مغ معتمد من قبل منح K08DK101608 و R03DK111473 من مستشفى المعاهد الوطنية للصحة وآذار/مارس من الدايمات مؤسسة منحة رقم 5-FY17-79، جامعة "معهد واشنطن اكتشاف" الأطفال والأطفال سانت لويس، وإدارة طب الأطفال في جامعة واشنطن مدرسة الطب، سانت لويس. كجل معتمد من قبل R01DK104946 (PI: سيلفرمان)، مستشفى سانت لويس للأطفال وجامعة "معهد واشنطن اكتشاف" الأطفال.

ووافق جميع الإجراءات الحيوان في هذه الدراسة أما جامعة واشنطن في سانت لويس رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة (بروتوكول 20160187) أو مؤسسات الرعاية الحيوانية في جامعة بيتسبرغ واستخدام اللجنة (بروتوكول 14103918). تم الحصول على الأمعاء الدقيقة الجنين البشري في أقل من 24 أسبوعا من الحمل وفقا للمبادئ التوجيهية جامعة بيتسبرغ الأنسجة التشريحية الشراء بعد موافقة "مجلس المراجعة المؤسسية" (بروتوكول PRO14100537) من جامعة بيتسبرغ بنك الأنسجة العلوم الصحية من خلال نظام وسيط النزيه. تم الحصول على لبن الثدي البشري الشطب المحددة أو لبن الثدي من معط المبستر مع التنازل عن موافقة من جامعة "بيتسبرغ مجلس المراجعة المؤسسية".
1-سرداب العزلة وإنشاء انتيرويدس من الفئران حديثي الولادة أو السابق لأوانه الأمعاء البشرية
<ol><li>إعداد الوسائط ملاحظة: وسائط الإعلام وينبغي إعداد في هود اليوم قبل عزل سرداب.<ol>
<li>إعداد 1.11 L ثقافة وسائل الإعلام. تبدأ مع 1 لتر المتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو (دميم) مع الجلوكوز 4.5 غرام/لتر ولام الجلوتامين وإضافة 110 مل مصل البقر الجنين (FBS) (تركيز نهائي 10%)، 11 مل الأنسولين المعقمة البنسلين-ستربتوميسين (التركيز النهائي 1%)، و 1.1 مل (النهائي تركيز 0.1%).</li>
		<li>إعداد الخليط 500 مل برنامج تلفزيوني-المضادات الحيوية. تبدأ مع 500 مل 1 × الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو (دببس) بنسبة 10% FBS وإضافة 5 مل الجنتاميسين (التركيز النهائي 1%)، 1 مل الامفوتريسين ب (التركيز النهائي 0.2%)، و 5 مل البنسلين-ستربتوميسين (التركيز النهائي 1%).</li>
		<li>إعداد 30 مل خلية تعطيل وسائط #1. أولاً إعداد 30 مل ثقافة وسائل الإعلام. إضافة 600 حمض الإيثيلين 0.5 M ميليلتر (يدتا) (تركيز نهائي 10 ملم)، 300 ميليلتر الجنتاميسين (التركيز النهائي 1%)، و 60 ميليلتر الامفوتريسين ب (التركيز النهائي 0.2%).</li>
		<li>إعداد 30 مل خلية تعطيل وسائط #2. أولاً إعداد 30 مل ثقافة وسائل الإعلام. إضافة 300 يدتا 0.5 M ميليلتر (التركيز النهائي 5 مم)، 300 ميليلتر الجنتاميسين (التركيز النهائي 1%)، و 60 ميليلتر الامفوتريسين ب (التركيز النهائي 0.2%).</li>
		<li>إعداد 50 مل سرداب ثقافة وسائل الإعلام دون عوامل النمو. قياس 33.4 مل 1 x المتقدمة دميم/و-12 وإضافة 10 مل FBS (التركيز النهائي 20%).<ol>
<li>إضافة 500 ميليلتر البنسلين-ستربتوميسين (التركيز النهائي 1%)، 500 ميليلتر لام الجلوتامين (التركيز النهائي 1%)، 500 ميليلتر الجنتاميسين (التركيز النهائي 1%)، 100 ميليلتر الامفوتريسين ب (التركيز النهائي 0.2%)، ميليلتر 2.5 1 م N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane حمض السلفونيك (حبيس) (تركيز النهائي 0.05 مم)، 500 ميليلتر 100 مم ن-أسيتيل (التركيز النهائي 1 ملم)، 500 ميليلتر 100 x N-2 الملحق، 1 مل 50 س خالية من المصل الملحق (مثلاً، B-27) ناقص فيتامين (أ)، و 500 ميليلتر 1 مم 100 × Y-27632.</li>
		</ol>
</li>
		<li>إعداد 1 مل سرداب ثقافة وسائل الإعلام مع عوامل النمو. أولاً إعداد 1 مل من "وسائط الثقافة سرداب دون عوامل النمو". إضافة 2.5 ميليلتر 40 ميكروغرام/مل Wnt3a (تركيز نهائي 100 نانوغرام/ملليلتر)، 1 ميليلتر 100 ميكروغرام/مل رأس (تركيز نهائي 100 نانوغرام/ملليلتر) و 2 ميليلتر 250 ميكروغرام/مل R-سبوندين (تركيز نهائي 500 نانوغرام/ملليلتر) 0.5 ميليلتر 100 ميكروغرام/مل لو (التركيز النهائي 50 نانوغرام/مل).</li>
	</ol></li>
