Name: immobilization of caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons
Uploaded: 2017-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons at JoVE.com

O autor agradece profundamente Dr. Asako Sugimoto (Universidade de Tohoku) para a discussão útil. wyIs251 foi um presente generoso do Dr. Kang Shen (Universidade de Stanford). mnIs17 foi fornecido pelo CGC, que é financiado pelo NIH escritório de programas de infra-estrutura de pesquisa (OD010440 P40). Este trabalho foi apoiado por grant JSPS KAKENHI #17 H 05010 e #16 H 06536 e Daiichi Sankyo foundation, Fundação da ciência do cérebro e Fundação Naito.

1. preparação da amostra <ol><li>gerar um transgénico c. elegans estirpe de interesse usando metodologias transgénicos 18. Como alternativa, obter cepas apropriadas de centro de genética o Caenorhabditis (CGC). Para visualizar o transporte axonal de precursores da vesícula sináptica, use a linha transgênicos wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. Para observar o IFT, obter a linha transgênicos mnIs17 [osm-6::gfp] 19. Estas variedades são utilizadas neste protocolo. 
	Nota: Qualquer matriz extracromossômico, integração genômica ou mesmo GFP bater-em obras. Para reduzir os sinais de fundo, usar promotores específicos de célula, ao invés de promotores pan-neuronal. 
	Nota: Manutenção de vermes é descrita em outros protocolos de 20. Cepas foram mantidas nos relvados do alimentador Escherischia coli OP50 no crescimento de nematoides médio chapas (NGM) (agarose 1,7% (p/v), 50 mM de NaCl, 0,25% (p/v) de peptona, 1 mM CaCl 2, 5mg/mL colesterol, 25mm KH 2 PO 4, 1mm MgSO 4 pratos plásticos de 60 mm de diâmetro) a 20 ° C.</li>
	<li>Crescem vermes a 20 ° C em placas NGM para qualquer estágio do ciclo de vida dos vermes. 
	Nota: Pode-se observar tanto o transporte axonal e o IFT em qualquer fase. L4 atrasado para o jovem adulto é um bom controlo positivo porque várias publicações têm usado estes estágios e eventos visualizado tráfico de 14 , 21 , 22 , 23.</li>
</ol> 2. Preparação de 10% Agarose Nota: muitos fornecedores oferecem produtos similares, tais como pó de ágar-ágar, ágar e agarose. Use a electroforese da classe agarose (força do gel &#62; 1200 g/cm 2). Pó de ágar barato não funcionam porque o gel resultante não é forte o suficiente para imobilizar vermes.
<ol><li>Mix 0,4 g de agarose em 4 mL de água destilada (DW) de água em um tubo de vidro (1,5 x 10,5 cm). Coloque uma tampa do tubo de vidro para evitar a evaporação.</li>
	<li>Colocar o tubo de vidro em um bloco de calor de 95 ° C por 90 min. Além disso, preparar um outro tubo de vidro (1,5 cm x 10,5 cm) repleto de DW e mantê-lo em 95 ° C. colocar uma pipeta Pasteur na 95 ° C DW ( Figura 1 A). Será visto um monte de pequenas bolhas no tubo de agarose e a solução deve ser turva. Deixá-lo até que a solução torna-se claro. Em seguida, misture pipetando acima e para baixo até que a solução de agarose torna-se homogênea. 
	Nota: O micro-ondas não podem ser usadas para preparar a solução de agarose de 10% quando feita de DW e agarose. Pequenas bolhas causadas por microondas evitar derretimento de agarose. No entanto, solidificado 10% gel de agarose facilmente pode ser derretido novamente usando um microondas. Tubos de vidro contendo 10% de gel de agarose podem ser preparados antecipadamente e armazenados a 4 ° C durante pelo menos 6 meses. Se fazê-lo, derreter o estoque usando microondas quando necessário e começar a partir do passo 3 neste protocolo. 
	Nota: Agarose perde gradualmente a capacidade de solidificar-se incubada a 95 ° C por um longo tempo ou após repetidas de solidificação e fusão. Se isso acontecer, prepare-se nova 10% agarose.</li>
</ol> 3. Preparação de Agarose Pad <ol><li>usando a pipeta de Pasteur aquecida preparada no passo 2.2, colocar 2 gotas de agarose de 10% em um slide 76 x 22 mm.</li>
	<li>Rapidamente a tampa com um slide de 2 76 x 22 mm segundo antes da queda de agarose solidifica como mostrado na Figura 1 B e empurrar para baixo o segundo slide para achatar a solução de agarose. A espessura deve ser de 0,5-1 mm.</li>
	<li>Rapidamente lave a pipeta Pasteur por pipetagem 95 ° C DW acima e para baixo até que a solução de agarose é lavada para fora. Caso contrário, a pipeta vai ficar obstruída por gel de agarose. Deixar a pipeta de pé na 95 ° C DW.</li>
	<li>Espera por 1 min. A almofada de agarose forma e torna-se turva. Em seguida, deslize os slides separados pela mão ( Figura 1 C).</li>
</ol> 4. Montagem de vermes Nota: mesmo pequenas quantidades de movimento worm impedem boa observação. Levamisole tradicionalmente tem sido utilizada para prevenir o movimento worm a almofada de agarose 24 , 25. No entanto, Levamisole inibe receptores neuronais em c. elegans e, portanto, pode afetar os eventos de tráfico em neurônios 15. Usar o poliestireno microbeads descrito aqui é uma boa alternativa 17.
