميكس ز 0.4 [اغروس] في 4 مل المقطر المياه (DW) في أنبوب زجاج (1.5 سم x 10.5 سم). وضع غطاء على أنبوب الزجاج لتجنب التبخر.</li>
	<li>وضع أنبوب الزجاج على كتلة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. وبالإضافة إلى ذلك، تعد آخر زجاج الأنبوبة (1.5 سم x 10.5 سم) مليئة DW وإبقائه في 95 ° C. وضع بيبيت باستور في 95 درجة مئوية دويتشه فيلة ( الشكل 1 أ). سوف ينظر الكثير من الفقاعات الصغيرة في الأنبوب [اغروس] وينبغي أن يكون الحل عكر. اتركه حتى يصبح الحل واضح. ثم، مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً حتى يصبح الحل [اغروس] متجانسة. 
	ملاحظة: لا يمكن استخدام أفران الميكروويف لإعداد 10% [اغروس] الحل عندما قدم من دويتشه فيلة و [اغروس]. فقاعات صغيرة الناجمة عن الموجات الدقيقة تمنع ذوبان [اغروس]. ومع ذلك، طدت 10% [اغروس] هلام يمكن بسهولة أن ذاب مرة أخرى باستخدام ميكروويف. أنابيب زجاجية تحتوي على 10% [اغروس] هلام يمكن أعد قبل الوقت المحدد وتخزينها عند 4 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل. في حالة القيام بذلك، تذوب المخزون باستخدام ميكروويف عند الحاجة وابدأ من الخطوة 3 في هذا البروتوكول- 
	ملاحظة: [اغروس] تدريجيا يفقد القدرة على ترسيخ إذا المحتضنة في 95 درجة مئوية لمدة طويلة أو بعد تكرار التجميد والذوبان. إذا حدث هذا، تعد الجديدة 10% [اغروس]-</li>
</ol> 3. إعداد لوحة [اغروس] <ol><li>باستخدام بيبيت باستور المعالجون إعدادها في الخطوة 2، 2، ضع قطرات 2 من 10% [اغروس] على شريحة 76 × 22 مم.</li>
	<li>بسرعة غطاء مع شريحة 76 × 22 مم 2 ثانية قبل الهبوط [اغروس] يتصلب كما هو مبين في الشكل 1 ب، ودفع إلى أسفل في الشريحة الثانية تسطيح الحل [اغروس]. يجب أن يكون السمك 0.5-1 مم-</li>
	<li>بسرعة تدفق ماصة باستور قبل بيبيتينج 95 درجة مئوية DW صعودا ونزولاً حتى يتم غسلها الحل [اغروس]. خلاف ذلك، سوف انسداد بيبيت واسطة [اغروس] هلام. ترك مكانة ماصة في 95 درجة مئوية DW.</li>
	<li>انتظر 1 دقيقة. أشكال لوحة المفاتيح [اغروس] ويصبح غائم. ثم الشرائح الشرائح عن بعضها باليد ( الشكل 1 ج)-</li>
</ol> 4. تصاعد من الديدان ملاحظة: حتى كميات صغيرة من حركة الدودة منع مراقبة جيدة. وقد استخدمت Levamisole تقليديا لمنع حركة الدودة على 24 ، لوح [اغروس] 25. ومع ذلك، Levamisole يثبط مستقبلات الخلايا العصبية في C. ايليجانس، وبالتالي قد تؤثر على الاتجار الأحداث التي وقعت في 15 من الخلايا العصبية. استخدام البوليسترين ميكروبيدس وصف hereis بديل جيد 17-
<ol><li>تحت مجهر ستيريو مجهزة تضوء مرآة القابل للانزلاق الموجود، نقل ~ 30 لوحة الديدان المعدلة وراثيا معربا عن العلامات المناسبة إلى NGM جديدة دون انتقاء البكتيريا باستخدام سلك البلاتين. 
	ملاحظة: اختيار سلك البلاتين مصنوع من سلك البلاتين وماصة باستور (5 بوصة)، وكان غيض سلك البلاتين بالأرض. إعداد اللقطات سلك البلاتين، ومعالجة الديدان مع هذه موصوفة في وورمبوك (http://www.wormbook.org)-</li>
	<li>ترك اللوحة للحد الأدنى 1 البكتيريا يتم تلقائياً إزالة من سطوح الديدان الديدان تتحرك على NGM [اغروس] هلام دون البكتيريا.</li>
	إسقاط <li>وضعت 0.5-1.0 ميليلتر من 2.6% 100 نانومتر القطر البوليسترين ميكروبيدس في الماء على لوحة المفاتيح أجار ( الشكل 1 د). نقل الديدان 10-20 من لوحة NGM خالية من البكتيريا إلى ميكروبيدس. قطره وانتشار الديدان باستخدام سلك البلاتين بيك لتجنب تداخل دودة الهيئات ( الشكل 1 ﻫ)-</li>
	تطبيق <li>ساترة 2 22 × 40 ملم ( الشكل 1 و). دفع برفق إزالة فقاعات الهواء، ولكن تجنب سحق الديدان. العينة الآن جاهزة للتصوير- 
	ملاحظة: نظراً لأن إدارته لا التخدير، يتم إصلاحها الديدان فقط بقوة الاحتكاك الناجمة عن لوح أجار، ميكروبيدس البوليستيرين، وساترة 17. وجود وحدة تغذية البكتيريا و/أو حل الكثير سيجعل القوة احتكاكي الأضعف. 
	ملاحظة: أحجام مختلفة لعمل كوفيرسليبس (مثلاً، 22 × 22 مم 2، 18 × 18 مم 2). ومع ذلك، يمكن منع كوفيرسليبس أكبر غمر المياه أو النفط من العدسة الهدف تتسرب إلى عينات من خلال الملاحظة.</li>
</ol> 5. المراقبة ملاحظة: سوف تختلف المعلمات التصوير المناسبة (طاقة الليزر، كسب، binning، إلخ) لكل نظام المجهر والكاميرا. هنا، يتم استخدام مجهر ويديفيلد مجهزة [كنفوكل] قرص غزل في الماسح ضوئي وكاميرا رقمية CCD.
<ol><li>التحكم في درجة الحرارة للمرحلة إلى 20 درجة مئوية، أو ضبط درجة حرارة الغرفة إلى 20 درجة مئوية.</li>
