Name: immobilization of caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons
Uploaded: 2017-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons at JoVE.com

عميق شكرا مقدم البلاغ الدكتور أساكو Sugimoto (جامعة توهوكو) لمناقشة مفيدة لها. وكان wyIs251 هدية سخية من الدكتورة كانغ شين (جامعة ستانفورد). قدم mnIs17 كجك، الذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة "برامج الهياكل الأساسية للبحوث" (P40 OD010440). أيد هذا العمل دايتشي سانكيو مؤسسة، مؤسسة علوم المخ ومؤسسة نايتو ومنحة كاكينهي JSPS #17 ح 05010 و #16 ح 06536.

1-"إعداد نموذج" سلالة <ol><li>توليد المعدلة وراثيا C. ايليجانس الاهتمام باستخدام منهجيات المعدلة وراثيا 18. وبدلاً من ذلك، الحصول على سلالات ملائمة من مركز علم الوراثة كاينورهابديتيس (كجك). لتصور النقل محواري السلائف حويصلة متشابك، استخدم خط المعدلة وراثيا wyIs251 [بميج-13::gfp::rab-3] 7. لمراقبة ايفت، الحصول على mnIs17 [osm-6::gfp] خط المعدلة وراثيا 19. وتستخدم هذه السلالات في هذا البروتوكول- 
	ملاحظة: أما الصفيف اكستراتشروموسومال، ودمج الجينوم، أو حتى بروتينات فلورية خضراء تدق في الأشغال. لتقليل الإشارات الخلفية، استخدم المروجين خلية على حدة، بدلاً من المروجين عموم العصبية. 
	ملاحظة: يصف البروتوكولات الأخرى 20 صيانة ديدان. وأبقى سلالات في مروج OP50 اشيريشيا كولاي التغذية على نمو السلكية لوحات (NGM) متوسطة (1.7 في المائة (w/v) [اغروس]، 50 مم كلوريد الصوديوم، ببتون 0.25% (w/v)، 1 مم كاكل 2، 5 ملغ/مل الكولسترول، 25 مم خ 2 ص 4، 1 مم MgSO 4 الأطباق البلاستيك قطرها 60 ملم) في 20 درجة مئوية.</li>
	<li>تنمو الديدان عند 20 درجة مئوية على لوحات NGM في أي مرحلة من مراحل دورة حياة الديدان. 
	ملاحظة: أحد مراقبة النقل محواري وايفت في أي مرحلة. L4 الراحل للشباب البالغين عنصر تحكم إيجابية جيدة لمنشورات متعددة قد استخدمت هذه المراحل وتصور الاتجار الأحداث 14 ، ، من 21 22 ، 23-</li>
</ol> 2. إعداد 10% [اغروس] ملاحظة: العديد من البائعين تقديم منتجات مماثلة مثل أجار واجار مساحيق [اغروس]. استخدام التفريد الصف [اغروس] (جل قوة &#62; 1200 غ/سم 2). مساحيق أجار رخيصة لا تعمل بسبب الجل الناتجة ليست قوية بما فيه الكفاية لشل الديدان.
<ol><li>ميكس ز 0.4 [اغروس] في 4 مل المقطر المياه (DW) في أنبوب زجاج (1.5 سم x 10.5 سم). وضع غطاء على أنبوب الزجاج لتجنب التبخر.</li>
	<li>وضع أنبوب الزجاج على كتلة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. وبالإضافة إلى ذلك، تعد آخر زجاج الأنبوبة (1.5 سم x 10.5 سم) مليئة DW وإبقائه في 95 ° C. وضع بيبيت باستور في 95 درجة مئوية دويتشه فيلة ( الشكل 1 أ). سوف ينظر الكثير من الفقاعات الصغيرة في الأنبوب [اغروس] وينبغي أن يكون الحل عكر. اتركه حتى يصبح الحل واضح. ثم، مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً حتى يصبح الحل [اغروس] متجانسة. 
	ملاحظة: لا يمكن استخدام أفران الميكروويف لإعداد 10% [اغروس] الحل عندما قدم من دويتشه فيلة و [اغروس]. فقاعات صغيرة الناجمة عن الموجات الدقيقة تمنع ذوبان [اغروس]. ومع ذلك، طدت 10% [اغروس] هلام يمكن بسهولة أن ذاب مرة أخرى باستخدام ميكروويف. أنابيب زجاجية تحتوي على 10% [اغروس] هلام يمكن أعد قبل الوقت المحدد وتخزينها عند 4 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل. في حالة القيام بذلك، تذوب المخزون باستخدام ميكروويف عند الحاجة وابدأ من الخطوة 3 في هذا البروتوكول- 
	ملاحظة: [اغروس] تدريجيا يفقد القدرة على ترسيخ إذا المحتضنة في 95 درجة مئوية لمدة طويلة أو بعد تكرار التجميد والذوبان. إذا حدث هذا، تعد الجديدة 10% [اغروس]-</li>
</ol> 3. إعداد لوحة [اغروس] <ol><li>باستخدام بيبيت باستور المعالجون إعدادها في الخطوة 2، 2، ضع قطرات 2 من 10% [اغروس] على شريحة 76 × 22 مم.</li>
	<li>بسرعة غطاء مع شريحة 76 × 22 مم 2 ثانية قبل الهبوط [اغروس] يتصلب كما هو مبين في الشكل 1 ب، ودفع إلى أسفل في الشريحة الثانية تسطيح الحل [اغروس]. يجب أن يكون السمك 0.5-1 مم-</li>
	<li>بسرعة تدفق ماصة باستور قبل بيبيتينج 95 درجة مئوية DW صعودا ونزولاً حتى يتم غسلها الحل [اغروس]. خلاف ذلك، سوف انسداد بيبيت واسطة [اغروس] هلام. ترك مكانة ماصة في 95 درجة مئوية DW.</li>
	<li>انتظر 1 دقيقة. أشكال لوحة المفاتيح [اغروس] ويصبح غائم. ثم الشرائح الشرائح عن بعضها باليد ( الشكل 1 ج)-</li>
</ol> 4. تصاعد من الديدان ملاحظة: حتى كميات صغيرة من حركة الدودة منع مراقبة جيدة. وقد استخدمت Levamisole تقليديا لمنع حركة الدودة على 24 ، لوح [اغروس] 25. ومع ذلك، Levamisole يثبط مستقبلات الخلايا العصبية في C. ايليجانس، وبالتالي قد تؤثر على الاتجار الأحداث التي وقعت في 15 من الخلايا العصبية. استخدام البوليسترين ميكروبيدس وصف hereis بديل جيد 17-
<ol><li>تحت مجهر ستيريو مجهزة تضوء مرآة القابل للانزلاق الموجود، نقل ~ 30 لوحة الديدان المعدلة وراثيا معربا عن العلامات المناسبة إلى NGM جديدة دون انتقاء البكتيريا باستخدام سلك البلاتين. 