<ol><li>Sob um microscópio estéreo equipado com uma transiluminação espelho deslizável, transfer ~ 30 vermes transgênicos expressando os marcadores apropriados para um novo NGM placa sem bactérias usando um fio de platina escolher. 
	Nota: Escolher um fio de platina é feita de fio de platina e pipeta Pasteur (5 polegadas), e a ponta do fio de platina foi achatada. A preparação das picaretas fio de platina e manipulação de vermes com estes são descritos no Wormbook (http://www.wormbook.org).</li>
	<li>Deixar o prato para 1 min. bactérias são removidas automaticamente das superfícies de vermes como os vermes se move em gel de agarose NGM sem bactérias.</li>
	<li>Colocar um 0,5-1,0 µ l queda de 2,6% 100 nm de diâmetro poliestireno microbeads em água sobre a placa de ágar-ágar ( Figura 1 D). Transferi 10-20 vermes da placa NGM livre de bactérias para o microbeads. Gota e espalhar os vermes usando o fio de platina escolher para evitar a sobreposição de verme corpos ( Figura 1 E).</li>
	<li>Uma lamela 22 x 40 mm 2 ( Figura 1-F). Empurre suavemente para remover as bolhas de ar, mas evitar o esmagamento de vermes. A amostra está agora pronta para tratamento de imagens. 
	Nota: Porque sem anestesia é administrada, vermes são fixados apenas pela força friccional gerada pelo bloco de ágar e poliestireno microbeads lamela 17. A presença de bactérias do alimentador e/ou demais solução fará com que a força de fricção mais fraco. 
	Nota: Tamanhos diferentes de lamelas (por exemplo, 22 x 22mm 2, 18 x 18 mm 2) de trabalho. No entanto, as lamelas de maiores podem evitar imersão água ou óleo a partir da lente objetiva vazando para amostras durante a observação.</li>
</ol> 5. Observação Nota: parâmetros de imagem apropriados (poder do laser, ganho, binning, etc.) serão diferentes para cada sistema de microscópio e câmera. Aqui, um microscópio widefield equipado com um scanner confocal de disco giratório e uma câmera CCD digital é usado.
<ol><li>Regule a temperatura da fase de 20 ° C, ou ajustar a temperatura ambiente de 20 ° C.</li>
	<li>Colocar o slide de amostra no palco microscópio. Use x 100 (abertura numérica = 1.3 ou superior) da lente objetiva.</li>
	<li>Olha para as áreas indicadas na Figura 2 (para wyIs251 e transporte axonal) ou Figura 2 B (para mnIs17 e IFT) como controles positivos . Outras áreas podem ser analisadas como bem 22.</li>
	<li>Conjunto de parâmetros (CCD ganho = 200, Binning = 1 ou 2, a potência do laser em 488 nm = 1.0-1.3 mW). Executar a gravação de lapso de tempo em 4 frames/s para até 1 min. salvar arquivos como mutli-TIFF formato. 
	Nota: Se a GFP sinais de desaparecer e é difícil continuar a observar GFP::RAB-3 ou OSM-6::GFP por 30 s, a potência do laser é muito forte. Nesse caso, reduza a potência do laser. Por outro lado, se nenhum movimento vesicular é registrado, a potência do laser é muito fraca. Nesse caso, aumentar a potência do laser.</li>
	<li>Observar um worm diferente e repetir 5.3 e 5.4. As observações podem durar por até 20 min., mas cada verme deve ser registrada apenas uma vez para evitar os efeitos de pAcredita danos. 
	Nota: Worms foram observados pelo menos 20 min sem defeitos significativos de 27 , 7 , 28. Mais observação pode ser possível, mas refúgio &#39; t sido testado ainda. Um sinal claro da morte neuronal é a mudança da morfologia neuronal, tais como inchaço do axônio. Como sinais fracos do GFP podem ser vistos nos axônios e dendritos em wyIs251 e mnIs17, morfologia do axônio pode ser facilmente verificada olhando apenas axônios ou dendritos. Morfologia neuronal é mostrada na Figura 2.</li>
	<li>Gerar arquivos de filme.
	<ol><li>Aberto o TIFF multi arquivo usando software de Fiji. Vá para arquivo &#62; abrir selecione o arquivo TIFF multi salvou na etapa 5.4. 
		Nota: Fiji pode ser baixado em jttps://fiji.sc. Imagem J e plugins também pode ser usado para gerar kymographs. Se fazer isso, siga as instruções relevantes para o plugin escolhido...</li> <li>clique a &#34; seleção retangular &#34; botão ( Figura 3 A, seta) e selecione a área de interesse pelo desenho de um retângulo com um mouse de computador (retângulo amarelo na Figura 3 A). Vá até Image &#62; pilhas &#62; ferramentas &#62; fazer Substacks e selecione os números de fatia que estão incluídos no filme. Um substack é gerado.</li>
		<li>Ativar a janela de substack clicando e vá até Image &#62; ajuste &#62; brilho/contraste. Mostra-se uma janela para ajustar o brilho e contraste. Na janela, deslize a parte superior da barra (mínimo) para a direita para que o sinal de fundo desaparece e o segundo top bar (máximo) para a esquerda assim que o movimento vesículas e partículas podem ser vistas muito bem sobre o fundo.</li>