	<li>وضع الشريحة عينة على المسرح المجهر. استخدم 100 x (الفتحة العددية = 1.3 أو أفضل) عدسة الهدف.</li>
	<li>البحث عن المجالات المبينة في الشكل 2 أ (بالنسبة wyIs251 والنقل محواري) أو الرقم 2 ب (بالنسبة mnIs17 وايفت) كعناصر إيجابية . يمكن تحليل مجالات أخرى ك جيدا 22-</li>
	<li>مجموعة المعلمات (مكاسب اتفاقية مكافحة التصحر = 200، بينينج = 1 أو 2، طاقة الليزر في 488 نانومتر = ميغاواط 1.0-1.3). إجراء تسجيل مرور الوقت 4 إطارات في الثانية لتصل إلى 1 دقيقة حفظ الملفات بتنسيق mutli TIFF- 
	ملاحظة: إذا كانت التجارة والنقل إشارات تختفي ومن الصعب الاستمرار في مراقبة GFP::RAB-3 أو OSM-6::GFP لمدة 30 ق، قوة الليزر قوية جداً. وفي هذه الحالة، تقليل قوة الليزر. على العكس من ذلك، إذا كان يتم تسجيل لا حركة حويصلية، قوة الليزر ضعيفة جداً. وفي هذه الحالة، زيادة قوة الليزر-</li>
	<li>مراقبة دودة مختلفة وكرر 5.3 و 5.4. الملاحظات التي يمكن أن تستمر لمدة تصل إلى 20 دقيقة، ولكن ينبغي أن تسجل كل دودة مرة واحدة فقط لتجنب آثار فالأضرار النموذجية- 
	ملاحظة: الديدان، وقد لوحظت لمدة 20 دقيقة على الأقل دون عيوب كبيرة 7 ، ، من 27 28. من الممكن مراقبة أطول لكن ملاذ &#39; تي تم اختباره بعد. إشارة واضحة لموت الخلايا العصبية هو تغير مورفولوجيا الخلايا العصبية مثل تورم نيوريتي. كما يتبين إشارات ضعيفة في التجارة والنقل في محاور عصبية و dendrites في wyIs251 و mnIs17، يمكن بسهولة التحقق مورفولوجيا نورت بمجرد النظر في محاور عصبية أو dendrites. ويبين الشكل 2 مورفولوجيا الخلايا العصبية.</li>
	<li>إنشاء ملفات الفيلم.
	ملف <ol><li>فتح TIFF متعددة باستخدام البرمجيات فيجي. انتقل إلى الملف &#62; ثم حدد فتح ملف TIFF متعدد بحفظه في الخطوة 5، 4- 
		ملاحظة: يمكن تحميل فيجي في jttps://fiji.sc. يمكن أيضا استخدام الصور ي والإضافات لتوليد كيموجرافس. في حالة القيام بذلك، اتبع الإرشادات ذات الصلة للبرنامج المساعد الذي تم اختياره.</li> <li>انقر فوق &#34; مستطيل التحديد &#34; زر ( الشكل 3 ، سهم) وتحديد مجال الاهتمام برسم مستطيل مع فأرة كمبيوتر (المستطيل الأصفر في الشكل 3 أ). انتقل إلى الصورة &#62; أكوام &#62; أدوات &#62; سوبستاكس وحدد أرقام الشرائح التي يتم تضمينها في الفيلم. يتم إنشاء سوبستاك.</li>
		تنشيط الإطار سوبستاك بواسطة النقر فوق <li>وانتقل إلى الصورة &#62; ضبط &#62; السطوع/. تظهر نافذة لضبط السطوع والتباين. في الإطار الشريحة الأعلى بار (الحد الأدنى) إلى اليمين حتى أن يختفي الإشارات الخلفية والثاني بار (الحد الأقصى) إلى اليسار حتى أن أعلى حويصلات تتحرك والجسيمات يمكن أن يرى جيدا على الخلفية-</li>
		<li>انتقل إلى الصورة &#62; أكوام &#62; الوقت محرد. كما يتم تسجيل الفيلم على 4 إطارات/ثانية في الخطوة 5، 4، الفاصل الزمني هو 0.25 s. وهكذا، اكتب &#34; 0.25 &#34; في الفاصل الزمني.</li>
		<li>بإنشاء ملف فيلم بتحديد حفظ باسم &#62; AVI من القائمة ملف (فيلم 1 و 2)- 
		ملاحظة: باستخدام الإضافات المناسبة، يمكنك حفظ الملف بتنسيقات أخرى مثل &#34; mpeg4 &#34; أو &#34; موف &#34; الملفات.</li>
	</ol></li> <li>تولد كيموجرافس.
	<ol><li>فتح الملفات الفيلم الأصلي باستخدام البرمجيات فيجي مرة أخرى، ثم كرر الخطوات من 5.6.2 و 5.6.3 لضبط السطوع والتباين.</li>
		<li>انقر فوق &#34; تقسيم خط &#34; ( الشكل 3 ب، السهم). استخدام ماوس, رسم خط مجزأة على طول أهداب أو إكسون (الخط الأصفر، في الشكل 3 ب)-</li>
		<li>الذهاب إلى تحليل &#62; كيموجراف متعدد &#62; متعدد كيموجراف ( الشكل 3 ج). يظهر إطار عرض الخط ( الشكل 3 د). نوع &#34; 3 &#34; في نافذة لينيويدث وانقر فوق موافق ( الشكل 3 د)-</li>
		يتم إنشاء إطار كيموجراف <li>. حفظ الصورة بتنسيق TIFF أو JPEG.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+in+neurons:+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function,+development,+and+disease.">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).</li><li>Holzbaur, E. L., Scherer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules,+axonal+transport,+and+neuropathy.">Microtubules, axonal transport, and neuropathy.</a> N Engl J Med. 365 (24), 2330-2332 (2011).</li><li>Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+axonemal+dyneins+as+studied+in+Chlamydomonas+mutants.">Functional diversity of axonemal dyneins as studied in Chlamydomonas mutants.</a> Int Rev Cytol. 