	<li>عزل سرداب
	<ol>
<li>مكان solubilized استخراج غشاء الطابق السفلي (انظر الجدول للمواد) على الجليد الذوبان قبل بداية. ملاحظة: سوف بلمرة الغشاء الحفاظ على الجليد أو أنها.</li>
		<li>امتثالا لبروتوكول رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة للفئران أكثر من 14 يوما عمر، euthanize الفئران مع اثنين من الأساليب للقتل الرحيم مع الثانية يجري إجراء مادية لضمان الموت. ملاحظة: للفئران أقل من 14 يوما عمر، قطع الرأس هو الإجراء القياسي باستخدام مقص.</li>
		<li>باستخدام المقص والملقط، جعل شق عمودي أسفل خط الوسط من البطن، عن طريق الجلد والصفاق، لطول البطن. المكوس في الأمعاء من المعدة للأعور مع المقص وإزالة في مساريق مع الملقط. ملاحظة: استخدمت عمرها يومين الأسبوع الذكور والإناث C57BL/6J الماوس الجراء، كل وزنها 5.5-7 غ، لعزل سرداب. يمكن استخدام أي عمر أو حجم الماوس لعزل سرداب.</li>
		<li>لتحضير الأمعاء المقطوع حديثا لعزل سرداب، ضع الأمعاء مباشرة، وقطع الأمعاء طوليا طول كامل باستخدام مقص. ملاحظة: الماوس والأمعاء البشرية يمكن إعداد المثل.</li>
		<li>تنظيف البراز من الأمعاء بلطف تهز الأمعاء ذهابا وإيابا في طبق بتري مملوءة "خليط" PBS-المضادات الحيوية باستخدام الملقط.</li>
		<li>إضافة 30 مل من الخلية تعطيل وسائط #1 إلى أنبوب مخروطي 50 مل. يقتطع 0.5 سم طول القطع مباشرة في الأنبوب الأمعاء. تعيين الأنبوب دلو الجليد وتحرض بلطف على شاكر على أقل سرعة لمدة 15 دقيقة.</li>
		<li>بينما الأنسجة على شاكر، الحصول على لوحات 24 أو 48 جيدا تنمو الأقبية إذا انتيرويدس التي ستستخدم للجيش الملكي النيبالي، والحمض النووي، أو عزل البروتين. استخدام الدائرة 8-بئر الشرائح تنمو الأقبية إذا انتيرويدس التي ستستخدم لكل جبل تصوير [كنفوكل].</li>
		<li>في هود، إضافة 15 ميليلتر من الغشاء إلى الجزء السفلي من كل بئر من لوحة كذلك 24 أو 48. في حالة استخدام شرائح الدائرة، إضافة 9 ميليلتر من الغشاء إلى الجزء السفلي من كل دائرة. ملاحظة: ضبط حجم الغشاء وفقا لحجم اللوحة إذا لزم الأمر.</li>
		<li>انتشر بسرعة الغشاء الطابق السفلي مع طرف ماصة حيث أن الغشاء الطابق السفلي ويشكل طبقة رقيقة على الجزء السفلي من البئر. ضع اللوحة في 37 درجة مئوية في حاضنة مدة 30 دقيقة للسماح بلمرة الغشاء الطابق السفلي. ملاحظة: سوف لا نعلق الأقبية إذا لم يكن الغشاء طبقة رقيقة أو إذا كان الغشاء يحتوي على فقاعات الهواء.</li>
		<li>وبعد 15 دقيقة على شاكر، تصفية الأنسجة من خلال مصفاة 100 ميكرومتر. تجاهل في التدفق من خلال.</li>
		<li>إضافة 30 مل خلية تعطيل وسائط #2 إلى أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد. إزالة الأنسجة من مصفاة وإضافة إلى الأنبوب.</li>
		<li>تعيين الأنبوب دلو الجليد وتحرض بلطف على شاكر على أقل سرعة لمدة 15 دقيقة.</li>
		<li>وبعد 15 دقيقة على شاكر، تصفية الأنسجة من خلال مصفاة 100 ميكرومتر. الحفاظ على التدفق من خلال في هذه الخطوة، في حالة منخفضة الغلة في خطوات لاحقة. ملاحظة: يجب أن تظل جميع التدفق عبر أنابيب على الجليد.</li>
		<li>إضافة 15 مل دميم مع الجلوكوز 4.5 غرام/لتر ولام الجلوتامين إلى أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد. إزالة الأنسجة من مصفاة وإضافة إلى الأنبوب. قوة هزة الأنبوبة باليد لتصفية س. 10 من خلال مصفاة 100 ميكرومتر وجمع التدفق من خلال. كرر حتى يتضمن التدفق من خلال لا الجسيمات.</li>
		<li>في هود، تصفية التدفق من خلال من الخطوة السابقة في أنبوب مخروطي 50 مل جديدة باستخدام 70 ميكرومتر مصافي للأنسجة الماوس أو 100 ميكرومتر مصافي للأنسجة البشرية. ملاحظة: مصافي إضافية على أهبة الاستعداد، وصب ببطء كما سوف تسد مصافي بالحطام.</li>
		<li>الطرد المركزي الأنبوب في ز 200 x دقيقة 8 في 4 درجات مئوية والمكان مباشرة دلو الجليد في غطاء محرك السيارة. إزالة المادة طافية ماصة دون إزعاج بيليه. ريسوسبيند بيليه مع إجمالي المبلغ المطلوب من "وسائل الإعلام ثقافة سرداب دون عوامل النمو". ملاحظة: أقبية المخصب هي طبقة 'الرملية' بيليه. يتطلب كل 250 ميليلتر من "وسائط الثقافة سرداب دون عوامل النمو".</li>