		<li>Vá até Image &#62; pilhas &#62; tempo Stamper. Como o filme é gravado em 4 frames/s na etapa 5.4, o intervalo de tempo é 0,25 s. Assim, digite &#34; 0.25 &#34; no intervalo.</li>
		<li>Gerar um arquivo de filme, selecionando salvar como &#62; AVI do menu arquivo (filme 1 e 2). 
		Nota: Usando plugins apropriado, você pode salvar o arquivo como outros formatos tais como &#34; mpeg4 &#34; ou &#34; mov &#34; arquivos.</li>
	</ol></li> <li>Gerar kymographs.
	<ol><li>Abrir os arquivos originais do filme usando software de FIji novamente e repita os passos 5.6.2 e 5.6.3 para ajustar o brilho e o contraste.</li>
		<li>Clique &#34; segmentado linha &#34; ( Figura 3 B, seta). Usando um mouse, desenhe uma linha segmentada ao longo dos cílios ou axônio (linha amarela, na Figura 3 B).</li>
		<li>Ir para analisar &#62; Multi Kymograph &#62; Multi Kymograph ( Figura 3 C). Aparece a janela de largura de linha ( Figura 3-D). Tipo &#34; 3 &#34; na janela Linewidth e clique Okey ( Figura 3-D).</li>
		<li>Kymograph janela é criada. Salvar a imagem em formato TIFF ou JPEG.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+in+neurons:+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function,+development,+and+disease.">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).</li><li>Holzbaur, E. L., Scherer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules,+axonal+transport,+and+neuropathy.">Microtubules, axonal transport, and neuropathy.</a> N Engl J Med. 365 (24), 2330-2332 (2011).</li><li>Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+axonemal+dyneins+as+studied+in+Chlamydomonas+mutants.">Functional diversity of axonemal dyneins as studied in Chlamydomonas mutants.</a> Int Rev Cytol. 219, 115-155 (2002).</li><li>Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraflagellar+transport+motors+in+cilia:+moving+along+the+cell's+antenna.">Intraflagellar transport motors in cilia: moving along the cell's antenna.</a> J Cell Biol. 180 (1), 23-29 (2008).</li><li>Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraflagellar+transport.">Intraflagellar transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (11), 813-825 (2002).</li><li>Ishikawa, H., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliogenesis:+building+the+cell's+antenna.">Ciliogenesis: building the cell's antenna.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (4), 222-234 (2011).</li><li>Niwa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinhibition+of+a+Neuronal+Kinesin+UNC-104/KIF1A+Regulates+the+Size+and+Density+of+Synapses.">Autoinhibition of a Neuronal Kinesin UNC-104/KIF1A Regulates the Size and Density of Synapses.</a> Cell Rep. 16 (8), 2129-2141 (2016).</li><li>Snow, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+anterograde+intraflagellar+transport+motors+cooperate+to+build+sensory+cilia+on+C.+elegans+neurons.">Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).</li><li>Ou, G., Blacque, O. E., Snow, J. J., Leroux, M. R., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coordination+of+intraflagellar+transport+motors.">Functional coordination of intraflagellar transport motors.</a> Nature. 436 (7050), 583-587 (2005).</li><li>Zhou, R., Niwa, S., Homma, N., Takei, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF26A+is+an+unconventional+kinesin+and+regulates+GDNF-Ret+signaling+in+enteric+neuronal+development.">KIF26A is an unconventional kinesin and regulates GDNF-Ret signaling in enteric neuronal development.</a> Cell. 139 (4), 802-813 (2009).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charcot-Marie-Tooth+disease+type+2A+caused+by+mutation+in+a+microtubule+motor+KIF1Bbeta.">Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIF1Bbeta.</a> Cell. 105 (5), 587-597 (2001).</li><li>Niwa, S., Tanaka, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF1Bbeta-+and+KIF1A-mediated+axonal+transport+of+presynaptic+regulator+Rab3+occurs+in+a+GTP-dependent+manner+through+DENN/MADD.">KIF1Bbeta- and KIF1A-mediated axonal transport of presynaptic regulator Rab3 occurs in a GTP-dependent manner through DENN/MADD.</a> Nat Cell Biol. 10 (11), 1269-1279 (2008).</li><li>Zhou, R., Niwa, S., Guillaud, L., Tong, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+motor,+KIF13A,+controls+anxiety+by+transporting+the+serotonin+type+1A+receptor.">A molecular motor, KIF13A, controls anxiety by transporting the serotonin type 1A receptor.</a> Cell Rep. 3 (2), 509-519 (2013).</li><li>Klassen, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Arf-like+small+G+protein,+ARL-8,+promotes+the+axonal+transport+of+presynaptic+cargoes+by+suppressing+vesicle+aggregation.">An Arf-like small G protein, ARL-8, promotes the axonal transport of presynaptic cargoes by suppressing vesicle aggregation.