	ملاحظة: اختيار سلك البلاتين مصنوع من سلك البلاتين وماصة باستور (5 بوصة)، وكان غيض سلك البلاتين بالأرض. إعداد اللقطات سلك البلاتين، ومعالجة الديدان مع هذه موصوفة في وورمبوك (http://www.wormbook.org)-</li>
	<li>ترك اللوحة للحد الأدنى 1 البكتيريا يتم تلقائياً إزالة من سطوح الديدان الديدان تتحرك على NGM [اغروس] هلام دون البكتيريا.</li>
	إسقاط <li>وضعت 0.5-1.0 ميليلتر من 2.6% 100 نانومتر القطر البوليسترين ميكروبيدس في الماء على لوحة المفاتيح أجار ( الشكل 1 د). نقل الديدان 10-20 من لوحة NGM خالية من البكتيريا إلى ميكروبيدس. قطره وانتشار الديدان باستخدام سلك البلاتين بيك لتجنب تداخل دودة الهيئات ( الشكل 1 ﻫ)-</li>
	تطبيق <li>ساترة 2 22 × 40 ملم ( الشكل 1 و). دفع برفق إزالة فقاعات الهواء، ولكن تجنب سحق الديدان. العينة الآن جاهزة للتصوير- 
	ملاحظة: نظراً لأن إدارته لا التخدير، يتم إصلاحها الديدان فقط بقوة الاحتكاك الناجمة عن لوح أجار، ميكروبيدس البوليستيرين، وساترة 17. وجود وحدة تغذية البكتيريا و/أو حل الكثير سيجعل القوة احتكاكي الأضعف. 
	ملاحظة: أحجام مختلفة لعمل كوفيرسليبس (مثلاً، 22 × 22 مم 2، 18 × 18 مم 2). ومع ذلك، يمكن منع كوفيرسليبس أكبر غمر المياه أو النفط من العدسة الهدف تتسرب إلى عينات من خلال الملاحظة.</li>
</ol> 5. المراقبة ملاحظة: سوف تختلف المعلمات التصوير المناسبة (طاقة الليزر، كسب، binning، إلخ) لكل نظام المجهر والكاميرا. هنا، يتم استخدام مجهر ويديفيلد مجهزة [كنفوكل] قرص غزل في الماسح ضوئي وكاميرا رقمية CCD.
<ol><li>التحكم في درجة الحرارة للمرحلة إلى 20 درجة مئوية، أو ضبط درجة حرارة الغرفة إلى 20 درجة مئوية.</li>
	<li>وضع الشريحة عينة على المسرح المجهر. استخدم 100 x (الفتحة العددية = 1.3 أو أفضل) عدسة الهدف.</li>
	<li>البحث عن المجالات المبينة في الشكل 2 أ (بالنسبة wyIs251 والنقل محواري) أو الرقم 2 ب (بالنسبة mnIs17 وايفت) كعناصر إيجابية . يمكن تحليل مجالات أخرى ك جيدا 22-</li>
	<li>مجموعة المعلمات (مكاسب اتفاقية مكافحة التصحر = 200، بينينج = 1 أو 2، طاقة الليزر في 488 نانومتر = ميغاواط 1.0-1.3). إجراء تسجيل مرور الوقت 4 إطارات في الثانية لتصل إلى 1 دقيقة حفظ الملفات بتنسيق mutli TIFF- 
	ملاحظة: إذا كانت التجارة والنقل إشارات تختفي ومن الصعب الاستمرار في مراقبة GFP::RAB-3 أو OSM-6::GFP لمدة 30 ق، قوة الليزر قوية جداً. وفي هذه الحالة، تقليل قوة الليزر. على العكس من ذلك، إذا كان يتم تسجيل لا حركة حويصلية، قوة الليزر ضعيفة جداً. وفي هذه الحالة، زيادة قوة الليزر-</li>
	<li>مراقبة دودة مختلفة وكرر 5.3 و 5.4. الملاحظات التي يمكن أن تستمر لمدة تصل إلى 20 دقيقة، ولكن ينبغي أن تسجل كل دودة مرة واحدة فقط لتجنب آثار فالأضرار النموذجية- 
	ملاحظة: الديدان، وقد لوحظت لمدة 20 دقيقة على الأقل دون عيوب كبيرة 7 ، ، من 27 28. من الممكن مراقبة أطول لكن ملاذ &#39; تي تم اختباره بعد. إشارة واضحة لموت الخلايا العصبية هو تغير مورفولوجيا الخلايا العصبية مثل تورم نيوريتي. كما يتبين إشارات ضعيفة في التجارة والنقل في محاور عصبية و dendrites في wyIs251 و mnIs17، يمكن بسهولة التحقق مورفولوجيا نورت بمجرد النظر في محاور عصبية أو dendrites. ويبين الشكل 2 مورفولوجيا الخلايا العصبية.</li>
	<li>إنشاء ملفات الفيلم.
	ملف <ol><li>فتح TIFF متعددة باستخدام البرمجيات فيجي. انتقل إلى الملف &#62; ثم حدد فتح ملف TIFF متعدد بحفظه في الخطوة 5، 4- 
		ملاحظة: يمكن تحميل فيجي في jttps://fiji.sc. يمكن أيضا استخدام الصور ي والإضافات لتوليد كيموجرافس. في حالة القيام بذلك، اتبع الإرشادات ذات الصلة للبرنامج المساعد الذي تم اختياره.</li> <li>انقر فوق &#34; مستطيل التحديد &#34; زر ( الشكل 3 ، سهم) وتحديد مجال الاهتمام برسم مستطيل مع فأرة كمبيوتر (المستطيل الأصفر في الشكل 3 أ). انتقل إلى الصورة &#62; أكوام &#62; أدوات &#62; سوبستاكس وحدد أرقام الشرائح التي يتم تضمينها في الفيلم. يتم إنشاء سوبستاك.</li>
		تنشيط الإطار سوبستاك بواسطة النقر فوق <li>وانتقل إلى الصورة &#62; ضبط &#62; السطوع/. تظهر نافذة لضبط السطوع والتباين. في الإطار الشريحة الأعلى بار (الحد الأدنى) إلى اليمين حتى أن يختفي الإشارات الخلفية والثاني بار (الحد الأقصى) إلى اليسار حتى أن أعلى حويصلات تتحرك والجسيمات يمكن أن يرى جيدا على الخلفية-</li>
		<li>انتقل إلى الصورة &#62; أكوام &#62; الوقت محرد. كما يتم تسجيل الفيلم على 4 إطارات/ثانية في الخطوة 5، 4، الفاصل الزمني هو 0.25 s. وهكذا، اكتب &#34; 0.25 &#34; في الفاصل الزمني.</li>
		<li>بإنشاء ملف فيلم بتحديد حفظ باسم &#62; AVI من القائمة ملف (فيلم 1 و 2)- 
		ملاحظة: باستخدام الإضافات المناسبة، يمكنك حفظ الملف بتنسيقات أخرى مثل &#34; mpeg4 &#34; أو &#34; موف &#34; الملفات.</li>
	</ol></li> <li>تولد كيموجرافس.
	<ol><li>فتح الملفات الفيلم الأصلي باستخدام البرمجيات فيجي مرة أخرى، ثم كرر الخطوات من 5.6.2 و 5.6.3 لضبط السطوع والتباين.</li>