	</ol></li>
	<li>إنشاء انتيرويدس
	<ol>
<li>لوحة الخليط سرداب وسائل الإعلام مباشرة على الغشاء السفلي.</li>
		<li>راجع الأقبية مجهر لضمان عزل العملية كانت ناجحة. ملاحظة: خلايا وكرات من الخلايا المرغوب فيها. يتم مطلي الأقبية الفردية حوالي 100 كل بئر.</li>
		<li>احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية ح 3 السماح الأقبية على التمسك بالغشاء الطابق السفلي. ملاحظة: هذا الاحتضان مع "وسائل الإعلام ثقافة سرداب دون عوامل النمو".</li>
		<li>ببطء قم بإزالة وسائط الإعلام والاقبية الزائدة التي فشل في إرفاق باستخدام ماصة P-200. ملاحظة: عدم الإزعاج في الغشاء كما يمكن أن تصبح فكها الأقبية المرفقة.</li>
		<li>إضافة 250 ميليلتر من "وسائط الثقافة سرداب مع عوامل النمو" ببطء لكل بئر. ملاحظة: 24-، لوحات 48، حسنا، أو دائرة الشرائح، 250 ميليلتر من "وسائط الثقافة سرداب مع عوامل النمو" غير كافية.</li>
		<li>استبدال وسائط الإعلام كل يومين مع الطازجة "سرداب وسائط الثقافة مع عوامل النمو" لمدة 5 أيام قبل العلاجات للسماح لمرفق الأمثل وتحقيق النمو.</li>
	</ol></li>
</ol>2. الماوس جمع حليب الثدي
<ol><li>فصل سد C57BL/6J المرضعات بعد الولادة 7-12 يوما من الجراء لها ح 6 قبل الحلب.</li>
	<li>تخدير السد المرضعات مع إيسوفلوراني عن طريق مخروط الآنف وإدارتها حقن تحت الجلد من الاوكسيتوسين في 0.15 وحدة دولية/كغ من وزن الجسم. انتظر 3 دقائق قبل محاولة حلب الداخلي.</li>
	<li>تنظيف قناني مع الإيثانول 70% قبل الحلب الداخلي واسمحوا جافة.</li>
	<li>استخراج الحليب من قناني واحد في وقت واحد باستخدام مضخة الثدي البشري كهربائية بأنابيب سيليكون الحجم لتناسب قناني الماوس إلى أنبوب جمع 5 مل. ملاحظة: قد مضخات الثدي الأمثل إعدادات اثنين، أحدهما للسرعة وواحد لشفط. فمن الأفضل أن تبدأ مع الإعدادات الأدنى لكل وزيادة سواء ببطء حتى يتم استخراج الحليب. ومن الناحية المثالية، سوف يكون العائد الإجمالي ~ 500 ميليلتر-1 مل حليب الثدي الماوس كل المرضعات السد.</li>
	<li>حليب الثدي فورا اليكووت ومخزن في-80 درجة مئوية. ملاحظة: تجنب تجميد/ذوبان دورات.</li>
	<li>علاج انتيرويدس في يوم 5 مع 50 ميليلتر/ملليلتر من حليب الثدي الماوس كل مل "سرداب الثقافة الإعلامية" مع عوامل النمو عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.</li>
</ol>3-أسرة جبل تلطيخ من انتيرويدس
<ol><li>
إعداد الكواشف
	<ol>
<li>إعداد برنامج تلفزيوني 1 x 16 مل كل 8 آبار.</li>
		<li>إعداد 2 مل 4% بارافورمالدهيد (PFA) في برنامج تلفزيوني x 1 الواحدة 8 آبار.</li>
		<li>إعداد 2 مل 0.1% X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني 1 x الواحدة 8 آبار.</li>
		<li>إعداد مل 24 توين PBS (ببست هو 0.1% توين 20 س 1 في برنامج تلفزيوني) كل 8 آبار.</li>
		<li>إعداد 2 مل 10% حمار عادي المصل (NDS) في 0.1% ببست (10% NDS/ببست) كل 8 آبار.</li>
		<li>إعداد مل 4 1% NDS في 0.1% ببست (1% NDS/ببست) كل 8 آبار.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
تلوين يوم 1
	<ol>
<li>نضح إيقاف العلاجات وتغسل انتيرويدس مع برنامج تلفزيوني. إضافة 250 ميليلتر 4% منهاج العمل كل بئر. مكان في الدوار ح 1-2 في 4 درجات مئوية. إزالة 4% منهاج عمل بيجين مع ماصة.</li>
		<li>أغسل 4 مرات مع 250 ميليلتر/البئر 1 × برنامج تلفزيوني. مكان في الدوار لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). ملاحظة: من الممكن تخزين اللوحة لمدة 1-2 يوما في 4 درجات مئوية إذا لزم الأمر.</li>
		<li>إضافة 250 ميليلتر/بئر 0.1% X-100 تريتون. احتضانها ح 1 في إزالة الرايت 0.1% X-100 تريتون مع ماصة.</li>
		<li>أغسل 4 مرات مع 250 ميليلتر/البئر 1 × برنامج تلفزيوني. مكان في الدوار لمدة 15 دقيقة في الرايت</li>