</a> Neuron. 66 (5), 710-723 (2010).</li><li>Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+microfluidic+devices+for+in+vivo+imaging+of+C.+elegans,+Drosophila+and+zebrafish.">Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li><li>Chai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+cellular+dynamics+during+Caenorhabditis+elegans+postembryonic+development.">Live imaging of cellular dynamics during Caenorhabditis elegans postembryonic development.</a> Nat Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).</li><li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+using+nanoparticle-mediated+immobilization.">Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization.</a> PLoS One. 8 (1), 53419 (2013).</li><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), (2008).</li><li>Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+osm-6,+a+gene+that+affects+sensory+cilium+structure+and+sensory+neuron+function+in+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 148 (1), 187-200 (1998).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nephronophthisis-related+gene+ift-139+is+required+for+ciliogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">The nephronophthisis-related gene ift-139 is required for ciliogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Sci Rep. 6, 31544 (2016).</li><li>Maeder, C. I., San-Miguel, A., Wu, E. Y., Lu, H., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+neuron-wide+analysis+of+synaptic+vesicle+precursor+trafficking.">In vivo neuron-wide analysis of synaptic vesicle precursor trafficking.</a> Traffic. 15 (3), 273-291 (2014).</li><li>Wu, Y. E., Huo, L., Maeder, C. I., Feng, W., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+balance+between+capture+and+dissociation+of+presynaptic+proteins+controls+the+spatial+distribution+of+synapses.">The balance between capture and dissociation of presynaptic proteins controls the spatial distribution of synapses.</a> Neuron. 78 (6), 994-1011 (2013).</li><li>Dwyer, N. D., Adler, C. E., Crump, J. G., L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+dendritic+transport+and+the+AP-1+mu1+clathrin+adaptor+UNC-101+localize+odorant+receptors+to+olfactory+cilia.">Polarized dendritic transport and the AP-1 mu1 clathrin adaptor UNC-101 localize odorant receptors to olfactory cilia.</a> Neuron. 31 (2), 277-287 (2001).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 177-206 (2012).</li><li>Kumar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+Kinesin-3+motor+UNC-104/KIF1A+is+degraded+upon+loss+of+specific+binding+to+cargo.">The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo.</a> PLoS Genet. 6 (11), 1001200 (2010).</li><li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vesicle+protein+SAM-4+regulates+the+processivity+of+synaptic+vesicle+transport.">The vesicle protein SAM-4 regulates the processivity of synaptic vesicle transport.</a> PLoS Genet. 10 (10), 1004644 (2014).</li><li>Blacque, O. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WD+repeat-containing+protein+IFTA-1+is+required+for+retrograde+intraflagellar+transport.">The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport.</a> Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).</li><li>Evans, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+modulation+of+IFT+kinesins+extends+the+sensory+repertoire+of+ciliated+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans.</a> J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li><li>Bindels, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mScarlet:+a+bright+monomeric+red+fluorescent+protein+for+cellular+imaging.">mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging.</a> Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).</li><li>Prevo, B., Mangeol, P., Oswald, F., Scholey, J. M., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differentiation+of+cooperating+kinesin-2+motors+orchestrates+cargo+import+and+transport+in+C.+elegans+cilia.">Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia.</a> Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).</li><li>Robison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detyrosinated+microtubules+buckle+and+bear+load+in+contracting+cardiomyocytes.">Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes.</a> Science. 352 (6284), 0659 (2016).</li><li>Hayashi, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+superresolution+fluorescence+imaging+with+spinning+disk+confocal+microscope+optics.">Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics.</a> Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).</li></ol>