219, 115-155 (2002).</li><li>Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraflagellar+transport+motors+in+cilia:+moving+along+the+cell's+antenna.">Intraflagellar transport motors in cilia: moving along the cell's antenna.</a> J Cell Biol. 180 (1), 23-29 (2008).</li><li>Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraflagellar+transport.">Intraflagellar transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (11), 813-825 (2002).</li><li>Ishikawa, H., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliogenesis:+building+the+cell's+antenna.">Ciliogenesis: building the cell's antenna.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (4), 222-234 (2011).</li><li>Niwa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinhibition+of+a+Neuronal+Kinesin+UNC-104/KIF1A+Regulates+the+Size+and+Density+of+Synapses.">Autoinhibition of a Neuronal Kinesin UNC-104/KIF1A Regulates the Size and Density of Synapses.</a> Cell Rep. 16 (8), 2129-2141 (2016).</li><li>Snow, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+anterograde+intraflagellar+transport+motors+cooperate+to+build+sensory+cilia+on+C.+elegans+neurons.">Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).</li><li>Ou, G., Blacque, O. E., Snow, J. J., Leroux, M. R., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coordination+of+intraflagellar+transport+motors.">Functional coordination of intraflagellar transport motors.</a> Nature. 436 (7050), 583-587 (2005).</li><li>Zhou, R., Niwa, S., Homma, N., Takei, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF26A+is+an+unconventional+kinesin+and+regulates+GDNF-Ret+signaling+in+enteric+neuronal+development.">KIF26A is an unconventional kinesin and regulates GDNF-Ret signaling in enteric neuronal development.</a> Cell. 139 (4), 802-813 (2009).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charcot-Marie-Tooth+disease+type+2A+caused+by+mutation+in+a+microtubule+motor+KIF1Bbeta.">Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIF1Bbeta.</a> Cell. 105 (5), 587-597 (2001).</li><li>Niwa, S., Tanaka, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF1Bbeta-+and+KIF1A-mediated+axonal+transport+of+presynaptic+regulator+Rab3+occurs+in+a+GTP-dependent+manner+through+DENN/MADD.">KIF1Bbeta- and KIF1A-mediated axonal transport of presynaptic regulator Rab3 occurs in a GTP-dependent manner through DENN/MADD.</a> Nat Cell Biol. 10 (11), 1269-1279 (2008).</li><li>Zhou, R., Niwa, S., Guillaud, L., Tong, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+motor,+KIF13A,+controls+anxiety+by+transporting+the+serotonin+type+1A+receptor.">A molecular motor, KIF13A, controls anxiety by transporting the serotonin type 1A receptor.</a> Cell Rep. 3 (2), 509-519 (2013).</li><li>Klassen, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Arf-like+small+G+protein,+ARL-8,+promotes+the+axonal+transport+of+presynaptic+cargoes+by+suppressing+vesicle+aggregation.">An Arf-like small G protein, ARL-8, promotes the axonal transport of presynaptic cargoes by suppressing vesicle aggregation.</a> Neuron. 66 (5), 710-723 (2010).</li><li>Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+microfluidic+devices+for+in+vivo+imaging+of+C.+elegans,+Drosophila+and+zebrafish.">Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li><li>Chai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+cellular+dynamics+during+Caenorhabditis+elegans+postembryonic+development.">Live imaging of cellular dynamics during Caenorhabditis elegans postembryonic development.</a> Nat Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).</li><li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+using+nanoparticle-mediated+immobilization.">Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization.</a> PLoS One. 8 (1), 53419 (2013).</li><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), (2008).