		<li>إضافة 250% 10 ميليلتر/بئر NDS/ببست. احتضان لمدة 45 دقيقة في إزالة الرايت 10% NDS/ببست مع ماصة.</li>
		<li>إضافة جسم ميليلتر/البئر الرئيسي 250، 1/250 المخفف في 1% NDS/ببست، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. ملاحظة: إضعاف جسم الأمثل يختلف وفقا للشركة المصنعة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
تلوين يوم 2
	<ol>
<li>غسل 5 مرات على الأقل لمدة 4-5 ح مع 250 ميليلتر/بئر ببست. ضع على محور دوار الساعة 4 درجات مئوية بين كل غسل.</li>
		<li>إضافة الأجسام المضادة الثانوية ميليلتر/بئر 250، 1/1,000 المخفف في 1% NDS/ببست. التفاف اللوحة في إحباط واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
تلوين يوم 3
	<ol>
<li>إضافة 250 ميليلتر/بئر النووية وصمة عار 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) لمدة 15 دقيقة. ملاحظة: الاحتفاظ اللوحة في الظلام.</li>
		<li>أغسل 6 مرات مع 250 ميليلتر/بئر ببست. مكان في الدوار لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية بين كل غسل.</li>
		<li>جبل ساترة في دائرة الشريحة مع تركيب وسائط.</li>
		<li>التقاط صور مع 40 × مجهر [كنفوكل] موضوعية وتقديم المثل في محرر رسومات نقطية (انظر الجدول للمواد).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Patel, R. M., Denning, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+use+of+prebiotics,+probiotics,+and+postbiotics+to+prevent+necrotizing+enterocolitis:+what+is+the+current+evidence?.">Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence?.</a> Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).</li><li>Caplan, M. S., Jilling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+concepts+in+necrotizing+enterocolitis.">New concepts in necrotizing enterocolitis.</a> Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).</li><li>Henry, M. C., Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necrotizing+enterocolitis.">Necrotizing enterocolitis.</a> Annu Rev Med. 60, 111-124 (2009).</li><li>Lin, P. W., Stoll, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necrotising+enterocolitis.">Necrotising enterocolitis.</a> Lancet. 368 (9543), 1271-1283 (2006).</li><li>Neu, J., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necrotizing+enterocolitis.">Necrotizing enterocolitis.</a> N Engl J Med. 364 (3), 255-264 (2011).</li><li>Bartick, M., Reinhold, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burden+of+suboptimal+breastfeeding+in+the+United+States:+a+pediatric+cost+analysis.">The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis.</a> Pediatrics. 125 (5), e1048-e1056 (2010).</li><li>Bisquera, J. A., Cooper, T. R., Berseth, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+necrotizing+enterocolitis+on+length+of+stay+and+hospital+charges+in+very+low+birth+weight+infants.">Impact of necrotizing enterocolitis on length of stay and hospital charges in very low birth weight infants.</a> Pediatrics. 109 (3), 423-428 (2002).</li><li>Leaphart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+TLR4+in+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis+by+modulating+intestinal+injury+and+repair.">A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair.</a> J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).</li><li>Gribar, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+expression+and+signaling+of+TLR4+and+TLR9+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+necrotizing+enterocolitis.">Reciprocal expression and signaling of TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis.</a> J Immunol. 182 (1), 636-646 (2009).</li><li>Good, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+fluid+inhibits+Toll-like+receptor+4+signaling+in+the+fetal+and+neonatal+intestinal+epithelium.">Amniotic fluid inhibits Toll-like receptor 4 signaling in the fetal and neonatal intestinal epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11330-11335 (2012).</li><li>Good, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk+protects+against+the+development+of+necrotizing+enterocolitis+through+inhibition+of+Toll-like+receptor+4+in+the+intestinal+epithelium+via+activation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Breast milk protects against the development of necrotizing enterocolitis through inhibition of Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium via activation of the epidermal growth factor receptor.</a> Mucosal Immunol. 8 (5), 1166-1179 (2015).</li><li>Yazji, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+TLR4+activation+impairs+intestinal+microcirculatory+perfusion+in+necrotizing+enterocolitis+via+eNOS-NO-nitrite+signaling.">Endothelial TLR4 activation impairs intestinal microcirculatory perfusion in necrotizing enterocolitis via eNOS-NO-nitrite signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).</li><li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics.">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).</li><li>Bober-Olesinska, K., Kornacka, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+glutamine+supplemented+parenteral+nutrition+on+the+incidence+of+necrotizing+enterocolitis,+nosocomial+sepsis+and+length+of+hospital+stay+in+very+low+birth+weight+infants.">Effects of glutamine supplemented parenteral nutrition on the incidence of necrotizing enterocolitis, nosocomial sepsis and length of hospital stay in very low birth weight infants.</a> Med Wieku Rozwoj. 9 (3 Pt 1), 325-333 (2005).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+decreases+lipopolysaccharide-induced+intestinal+inflammation+in+infant+rats.">Glutamine decreases lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation in infant rats.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 286 (6), G914-G921 (2004).</li><li>Good, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+milk+oligosaccharide+2'-fucosyllactose+attenuates+the+severity+of+experimental+necrotising+enterocolitis+by+enhancing+mesenteric+perfusion+in+the+neonatal+intestine.">The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine.</a> Br J Nutr. 116 (7), 1175-1187 (2016).</li><li>Jantscher-Krenn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+milk+oligosaccharide+disialyllacto-N-tetraose+prevents+necrotising+enterocolitis+in+neonatal+rats.">The human milk oligosaccharide disialyllacto-N-tetraose prevents necrotising enterocolitis in neonatal rats.</a> Gut. 61 (10), 1417-1425 (2012).</li><li>Akin, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+lactoferrin+to+prevent+nosocomial+sepsis+and+necrotizing+enterocolitis+of+premature+neonates+and+effect+on+T-regulatory+cells.">Oral lactoferrin to prevent nosocomial sepsis and necrotizing enterocolitis of premature neonates and effect on T-regulatory cells.</a> Am J Perinatol. 31 (12), 1111-1120 (2014).