		<li>انقر فوق &#34; تقسيم خط &#34; ( الشكل 3 ب، السهم). استخدام ماوس, رسم خط مجزأة على طول أهداب أو إكسون (الخط الأصفر، في الشكل 3 ب)-</li>
		<li>الذهاب إلى تحليل &#62; كيموجراف متعدد &#62; متعدد كيموجراف ( الشكل 3 ج). يظهر إطار عرض الخط ( الشكل 3 د). نوع &#34; 3 &#34; في نافذة لينيويدث وانقر فوق موافق ( الشكل 3 د)-</li>
		يتم إنشاء إطار كيموجراف <li>. حفظ الصورة بتنسيق TIFF أو JPEG.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+in+neurons:+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function,+development,+and+disease.">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).</li><li>Holzbaur, E. L., Scherer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules,+axonal+transport,+and+neuropathy.">Microtubules, axonal transport, and neuropathy.</a> N Engl J Med. 365 (24), 2330-2332 (2011).</li><li>Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+axonemal+dyneins+as+studied+in+Chlamydomonas+mutants.">Functional diversity of axonemal dyneins as studied in Chlamydomonas mutants.</a> Int Rev Cytol. 219, 115-155 (2002).</li><li>Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraflagellar+transport+motors+in+cilia:+moving+along+the+cell's+antenna.">Intraflagellar transport motors in cilia: moving along the cell's antenna.</a> J Cell Biol. 180 (1), 23-29 (2008).</li><li>Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraflagellar+transport.">Intraflagellar transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (11), 813-825 (2002).</li><li>Ishikawa, H., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliogenesis:+building+the+cell's+antenna.">Ciliogenesis: building the cell's antenna.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (4), 222-234 (2011).</li><li>Niwa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinhibition+of+a+Neuronal+Kinesin+UNC-104/KIF1A+Regulates+the+Size+and+Density+of+Synapses.">Autoinhibition of a Neuronal Kinesin UNC-104/KIF1A Regulates the Size and Density of Synapses.</a> Cell Rep. 16 (8), 2129-2141 (2016).</li><li>Snow, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+anterograde+intraflagellar+transport+motors+cooperate+to+build+sensory+cilia+on+C.+elegans+neurons.">Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).</li><li>Ou, G., Blacque, O. E., Snow, J. J., Leroux, M. R., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coordination+of+intraflagellar+transport+motors.">Functional coordination of intraflagellar transport motors.</a> Nature. 436 (7050), 583-587 (2005).</li><li>Zhou, R., Niwa, S., Homma, N., Takei, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF26A+is+an+unconventional+kinesin+and+regulates+GDNF-Ret+signaling+in+enteric+neuronal+development.">KIF26A is an unconventional kinesin and regulates GDNF-Ret signaling in enteric neuronal development.</a> Cell. 139 (4), 802-813 (2009).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charcot-Marie-Tooth+disease+type+2A+caused+by+mutation+in+a+microtubule+motor+KIF1Bbeta.">Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIF1Bbeta.</a> Cell. 105 (5), 587-597 (2001).</li><li>Niwa, S., Tanaka, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF1Bbeta-+and+KIF1A-mediated+axonal+transport+of+presynaptic+regulator+Rab3+occurs+in+a+GTP-dependent+manner+through+DENN/MADD.">KIF1Bbeta- and KIF1A-mediated axonal transport of presynaptic regulator Rab3 occurs in a GTP-dependent manner through DENN/MADD.</a> Nat Cell Biol. 10 (11), 1269-1279 (2008).</li><li>Zhou, R., Niwa, S., Guillaud, L., Tong, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+motor,+KIF13A,+controls+anxiety+by+transporting+the+serotonin+type+1A+receptor.">A molecular motor, KIF13A, controls anxiety by transporting the serotonin type 1A receptor.</a> Cell Rep. 3 (2), 509-519 (2013).</li><li>Klassen, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Arf-like+small+G+protein,+ARL-8,+promotes+the+axonal+transport+of+presynaptic+cargoes+by+suppressing+vesicle+aggregation.">An Arf-like small G protein, ARL-8, promotes the axonal transport of presynaptic cargoes by suppressing vesicle aggregation.</a> Neuron. 66 (5), 710-723 (2010).</li><li>Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+microfluidic+devices+for+in+vivo+imaging+of+C.