</li><li>Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+osm-6,+a+gene+that+affects+sensory+cilium+structure+and+sensory+neuron+function+in+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 148 (1), 187-200 (1998).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nephronophthisis-related+gene+ift-139+is+required+for+ciliogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">The nephronophthisis-related gene ift-139 is required for ciliogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Sci Rep. 6, 31544 (2016).</li><li>Maeder, C. I., San-Miguel, A., Wu, E. Y., Lu, H., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+neuron-wide+analysis+of+synaptic+vesicle+precursor+trafficking.">In vivo neuron-wide analysis of synaptic vesicle precursor trafficking.</a> Traffic. 15 (3), 273-291 (2014).</li><li>Wu, Y. E., Huo, L., Maeder, C. I., Feng, W., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+balance+between+capture+and+dissociation+of+presynaptic+proteins+controls+the+spatial+distribution+of+synapses.">The balance between capture and dissociation of presynaptic proteins controls the spatial distribution of synapses.</a> Neuron. 78 (6), 994-1011 (2013).</li><li>Dwyer, N. D., Adler, C. E., Crump, J. G., L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+dendritic+transport+and+the+AP-1+mu1+clathrin+adaptor+UNC-101+localize+odorant+receptors+to+olfactory+cilia.">Polarized dendritic transport and the AP-1 mu1 clathrin adaptor UNC-101 localize odorant receptors to olfactory cilia.</a> Neuron. 31 (2), 277-287 (2001).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 177-206 (2012).</li><li>Kumar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+Kinesin-3+motor+UNC-104/KIF1A+is+degraded+upon+loss+of+specific+binding+to+cargo.">The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo.</a> PLoS Genet. 6 (11), 1001200 (2010).</li><li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vesicle+protein+SAM-4+regulates+the+processivity+of+synaptic+vesicle+transport.">The vesicle protein SAM-4 regulates the processivity of synaptic vesicle transport.</a> PLoS Genet. 10 (10), 1004644 (2014).</li><li>Blacque, O. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WD+repeat-containing+protein+IFTA-1+is+required+for+retrograde+intraflagellar+transport.">The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport.</a> Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).</li><li>Evans, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+modulation+of+IFT+kinesins+extends+the+sensory+repertoire+of+ciliated+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans.</a> J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li><li>Bindels, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mScarlet:+a+bright+monomeric+red+fluorescent+protein+for+cellular+imaging.">mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging.</a> Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).</li><li>Prevo, B., Mangeol, P., Oswald, F., Scholey, J. M., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differentiation+of+cooperating+kinesin-2+motors+orchestrates+cargo+import+and+transport+in+C.+elegans+cilia.">Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia.</a> Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).</li><li>Robison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detyrosinated+microtubules+buckle+and+bear+load+in+contracting+cardiomyocytes.">Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes.</a> Science. 352 (6284), 0659 (2016).</li><li>Hayashi, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+superresolution+fluorescence+imaging+with+spinning+disk+confocal+microscope+optics.">Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics.</a> Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).</li></ol>

