يوفر هذا البروتوكول طريقتين لتعبئة C.Elegans لأداء في التصوير الكلسيوم في الجسم من عضلات جدار الجسم. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة المتعلقة بتحلل الكالسيوم ومعالجة الكالسيوم، وتشابك يمكن الوصول إليه في الكائن الحي القابل للتصلب وراثياً. هذه التقنية يمكن أن توفر فهما أفضل للآليات التي تنظم العضلات التوازن الكالسيوم، ويمكن، لذلك، أن تكون مهمة في تحديد الظروف أو المسارات الجزيئية التي تؤثر على اقتران انكماش الإثارة من خلال سوء تنظيم دورة الكالسيوم.
هذه الأساليب يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في مجالات البحوث بما في ذلك، ولكن ليس محدودة جدا، والبيولوجيا العصبية، والبيولوجيا التنموية، وبيولوجيا الخلايا. ويمكن تكييف هذه التقنيات لدراسة مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا وC.elegans، والنيماتودا ذات الصلة الأخرى وكذلك يرقات الفلزات. إن العرض المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية حتى يتمكن المجرب من فهم تقنية التشريح ، ويكون قادرًا على تقييم عابري الكالسيوم بدقة من الحيوانات التي تم شل حركتها بشكل صحيح.
ابدأ بإعداد المجهر للتصوير الفلورسنت. استخدم كاميرا CMOS العلمية القادرة على تصوير الإطار الكامل في 100 هرتز من أجل تتبع التغيرات السريعة في مستويات الكالسيوم. السيطرة على اقتناء الكاميرا والإثارة LED الفلورسنت مع برنامج micromanager تعمل في ImageJ.
استخدام منصة إلكترونية مفتوحة المصدر المكونات في الذي يتصل خارجي لوحة متحكم في مصادر مفتوحة لإدارة نبضات توقيت خارجي التي تتحكم في الإثارة الفلورسنت. للتحكم في منطق التوقيت، قم بتنشيط بروتوكول الاستحواذ على ميكرو ماجير في البرنامج وفقًا لتعليمات المصنعين. استخدام اثنين من المصابيح لتحفيز rhodopsin قناة مع الضوء الأزرق وتسجيل التغييرات RCaMP.
تنشيط rhodopsin قناة مع صباحا LED مع الطول الموجي القبول الذروة من 470 نانومتر ومرشح bandpass، ويثير RCaMP مع الصمام مع الطول الموجي القبول ذروة من 594 نانومتر ومرشح شريط. شارك في إضاءة كل من المصابيح ونقل الضوء إلى نفس المسار البصري باستخدام الجمع بين شعاع dichroic. التحكم في توقيت إضاءة LED بواسطة مفاتيح الحالة الصلبة التي تتحكم فيها إشارات TTL وفقًا لاتجاهات المخطوطات، وقم بتعيين شدة LED مع إمدادات الطاقة الخطية الحالية لضجيج الحمولة، ثم قم ببرمجة بروتوكول محاكاة الضوء الأزرق في جهاز محاكاة.
في هذه التجربة تشغيل محاكاة الضوء الأزرق بعد ثانيتين من التقاط الفلوري RCaMP فقط واستخدام قطار من خمسة، اثنين من نبضات الضوء الأزرق ميلي ثانية مع فترات 50 ميلي ثانية لتنشيط rhodopsin قناة. إذا كان استخدام إعداد التشريح، أداء تشريح C.elegans في ضوء منخفض. ضع الحيوانات في طبق التشريح مع قاعدة غطاء الأغطية المغلفة بالسيليكون التي تمتلئ بمليمول واحد من محلول الكالسيوم خارج الخلية المعد وفقًا لاتجاهات المخطوطات.
الغراء أسفل الحيوانات باستخدام لاصقة الجلد الموضعي السائل مع التلوين الأزرق على طول الجانب الظهري من الدودة. وجعل شق بشرة جانبية على طول واجهة الغراء ودودة باستخدام الإبر الزجاجية. استخدام ماصة الفم لمسح الحشوة الداخلية من تجويف الدودة، ثم الغراء أسفل رفرف بشرة من الحيوان لفضح عضلات جدار الجسم البطني للتصوير.