O autor não tem nada para divulgar.

Limitação no que diz respeito a métodos existentes O método descrito aqui é otimizado para observar eventos rápidos como transporte axonal e IFT. Assim, a imobilização é mais priorizada de incubação mais longa. Enquanto nós fomos capazes de observar eventos de tráfico pelo menos 20 min sem perturbação significativa, esse método pode não ser sempre adequado para observar eventos lentos, exigindo mais observações, tais como alongamento do axônio e migração celular. Para mais observ...

Imagem de célula viva é uma ferramenta essencial para a análise de transporte intracelular. Em biologia celular neuronal, análises de transporte axonal com imagens ao vivo da célula são essenciais para a compreensão de função e morfogênese neuronal1. Defeitos no transporte axonal fundamentam várias de doenças neurodegenerativas2. Proteínas de superfamília de cinesina e Dineína realizam transporte axonal anterogradely e retrogradely, respectivamente,1,2.
Cílios são outro compartimento celular em que a rede de microtúbulos e maquinaria de tráfico são altamente desenvolvidos3. Maquinaria de síntese de proteína não está localizada em cílios, o que significa que as proteínas ciliares devem ser transportadas do citoplasma para as pontas dos cílios. Específicos de cílios cinesina e Dineína, chamada cinesina-2 e citoplasmática Dineína-2, respectivamente, os componentes de cílios4, em um fenômeno chamado do transporte (IFT)5de transporte. Imparidade de IFT faz com que um espectro de doenças chamadas ciliopathies6. Assim, é necessária uma análise do mecanismo de IFT por imagens de células vivas para entender os mecanismos básicos de formação ciliar e patogênese.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) é um bom modelo para estudar o transporte axonal e IFT7,8,9. Para observar o IFT, Chlamydomonas tem sido amplamente utilizado como um organismo modelo5,6. Como Chlamydomonas é um organismo unicelular, a relação do IFT com envelhecimento, função neuronal e comportamento seria difícil de analisar. Além disso, não foram aplicadas técnicas genéticas essenciais tais como CRISPR/Cas9 a Chlamydomonas. Em organismos superiores do modelo, tais como ratos e Drosophila, ruptura do transporte axonal e IFT frequentemente causa fenótipos letais porque transporte axonal e IFT são essenciais para a homeostase dos animais 10e a morfogênese 11. No caso dos ratos, transfection e cultura de células é geralmente necessária para observar o transporte axonal e IFT, que requer muitas habilidades e extenso de tempo12,13. Além disso, um monte de contexto fisiológico importante pode ser perdido em culturas de células e linhas celulares. Porque o sistema nervoso não é essencial para a sobrevivência dos vermes, c. elegans mutantes em que o transporte axonal ou IFT são rompidos muitas vezes não são letais7,9,14. Transporte axonal e IFT podem ser diretamente observado na vivo sem dissecação porque c. elegans é transparente e, portanto, é fácil observar marcadores GFP-etiquetado.
Existem vários protocolos para imobilizar o c. elegans, como o uso de um dispositivo de microfluidic15, almofadas de agarose com anestesia16ou microbeads17. A inclusão da anestesia pode inibir os tráfico de eventos em neurônios15. Uma clara desvantagem do método microfluidic-dispositivo é que preparar um dispositivo microfluidic não é sempre fácil. Em vez disso, imobilização por almofadas de agarose e microbeads é uma maneira fácil e conveniente de realizar imagens de lapso de tempo em c. elegans. Aqui, eu descrevo este protocolo básico para imobilizar o c. elegans e visualizar o transporte axonal e IFT na vivo em c. elegans. Comparado a outros métodos, o método descrito aqui não requer equipamentos especiais e é muito mais barato e mais fácil de realizar.