ليس له علاقة بالكشف عن صاحب البلاغ.

التقادم فيما يتعلق بالأساليب القائمة الأسلوب الموصوفة هنا هو الأمثل لمراقبة الأحداث سريعة مثل النقل محواري وايفت. وهكذا، الأولوية لتجميد أكثر من حضانة أطول. بينما تمكنا من مراقبة الاتجار الأحداث لمدة 20 دقيقة على الأقل دون اضطراب كبير، هذا الأسلوب قد لا تكون دائماً مناسبة لمرا?...

تصوير الخلية الحية أداة أساسية لتحليل النقل داخل الخلايا. في بيولوجيا الخلايا العصبية، تحليلات للنقل محواري مع تصوير الخلية الحية ضرورية لفهم العصبية الدالة و morphogenesis1. عيوب في النقل محواري تكمن وراء عدة اضطرابات الأعصاب2. Kinesin فوق عائلة البروتينات ودينين القيام بالنقل محواري أنتيروجراديلي وريتروجراديلي، على التوالي1،2.
أهداب هي آخر حجرة الخلوية التي هي الشبكة ميكروتوبولي وآلية الاتجار المتقدمة جداً3. يتم ترجمة البروتين التوليف إليه لا بأهداب، مما يعني أنه يتعين نقل البروتينات الهدبية من السيتوبلازم إلى نصائح أهداب. Kinesin الخاصة بأهداب ودينين، يسمى kinesin-2 وهيولى دينين-2، على التوالي، ونقل مكونات أهداب4، في ظاهرة تسمى النقل إينترافلاجيلار (ايفت)5. أسباب إعاقة IFT طائفة أمراض تسمى سيليوباثيس6. وهكذا، مطلوب تحليل إليه ايفت بتصوير الخلايا الحية لفهم الآليات الأساسية لتشكيل الهدبية والمرضية.
ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) نموذج جيد لدراسة النقل محواري وايفت7،،من89. لمراقبة ايفت، Chlamydomonas قد استخدمت على نطاق واسع كنموذج كائن5،6. كما تشلاميدوموناس كائن أحادي الخلية، سيكون من الصعب لتحليل علاقة ايفت بالشيخوخة ووظيفة الخلايا العصبية والسلوك. وبالإضافة إلى ذلك، طبقت لا التقنيات الوراثية الأساسية مثل كريسبر/Cas9 إلى تشلاميدوموناس. في أعلى نموذج الكائنات، مثل الفئران و المورفولوجية، يسبب تعطل النقل محواري و IFT وكثيراً ما تعمل قاتلة لأن النقل محواري و IFT ضرورية ل morphogenesis والتوازن من الحيوانات 10، 11. في حالة الفئران، خلية ثقافة وتعداء عموما مطلوب لمراقبة النقل محواري وإيفت، الأمر الذي يتطلب الكثير من المهارات والوقت واسعة12،13. وبالإضافة إلى ذلك، قد فقدت الكثير من سياق الفسيولوجية الهامة في الخلايا المستزرعة وخطوط الخلية. للجهاز العصبي ليست ضرورية للبقاء على قيد الحياة الديدان، تعطلت C. ايليجانس طفرات في النقل محواري أو إيفت التي غالباً ما تكون غير قاتلة7،،من914. النقل محواري وايفت يمكن مباشرة ملاحظة في فيفو دون تشريح لأن C. ايليجانس شفافة وذلك من السهل ملاحظة علامات معلم بروتينات فلورية خضراء.
وهناك العديد من البروتوكولات شل C. ايليجانس، مثل استخدام جهاز موائع جزيئية15ومنصات [اغروس] مع التخدير16أو17من ميكروبيدس. إدراج التخدير قد تمنع الاتجار الأحداث في الخلايا العصبية15. عيب واضح من الأسلوب موائع جزيئية-الجهاز أن إعداد جهاز موائع جزيئية ليس دائماً أمرا سهلاً. بدلاً من ذلك، يتم التثبيت قبل ميكروبيدس ومنصات [اغروس] طريقة مريحة وسهلة لإجراء تصوير مرور الزمن في C. ايليجانس. وهنا أصف هذا البروتوكول الأساسية شل C. ايليجانس ووضع تصور للنقل محواري وايفت في فيفو في C. ايليجانس. مقارنة بالأساليب الأخرى، الطريقة الموضحة هنا لا تتطلب معدات خاصة، وهو أرخص بكثير وأسهل لتنفيذ.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="837">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Slideglass (76&#160; x 26 mm)</td>
			<td style="width:167px;">Matsunami</td>