إذا كان استخدام إعداد حبة النانو، وجعل حل 5٪ أغرا المنصهر باستخدام الماء المقطر إلى حجم النهائي من 100 ملليلتر. استخدام ماصة باستور لوضع قطرة من حل المصهور أغرا على شريحة زجاجية وعلى الفور وضع شريحة زجاجية ثانية على الجزء العلوي باستخدام الضغط بلطف لإنشاء لوحة حتى أغرا. إزالة الشريحة العلوية وعلى ما يقرب من أربعة ميكرولترات من البوليسترين نانو الخرز إلى منتصف لوحة.
في ضوء منخفض إضافة أربعة إلى ستة C.elegans في حل الخرز نانو، والتأكد من أن الحيوانات لا تكمن فوق بعضها البعض، ووضع بعناية coverslip على القمة. عندما تكون جاهزة للصورة، وضع الشريحة المعدة أو طبق تشريح على المجهر والعثور على والتركيز على دودة باستخدام 10 مرات التكبير والإضاءة حقل مشرق خافت. التبديل إلى 60 مرة التكبير في الإثارة الفلورية RCaMP لتحديد عضلات جدار الجسم فينتروم الوسيطة التي هي في الجزء الأمامي من الفرج وفي الطائرة الصوتية الصحيحة.
ثم تغيير مسار الصورة من العدسة إلى الكاميرا عن طريق سحب التبديل والنقر على الهواء مباشرة داخل برنامج الحصول على البيانات. انقر فوق الزر ORI في برنامج الحصول على البيانات، ثم قم بإنشاء مربع حول العضلات التي يتم التركيز عليها. على المحفز، قم بالتبديل على مسار تحفيز الضوء الأزرق المبرمج مسبقًا، ثم انقر فوق الحصول على برنامج التصوير لالتقاط الصورة.
عندما تزرع C.elegans على جميع عبر شبكية العين، ودمج بنجاح الشبكية وتفعيل rhodopsin قناة، يمكن استحضار عابر الكالسيوم. إذا لم تتعرض الحيوانات إلى شبكية العين عبر جميع يتم تشغيل أي العضلات والكالسيوم عابر. وقد استخدم هذا البروتوكول للتحقيق في فقدان وظيفة سخرة sca-1، والتي تؤثر على مضخة الكالسيوم الساركبلاسميك ترميز من قبل الجين sca-1.
ولكن، لوحظت الزيادات في إعداد التشريح في مستويات خط الأساس من الفلورية RCaMP في المتحولة مقارنة بالسيطرة، مما يشير إلى أن الطفرة تحتاج إلى مستويات مرتفعة من الكالسيوم السيتوبلازمي يستريح. كان هناك انخفاض كبير في مستويات الذروة الكالسيوم في المسوخ sca-1 بالمقارنة مع عنصر التحكم. ومع ذلك، لم يظهر أي تغيير في وقت الذروة أو نصف وقت الاضمحلال.
الأهم من ذلك، يمكن ملاحظة نتائج مماثلة باستخدام أقل تحديا من الناحية الفنية إعداد حبة النانو. تم تقييم فقدان وظيفة سلو المسوخ، التي تعطل قنوات البوتاسيوم الكبيرة تنشيط الكالسيوم من أجل التحقيق في المسوخ التي تؤثر بشكل غير مباشر على التعامل مع الكالسيوم في C.elegans. عندما تم قياس مستويات خط الأساس من RCaMP المسوخ عرض زيادة الفلوريس مقارنة بالضوابط.
عند تقييم حركية من الكالسيوم عابر لم ينظر إلى أي تغييرات في مستويات ذروة الكالسيوم. ومع ذلك، أظهرت المسوخ slo-1 (eg142) زيادة كبيرة في الارتفاع إلى وقت الذروة. أهم خطوة يجب تذكرها عند إكمال الإجراء هي تجهيز الحيوانات التجريبية في شبكية العين عبر جميع.
بدون هذه الخطوة سوف rhodopsin قناة تكون غير نشطة، ومنع العابرين الكالسيوم الناجم عن الضوء من أن يتم تشغيلها. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء الفيزيولوجيا الكهربائية والتحليل السلوكي لتقييم التأثير الوظيفي لأي تغيرات ملحوظة في التوازن بين الكالسيوم. باستخدام أساليب التثبيت المبينة هنا، يمهد الطريق لمزيد من الاستكشاف لديناميات الكالسيوم ويوضح أنه يمكن ملاحظة نتائج قابلة للمقارنة استجابة لتحفيز الخلايا العصبية optogenetic والتقاط عابرة العضلات الكالسيوم باستخدام تقنية شل حبة أقل تحديا بكثير.