+elegans,+Drosophila+and+zebrafish.">Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li><li>Chai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+cellular+dynamics+during+Caenorhabditis+elegans+postembryonic+development.">Live imaging of cellular dynamics during Caenorhabditis elegans postembryonic development.</a> Nat Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).</li><li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+using+nanoparticle-mediated+immobilization.">Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization.</a> PLoS One. 8 (1), 53419 (2013).</li><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), (2008).</li><li>Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+osm-6,+a+gene+that+affects+sensory+cilium+structure+and+sensory+neuron+function+in+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 148 (1), 187-200 (1998).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nephronophthisis-related+gene+ift-139+is+required+for+ciliogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">The nephronophthisis-related gene ift-139 is required for ciliogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Sci Rep. 6, 31544 (2016).</li><li>Maeder, C. I., San-Miguel, A., Wu, E. Y., Lu, H., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+neuron-wide+analysis+of+synaptic+vesicle+precursor+trafficking.">In vivo neuron-wide analysis of synaptic vesicle precursor trafficking.</a> Traffic. 15 (3), 273-291 (2014).</li><li>Wu, Y. E., Huo, L., Maeder, C. I., Feng, W., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+balance+between+capture+and+dissociation+of+presynaptic+proteins+controls+the+spatial+distribution+of+synapses.">The balance between capture and dissociation of presynaptic proteins controls the spatial distribution of synapses.</a> Neuron. 78 (6), 994-1011 (2013).</li><li>Dwyer, N. D., Adler, C. E., Crump, J. G., L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+dendritic+transport+and+the+AP-1+mu1+clathrin+adaptor+UNC-101+localize+odorant+receptors+to+olfactory+cilia.">Polarized dendritic transport and the AP-1 mu1 clathrin adaptor UNC-101 localize odorant receptors to olfactory cilia.</a> Neuron. 31 (2), 277-287 (2001).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 177-206 (2012).</li><li>Kumar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+Kinesin-3+motor+UNC-104/KIF1A+is+degraded+upon+loss+of+specific+binding+to+cargo.">The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo.</a> PLoS Genet. 6 (11), 1001200 (2010).</li><li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vesicle+protein+SAM-4+regulates+the+processivity+of+synaptic+vesicle+transport.">The vesicle protein SAM-4 regulates the processivity of synaptic vesicle transport.</a> PLoS Genet. 10 (10), 1004644 (2014).</li><li>Blacque, O. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WD+repeat-containing+protein+IFTA-1+is+required+for+retrograde+intraflagellar+transport.">The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport.</a> Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).</li><li>Evans, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+modulation+of+IFT+kinesins+extends+the+sensory+repertoire+of+ciliated+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans.</a> J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li><li>Bindels, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mScarlet:+a+bright+monomeric+red+fluorescent+protein+for+cellular+imaging.">mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging.</a> Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).</li><li>Prevo, B., Mangeol, P., Oswald, F., Scholey, J. M., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differentiation+of+cooperating+kinesin-2+motors+orchestrates+cargo+import+and+transport+in+C.+elegans+cilia.">Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia.</a> Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).</li><li>Robison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detyrosinated+microtubules+buckle+and+bear+load+in+contracting+cardiomyocytes.">Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes.</a> Science. 352 (6284), 0659 (2016).</li><li>Hayashi, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+superresolution+fluorescence+imaging+with+spinning+disk+confocal+microscope+optics.">Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics.</a> Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).</li></ol>