<table><tbody><tr><td>Slideglass (76&amp;nbsp; x 26 mm)</td><td>Matsunami</td><td>S1111</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass (22&amp;nbsp; x 40 mm)</td><td>Matsunami</td><td>C024401</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Wako</td><td>318-01195</td><td></td></tr><tr><td>Polystylene microbeads 0.1 micron</td><td>Polysciences</td><td>#00876</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>TAITEC</td><td>0063288-000</td><td>CTU-mini</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td>widefield microscope</td></tr><tr><td>Spinning disk Scanner</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td><td>spinning disc confocal scanner&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Digital CCD camera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C10600-10B</td><td>ORCA-R2 degital CCD camera</td></tr><tr><td>Objective lens (x100, NA1.4)</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 100XO</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipette (5 inch)</td><td>IWAKI</td><td>IK-PAS-5P</td><td></td></tr><tr><td>Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm)</td><td>IWAKI</td><td>9820TST15-105NP</td><td></td></tr><tr><td>TV9211: &lt;em&gt;wyIs251&lt;/em&gt;</td><td>Laboratory of Kang Shen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>OTL11: &lt;em&gt;mnIs17&lt;/em&gt;</td><td>Ref. 27, 29</td><td>N/A</td><td>SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>435064-9000-000</td><td>STEMI 508&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mirror transillumination unit</td><td>Carl Zeiss</td><td>435425-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>platinum wire (0.2 mm)</td><td>Nilaco Corporation</td><td>m78483501</td><td></td></tr><tr><td>60 mm plastic dish</td><td>Falcon</td><td>#351007</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>https://fiji.sc/</td></tr><tr><td>nematode growth medium (NGM)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