			<td style="width:139px;">S1111</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Coverglass (22&#160; x 40 mm)</td>
			<td style="width:167px;">Matsunami</td>
			<td style="width:139px;">C024401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Agarose</td>
			<td style="width:167px;">Wako</td>
			<td style="width:139px;">318-01195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Polystylene microbeads 0.1 micron</td>
			<td style="width:167px;">Polysciences</td>
			<td style="width:139px;">#00876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Heat block</td>
			<td style="width:167px;">TAITEC</td>
			<td style="width:139px;">0063288-000</td>
			<td>CTU-mini</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Microscope</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;">IX-71</td>
			<td>widefield microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Spinning disk Scanner</td>
			<td style="width:167px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:139px;">CSU-X1</td>
			<td>spinning disc confocal scanner&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Digital CCD camera</td>
			<td style="width:167px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:139px;">C10600-10B</td>
			<td>ORCA-R2 degital CCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Objective lens (x100, NA1.4)</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;">UPLSAPO 100XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Pasteur pipette (5 inch)</td>
			<td style="width:167px;">IWAKI</td>
			<td style="width:139px;">IK-PAS-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm)</td>
			<td style="width:167px;">IWAKI</td>
			<td style="width:139px;">9820TST15-105NP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TV9211: wyIs251</td>
			<td style="width:167px;">Laboratory of Kang Shen</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">OTL11: mnIs17</td>
			<td style="width:167px;">Ref. 27, 29</td>
			<td style="width:139px;">N/A</td>
			<td>SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:167px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:139px;">435064-9000-000</td>
			<td>STEMI 508&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mirror transillumination unit</td>
			<td style="width:167px;">Carl Zeiss</td>
			<td>435425-9010-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">platinum wire (0.2 mm)</td>
			<td style="width:167px;">Nilaco Corporation</td>
			<td style="width:139px;">m78483501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm plastic dish</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:139px;">#351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Fiji</td>
			<td style="width:167px;">N/A</td>
			<td style="width:139px;">N/A</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">nematode growth medium (NGM)&#160;&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immobilization of caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons

محواري النقل والنقل إينترافلاجيلار (ايفت) ضرورية ل morphogenesis إكسون واهداب والدالة. Kinesin فوق عائلة البروتينات ودينين من المحركات الجزيئية التي تنظم أنتيروجرادي والنقل إلى الوراء، على التوالي. هذه المحركات تستخدم شبكات microtubule كالقضبان. ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) كائن نموذج قوية لدراسة النقل محواري وايفت في فيفو. هنا، أود أن أصف بروتوكول لمراقبة النقل محواري وايفت في المعيشة C. ايليجانس. يمكن تصور البضائع المشحونة بعلامات البضائع البروتينات باستخدام البروتينات الفلورية مثل البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل). C. ايليجانس يتسم بالشفافية ويمكن التعبير عن البروتينات البضائع معلم بروتينات فلورية خضراء في خلايا معينة تحت المروجين خلية على حدة. يمكن أن تكون ثابتة الديدان الحية التي ميكروبيدس على 10% [اغروس] هلام دون قتل أو أنيسثيتيزينج الديدان. في ظل هذه الظروف، حركة نقل البضائع مباشرة يلاحظ في محاور عصبية واهداب المعيشة C. ايليجانس دون تشريح. يمكن تطبيق هذه الطريقة لمراقبة أي جزيء البضائع في أي من الخلايا عن طريق تعديل بروتينات المستهدفة و/أو الخلايا يتم التعبير عنها في. هي المصانة البروتينات الأساسية مثل المحركات الجزيئية ومحول البروتينات التي تشارك في نقل محواري وايفت في C. ايليجانس. بالمقارنة مع غيرها من الكائنات نموذج، يمكن الحصول على طفرات وصيانتها بسهولة أكبر في C. ايليجانس. يمكن دمج هذا الأسلوب مع مختلف C. ايليجانس طفرات لتوضيح الآليات الجزيئية للنقل محواري وايفت.