ليس له علاقة بالكشف عن صاحب البلاغ.

التقادم فيما يتعلق بالأساليب القائمة الأسلوب الموصوفة هنا هو الأمثل لمراقبة الأحداث سريعة مثل النقل محواري وايفت. وهكذا، الأولوية لتجميد أكثر من حضانة أطول. بينما تمكنا من مراقبة الاتجار الأحداث لمدة 20 دقيقة على الأقل دون اضطراب كبير، هذا الأسلوب قد لا تكون دائماً مناسبة لمرا?...

تصوير الخلية الحية أداة أساسية لتحليل النقل داخل الخلايا. في بيولوجيا الخلايا العصبية، تحليلات للنقل محواري مع تصوير الخلية الحية ضرورية لفهم العصبية الدالة و morphogenesis1. عيوب في النقل محواري تكمن وراء عدة اضطرابات الأعصاب2. Kinesin فوق عائلة البروتينات ودينين القيام بالنقل محواري أنتيروجراديلي وريتروجراديلي، على التوالي1،2.
أهداب هي آخر حجرة الخلوية التي هي الشبكة ميكروتوبولي وآلية الاتجار المتقدمة جداً3. يتم ترجمة البروتين التوليف إليه لا بأهداب، مما يعني أنه يتعين نقل البروتينات الهدبية من السيتوبلازم إلى نصائح أهداب. Kinesin الخاصة بأهداب ودينين، يسمى kinesin-2 وهيولى دينين-2، على التوالي، ونقل مكونات أهداب4، في ظاهرة تسمى النقل إينترافلاجيلار (ايفت)5. أسباب إعاقة IFT طائفة أمراض تسمى سيليوباثيس6. وهكذا، مطلوب تحليل إليه ايفت بتصوير الخلايا الحية لفهم الآليات الأساسية لتشكيل الهدبية والمرضية.
ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) نموذج جيد لدراسة النقل محواري وايفت7،،من89. لمراقبة ايفت، Chlamydomonas قد استخدمت على نطاق واسع كنموذج كائن5،6. كما تشلاميدوموناس كائن أحادي الخلية، سيكون من الصعب لتحليل علاقة ايفت بالشيخوخة ووظيفة الخلايا العصبية والسلوك. وبالإضافة إلى ذلك، طبقت لا التقنيات الوراثية الأساسية مثل كريسبر/Cas9 إلى تشلاميدوموناس. في أعلى نموذج الكائنات، مثل الفئران و المورفولوجية، يسبب تعطل النقل محواري و IFT وكثيراً ما تعمل قاتلة لأن النقل محواري و IFT ضرورية ل morphogenesis والتوازن من الحيوانات 10، 11. في حالة الفئران، خلية ثقافة وتعداء عموما مطلوب لمراقبة النقل محواري وإيفت، الأمر الذي يتطلب الكثير من المهارات والوقت واسعة12،13. وبالإضافة إلى ذلك، قد فقدت الكثير من سياق الفسيولوجية الهامة في الخلايا المستزرعة وخطوط الخلية. للجهاز العصبي ليست ضرورية للبقاء على قيد الحياة الديدان، تعطلت C. ايليجانس طفرات في النقل محواري أو إيفت التي غالباً ما تكون غير قاتلة7،،من914. النقل محواري وايفت يمكن مباشرة ملاحظة في فيفو دون تشريح لأن C. ايليجانس شفافة وذلك من السهل ملاحظة علامات معلم بروتينات فلورية خضراء.
وهناك العديد من البروتوكولات شل C. ايليجانس، مثل استخدام جهاز موائع جزيئية15ومنصات [اغروس] مع التخدير16أو17من ميكروبيدس. إدراج التخدير قد تمنع الاتجار الأحداث في الخلايا العصبية15. عيب واضح من الأسلوب موائع جزيئية-الجهاز أن إعداد جهاز موائع جزيئية ليس دائماً أمرا سهلاً. بدلاً من ذلك، يتم التثبيت قبل ميكروبيدس ومنصات [اغروس] طريقة مريحة وسهلة لإجراء تصوير مرور الزمن في C. ايليجانس. وهنا أصف هذا البروتوكول الأساسية شل C. ايليجانس ووضع تصور للنقل محواري وايفت في فيفو في C. ايليجانس. مقارنة بالأساليب الأخرى، الطريقة الموضحة هنا لا تتطلب معدات خاصة، وهو أرخص بكثير وأسهل لتنفيذ.