immobilization of caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons

Transporte axonal e do transporte (IFT) são essenciais para a função e morfogênese axônio e cílios. Dineína e cinesina superfamília proteínas são motores moleculares que regulam anterógrada e retrógrada, transporte, respectivamente. Estes motores usam redes de microtúbulos como trilhos. Caenorhabditis elegans (C. elegans) é um organismo modelo poderoso para estudar o transporte axonal e IFT na vivo. Aqui, eu descrevo um protocolo para observar o transporte axonal e IFT na vida c. elegans. Carga transportada pode ser visualizada por marcação de proteínas de carga usando proteínas fluorescentes, tais como a proteína verde fluorescente (GFP). C. elegans é transparente e proteínas GFP-etiquetado carga podem ser expressa em células específicas sob promotores específicos de célula. Vermes vivos podem ser corrigidos por microbeads em gel de agarose 10% sem matar ou anestesiar os vermes. Nestas condições, movimentação de carga pode ser diretamente observada nos axônios e cílios de viver c. elegans sem dissecação. Esse método pode ser aplicado para a observação de qualquer molécula de carga em todas as células, modificando as proteínas alvo e/ou as células estão expressos em. As proteínas mais básicas tais como motores moleculares e proteínas do adaptador que estão envolvidas no transporte axonal e IFT são conservadas no c. elegans. Em comparação com outros organismos-modelo, os mutantes podem ser obtidos e mantidos mais facilmente em c. elegans. Combinar este método com vários mutantes de c. elegans pode esclarecer os mecanismos moleculares do transporte axonal e IFT.

Transporte axonal em DA9 neurônio Usando a linha de wyIs251 , o anterógrada e retrógrada transporte axonal de GFP::RAB-3 pode ser gravada simultaneamente no neurônio motor DA9. A velocidade média de anterógrada e retrógrada transporte no axônio do neurônio DA9 dorsal proximal é cerca de 1,8 e 2,6 μm/s, respectivamente22. O número de vesículas em movimento é sobre 0,03 e 0,018 por μm de axônio por s. Assim, para uma obser...

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Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) é um bom modelo para estudar o transporte axonal e intracelular. Aqui, eu descrevo um protocolo para análise de transporte axonal e em c. eleganse in vivo de gravação.

Imobilização de Caenorhabditis elegans , para analisar o transporte intracelular nos neurônios

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

immobilization-caenorhabditis-elegans-to-analyze-intracellular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

8.0K visualizações.  Tohoku University. Caenorhabditis elegans (C. elegans) é um bom modelo para estudar o transporte axonal e intracelular. Aqui, eu descrevo um protocolo para análise de transporte axonal e em c. eleganse in vivo de gravação.