النقل محواري في الخلايا العصبية DA9 استخدام خط wyIs251 ، أنتيروجرادي والنقل إلى الوراء محواري GFP::RAB-3 يمكن في نفس الوقت تسجيل في العصبون DA9. متوسط سرعة anterograde والنقل إلى الوراء في إكسون الظهرية الدانية من العصبية DA9 هو حوالي 1.8 و 2.6 ميكرومتر/s، على التوالي...

Watch this Scientific Journal Video about Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons at JoVE.com

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) نموذج جيد لدراسة النقل محواري وداخل الخلايا. وهنا أصف على بروتوكول في فيفو تسجيل وتحليل للنقل محواري وإينترافلاجيلار في C. ايليجانس.

التثبيت من ايليجانس كاينورهابديتيس "تحليل النقل داخل الخلايا" في الخلايا العصبية

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

The overall goal of this time lapse recording is to observe the intracellular transport events in Caenorhabditis elegans neurons.This method can help answer key questions in the cell biology field such as axonal transport and interflagellar transport.The main advantage of this technique is that one can observe intracellular transport in C.Elegans without dissection.Start this experiment by growing transgenic C.elegans strain of interest at 20

immobilization-caenorhabditis-elegans-to-analyze-intracellular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

7.9K Views.  Tohoku University. The overall goal of this time lapse recording is to observe the intracellular transport events in Caenorhabditis elegans neurons.This method can help answer key questions in the cell biology field such as axonal transport and interflagellar transport.The main advantage of this technique is that one can observe intracellular transport in C.Elegans without dissection.Start this experiment by growing transgenic C.elegans strain of interest at 20

Video: Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

تقييم شامل من سلالة الجرثومية الكيماوية السمية باستخدام نيماتودا<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

تحليل المكاني والزماني لأحدث إرك في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; الخط الجرثومي

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

استخدام إيمونولابيلينج لتحليل Microtubules مستقرة ودينامية، والوليدة في الجنين الزرد

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

تطبيق [رني] والحرارة الناجمة عن صدمة "التعبير عامل النسخ" إلى "إعادة برمجة الخلايا الجرثومية" إلى الخلايا العصبية في C. ايليجانس

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are facilitated by the transparency of the animal, the ability to do forward and reverse genetic assays, the relative ease of generating fluorescently labeled proteins, and the use of fluorescent dyes that can either be microinjected into the early embryo or incorporated into its food (E. coli strain OP50) to label cellular organelles (e.g. 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Here, we present the use of a fluorescent pH-sensitive dye that stains intestinal lysosomes, providing a visual readout of dynamic, physiological changes in lysosomal acidity in live worms. This protocol does not measure lysosomal pH, but rather aims to establish a reliable method of assessing physiological relevant variations in lysosomal acidity. cDCFDA is a cell-permeant compound that is converted to the fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein (cDCF) upon hydrolysis by intracellular esterases. Protonation inside lysosomes traps cDCF in these organelles, where it accumulates. Due to its low pKa of 4.8, this dye has been used as a pH sensor in yeast. Here we describe the use of cDCFDA as a food supplement to assess the acidity of intestinal lysosomes in C. elegans. This technique allows for the detection of alkalinizing lysosomes in live animals, and has a broad range of experimental applications including studies on aging, autophagy, and lysosomal biogenesis.

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

A step-by-step guide to probe loss of lysosomal acidity in the intestine of C. elegans using the pH-sensitive vital dye 5(6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

تقييم "الليزوزومية الغدق" في "الأمعاء ومن يعيش" ايليجانس كاينورهابديتيس

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

دراسة "عنصر مؤكسد الإجهاد الناجم عن العقديّات المجموعة ميتس" في ايليجانس كاينورهابديتيس

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

المجهر الضوئي ورقه الخفيفة والمؤتمتة الخلايا النسب تحليلات لكتالوج Caenorhabditis الاجنه الجنينية مع القرار تحت الخلوية

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female reproductive tract. While in vitro studies suggest that sperm of internally fertilizing animals can respond to various cues from their surroundings, the inability to visualize their behavior inside the female reproductive tract creates a challenge for understanding sperm migration and mobility in its native environment. Here, we describe a method using C. elegans that overcomes this limitation and takes advantage of their transparent epidermis. C. elegans males stained with a mitochondrial&#160; dye are mated with adult hermaphrodites, which act as modified females, and deposit fluorescently labeled sperm into the hermaphrodite uterus. The migration and motility of the labeled sperm can then be directly tracked using an epi-fluorescence microscope in a live hermaphrodite. In wild-type animals, approximately 90% of the labeled sperm crawl through the uterus and reach the fertilization site, or spermatheca. Images of the uterus can be taken 1 h after mating to assess the distribution of the sperm within the uterus and the percentage of sperm that have reached the spermatheca. Alternatively, time-lapse images can be taken immediately after mating to assess sperm speed, directional velocity and reversal frequency. This method can be combined with other genetic and molecular tools available for the C.elegans to identify novel genetic and molecular mechanisms that are important in regulating sperm guidance and motility within the female reproductive tract.

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Sperm must successfully navigate through the oviduct to fertilize an oocyte. Here, we describe an assay for measuring sperm migration within the C. elegans hermaphrodite uterus. This assay can provide quantitative data on sperm distribution within the uterus after mating, as well as on speed, directional velocity, and reversal frequency.

قياس الإرشاد المنوي والحركية داخل الجهاز التناسلي المخنث

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...