<table><tbody><tr><td>Slideglass (76&amp;nbsp; x 26 mm)</td><td>Matsunami</td><td>S1111</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass (22&amp;nbsp; x 40 mm)</td><td>Matsunami</td><td>C024401</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Wako</td><td>318-01195</td><td></td></tr><tr><td>Polystylene microbeads 0.1 micron</td><td>Polysciences</td><td>#00876</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>TAITEC</td><td>0063288-000</td><td>CTU-mini</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td>widefield microscope</td></tr><tr><td>Spinning disk Scanner</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td><td>spinning disc confocal scanner&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Digital CCD camera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C10600-10B</td><td>ORCA-R2 degital CCD camera</td></tr><tr><td>Objective lens (x100, NA1.4)</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 100XO</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipette (5 inch)</td><td>IWAKI</td><td>IK-PAS-5P</td><td></td></tr><tr><td>Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm)</td><td>IWAKI</td><td>9820TST15-105NP</td><td></td></tr><tr><td>TV9211: &lt;em&gt;wyIs251&lt;/em&gt;</td><td>Laboratory of Kang Shen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>OTL11: &lt;em&gt;mnIs17&lt;/em&gt;</td><td>Ref. 27, 29</td><td>N/A</td><td>SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>435064-9000-000</td><td>STEMI 508&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mirror transillumination unit</td><td>Carl Zeiss</td><td>435425-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>platinum wire (0.2 mm)</td><td>Nilaco Corporation</td><td>m78483501</td><td></td></tr><tr><td>60 mm plastic dish</td><td>Falcon</td><td>#351007</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>https://fiji.sc/</td></tr><tr><td>nematode growth medium (NGM)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