Vídeo: Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

In vivo Calcium Imaging em C. elegans corpo parede músculos

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Bioquímica

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Neurociência

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

Isolação de populações específicas do Neuron do elegans da Caenorhabditis da lombriga

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

Biologia do Desenvolvimento

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose para Imagem de cálcio a longo prazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Um chip microfluídico simples para crescimento a longo prazo e imagem de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Bioengenharia

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the neurotransmitter glutamate, and the excessive stimulation of its postsynaptic receptors. However, information on the subsequent molecular events that culminate in the distinct neuronal swelling morphology of this type of neurodegeneration is lacking. Other aspects, such as changes in specific subcellular compartments, or the basis for the differential cellular vulnerability of distinct neuronal subtypes, remain under-explored. Furthermore, a range of factors that come into play in studies that use in vitro or ex vivo preparations might modify and distort the natural progression of this form of neurodegeneration. It is therefore important to study excitotoxic necrosis in live animals by monitoring the effects of interventions that regulate the extent of neuronal necrosis in the genetically amenable and transparent&#160;model system of the nematode Caenorhabditis elegans. This protocol describes methods of studying excitotoxic necrosis in C. elegans neurons, combining optical, genetic, and molecular analysis. To induce excitotoxic conditions in C. elegans, a&#160;knockout of a glutamate transporter gene (glt-3) is combined with a neuronal sensitizing genetic background (nuls5 [Pglr-1::G&#945;S(Q227L)]) to produce glutamate receptor hyperstimulation and neurodegeneration. Nomarski differential interference contrast (DIC), fluorescent, and confocal microscopy in live animals are methods used to quantify neurodegeneration, follow subcellular localization of fluorescently labeled proteins, and quantify mitochondrial morphology in the degenerating neurons. Neuronal Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) is used to distinctly sort at-risk neurons for cell-type specific transcriptomic analysis of neurodegeneration. A combination of live imaging and FACS methods as well as the benefits of the C. elegans model organism allow researchers to leverage this system to obtain reproducible data with a large sample size. Insights from these assays could translate to novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative diseases.

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

In a C. elegans excitotoxicity model, this protocol employs in vivo imaging to analyze the regulation of necrotic neurodegeneration, the effect of genes encoding candidate mediators, and involvement of mitochondria. Cell dissociation and sorting is used to specifically obtain at-risk neurons for cell-specific transcriptomic analysis of neurodegeneration and neuroprotection mechanisms.

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the ...

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

In vivo Avaliação da Dinâmica e Orientação em Caenorhabditis elegans Neurônios

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Construindo e operando um estágio de resfriamento para imobilizar C. elegans em massa

Assembly and Operation of a Cooling Stage to Immobilize C. elegans on Their Culture Plates

High-resolution in vivo microscopy approaches can reveal subtle information and fine details inside the model animal Caenorhabditis elegans (C. elegans), but require strong animal immobilization to prevent motion blur in the images. Unfortunately, most current immobilization techniques require substantial manual effort, rendering high-resolution imaging low-throughput. Immobilization of C. elegans is greatly simplified by using a cooling approach that can easily immobilize entire populations directly on their cultivation plates. The cooling stage can establish and maintain a wide range of temperatures with a uniform distribution on the cultivation plate. In this article, the whole process of building the cooling stage is documented. The aim is that a typical researcher can build an operational cooling stage in their laboratory following this protocol without difficulty. Utilization of the cooling stage following three protocols is shown, and each protocol has advantages for different experiments. Also shown is an example cooling profile of the stage as it approaches its final temperature and some helpful tips in using cooling immobilization.

Autor em destaque: montagem e operação de um estágio de resfriamento para imobilizar C. elegans em suas placas de cultura  

This paper describes protocols for constructing and operating a cooling stage to immobilize C. elegans on their original cultivation plates en masse.

Montagem e Operação de um Estágio de Resfriamento para Imobilização de C. elegans em Suas Placas de Cultura

High-resolution in vivo microscopy approaches can reveal subtle information and fine details inside the model animal Caenorhabditis elegans (C. elegans), ...

Imobilização de Caenorhabditis elegans , para analisar o transporte intracelular nos neurônios

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