immobilization of caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons

محواري النقل والنقل إينترافلاجيلار (ايفت) ضرورية ل morphogenesis إكسون واهداب والدالة. Kinesin فوق عائلة البروتينات ودينين من المحركات الجزيئية التي تنظم أنتيروجرادي والنقل إلى الوراء، على التوالي. هذه المحركات تستخدم شبكات microtubule كالقضبان. ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) كائن نموذج قوية لدراسة النقل محواري وايفت في فيفو. هنا، أود أن أصف بروتوكول لمراقبة النقل محواري وايفت في المعيشة C. ايليجانس. يمكن تصور البضائع المشحونة بعلامات البضائع البروتينات باستخدام البروتينات الفلورية مثل البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل). C. ايليجانس يتسم بالشفافية ويمكن التعبير عن البروتينات البضائع معلم بروتينات فلورية خضراء في خلايا معينة تحت المروجين خلية على حدة. يمكن أن تكون ثابتة الديدان الحية التي ميكروبيدس على 10% [اغروس] هلام دون قتل أو أنيسثيتيزينج الديدان. في ظل هذه الظروف، حركة نقل البضائع مباشرة يلاحظ في محاور عصبية واهداب المعيشة C. ايليجانس دون تشريح. يمكن تطبيق هذه الطريقة لمراقبة أي جزيء البضائع في أي من الخلايا عن طريق تعديل بروتينات المستهدفة و/أو الخلايا يتم التعبير عنها في. هي المصانة البروتينات الأساسية مثل المحركات الجزيئية ومحول البروتينات التي تشارك في نقل محواري وايفت في C. ايليجانس. بالمقارنة مع غيرها من الكائنات نموذج، يمكن الحصول على طفرات وصيانتها بسهولة أكبر في C. ايليجانس. يمكن دمج هذا الأسلوب مع مختلف C. ايليجانس طفرات لتوضيح الآليات الجزيئية للنقل محواري وايفت.

النقل محواري في الخلايا العصبية DA9 استخدام خط wyIs251 ، أنتيروجرادي والنقل إلى الوراء محواري GFP::RAB-3 يمكن في نفس الوقت تسجيل في العصبون DA9. متوسط سرعة anterograde والنقل إلى الوراء في إكسون الظهرية الدانية من العصبية DA9 هو حوالي 1.8 و 2.6 ميكرومتر/s، على التوالي...

Watch this Scientific Journal Video about Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons at JoVE.com

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) نموذج جيد لدراسة النقل محواري وداخل الخلايا. وهنا أصف على بروتوكول في فيفو تسجيل وتحليل للنقل محواري وإينترافلاجيلار في C. ايليجانس.

التثبيت من ايليجانس كاينورهابديتيس "تحليل النقل داخل الخلايا" في الخلايا العصبية

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

immobilization-caenorhabditis-elegans-to-analyze-intracellular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

8.0K Views.  Tohoku University. ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) نموذج جيد لدراسة النقل محواري وداخل الخلايا. وهنا أصف على بروتوكول في فيفو تسجيل وتحليل للنقل محواري وإينترافلاجيلار في C. ايليجانس.

Video: Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

ميكروفلويديك أجهزة بسيطة لل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من<em&gt; C. ايليجانس</em&gt;،<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; واسماك الزرد

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Bioengineering

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

في فيفو الكالسيوم التصوير في c. الهيئة عضلات الجدار الجسم

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Biochemistry

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

الكالسيوم في الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية في C. ايليجانس

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Neuroscience

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers الاغاروز لفترة طويلة التصوير الكالسيوم من<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

تصوير راتيوميتريك الكالسيوم من الخلايا العصبية الفردية في التصرف ايليجانس كاينورهابديتيس

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

شريحة موائع دقيقة بسيطة للنمو على المدى الطويل وتصوير Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the neurotransmitter glutamate, and the excessive stimulation of its postsynaptic receptors. However, information on the subsequent molecular events that culminate in the distinct neuronal swelling morphology of this type of neurodegeneration is lacking. Other aspects, such as changes in specific subcellular compartments, or the basis for the differential cellular vulnerability of distinct neuronal subtypes, remain under-explored. Furthermore, a range of factors that come into play in studies that use in vitro or ex vivo preparations might modify and distort the natural progression of this form of neurodegeneration. It is therefore important to study excitotoxic necrosis in live animals by monitoring the effects of interventions that regulate the extent of neuronal necrosis in the genetically amenable and transparent&#160;model system of the nematode Caenorhabditis elegans. This protocol describes methods of studying excitotoxic necrosis in C. elegans neurons, combining optical, genetic, and molecular analysis. To induce excitotoxic conditions in C. elegans, a&#160;knockout of a glutamate transporter gene (glt-3) is combined with a neuronal sensitizing genetic background (nuls5 [Pglr-1::G&#945;S(Q227L)]) to produce glutamate receptor hyperstimulation and neurodegeneration. Nomarski differential interference contrast (DIC), fluorescent, and confocal microscopy in live animals are methods used to quantify neurodegeneration, follow subcellular localization of fluorescently labeled proteins, and quantify mitochondrial morphology in the degenerating neurons. Neuronal Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) is used to distinctly sort at-risk neurons for cell-type specific transcriptomic analysis of neurodegeneration. A combination of live imaging and FACS methods as well as the benefits of the C. elegans model organism allow researchers to leverage this system to obtain reproducible data with a large sample size. Insights from these assays could translate to novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative diseases.

<meta charset="utf8"></head><body>طرق التصوير الحيواني الحي وفرز الخلايا للتحقيق في التنكس العصبي في C. ايليجانس نموذج النخر السام المثير

In a C. elegans excitotoxicity model, this protocol employs in vivo imaging to analyze the regulation of necrotic neurodegeneration, the effect of genes encoding candidate mediators, and involvement of mitochondria. Cell dissociation and sorting is used to specifically obtain at-risk neurons for cell-specific transcriptomic analysis of neurodegeneration and neuroprotection mechanisms.

طرق التصوير الحيواني الحي وفرز الخلايا للتحقيق في التنكس العصبي في C. ايليجانس نموذج النخر السام المثير

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the ...

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

في الجسم الحي تقييم ديناميات Microtubule والتوجه في Caenorhabditis elegans الخلايا العصبية

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

التصوير تحت الخلوي للتعامل مع الكالسيوم العصبي في الجسم الحي

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

التثبيت من ايليجانس كاينورهابديتيس "تحليل النقل داخل الخلايا" في الخلايا العصبية

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ميكروفلويديك أجهزة بسيطة لل

في فيفو الكالسيوم التصوير في c. الهيئة عضلات الجدار الجسم

الكالسيوم في الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية في C. ايليجانس

Microchambers الاغاروز لفترة طويلة التصوير الكالسيوم من

تصوير راتيوميتريك الكالسيوم من الخلايا العصبية الفردية في التصرف ايليجانس كاينورهابديتيس

شريحة موائع دقيقة بسيطة للنمو على المدى الطويل وتصوير Caenorhabditis elegans

طرق التصوير الحيواني الحي وفرز الخلايا للتحقيق في التنكس العصبي في C. ايليجانس نموذج النخر السام المثير

طرق التصوير الحيواني الحي وفرز الخلايا للتحقيق في التنكس العصبي في C. ايليجانس نموذج النخر السام المثير

في الجسم الحي تقييم ديناميات Microtubule والتوجه في Caenorhabditis elegans الخلايا العصبية

التصوير تحت الخلوي للتعامل مع الكالسيوم العصبي في الجسم الحي