</li><li>Amin, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+supplementation+prevents+necrotizing+enterocolitis+in+the+premature+infant.">Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant.</a> J Pediatr. 140 (4), 425-431 (2002).</li><li>Rodgers, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+aspects+of+milk+collection+in+the+rat.">Practical aspects of milk collection in the rat.</a> Lab Anim. 29 (4), 450-455 (1995).</li><li>DePeters, E. J., Hovey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+collecting+milk+from+mice.">Methods for collecting milk from mice.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).</li><li>Willingham, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milk+collection+methods+for+mice+and+Reeves'+muntjac+deer.">Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li><li>Saxena, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Intestinal+Enteroids:+a+New+Model+To+Study+Human+Rotavirus+Infection,+Host+Restriction,+and+Pathophysiology.">Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology.</a> J Virol. 90 (1), 43-56 (2015).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Enteroids/Colonoids+and+Intestinal+Organoids+Functionally+Recapitulate+Normal+Intestinal+Physiology+and+Pathophysiology.">Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology.</a> J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li><li>Drummond, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteroviruses+infect+human+enteroids+and+induce+antiviral+signaling+in+a+cell+lineage-specific+manner.">Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).</li><li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids.">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li></ol>

وقد الكتاب شيئا للكشف ولا يوجد تضارب في المصالح.

ظهارة الأمعاء تتكون من العديد من الأنواع الفرعية الخلوية التي هي مسؤولة عن توفير الدفاع المضيف ضد مسببات الأمراض والمحافظة على سلامة جدار الأمعاء، ويمكن أن تكون خرقت في الآلية المرضية للعديد من الأمراض. بينما نماذج حيوانية ويمكن إيجاز بعض جوانب هذا المرض، النموذج السابقين فيفو انتي...

التهاب الأمعاء النّاخر (NEC) هو السبب الرئيسي للوفاة من الأمراض المعوية الخدج، التي تؤثر على ما يقرب من 1 في 10 الرضع المولودين قبل 29 أسبوعا من الحمل1،،من23. نصف الرضع مع تقدم اللجنة الوطنية للانتخابات بشكل أشد، حيث البقاء على قيد الحياة هو فقط 10-30 ٪4،5. في الولايات المتحدة، ما يقدر 2 بیلیون دولار أمريكي سنوياً تنفق علاج الرضع مع اللجنة الوطنية للانتخابات6،7، ولكن معدل البقاء على قيد الحياة ولا العلاج قد تغيرت على مدى السنوات ال 30 الماضية. الآلية المرضية للجنة الوطنية للانتخابات تتميز بإصابة الأمعاء وضعف الأغشية المخاطية الشفاء8،9،10،11، ومع ذلك، مما يشير إلى الممرات المؤدية إلى تفاقم الاستجابة الالتهابية وآليات لعكس الالتهاب ما زالت مفهومة.
إدارة لبن الثدي البشري قد وجد أن تكون استراتيجية وقائية فقط ضد NEC الخدج. وقد أظهرنا سابقا أن لبن الأم يحمي ضد تطوير اللجنة الوطنية للانتخابات عن طريق تثبيط مستقبلات عدد القتلى مثل مستقبلات المناعة الفطرية 4 (TLR4) في ظهارة الأمعاء عن طريق مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) مما يشير إلى مسار11. مكملات حليب الثدي لصيغة تجريبية NEC يخفف الاستجابة الالتهابية في NEC كما يتبين من تثبيط استموات enterocyte وإعادة الانتشار انتيروسيتي بطريقة تعتمد على نمو البشرة EGFR11وعامل (مماثلة). وفي دراسة أخرى، تبين أن النترات، عنصرا آخر من حليب الثدي، ويساهم في طبيعته الواقية من خلال تحوير التروية المعوية، بالمقارنة مع الرضع، التي تفتقر إلى نترات وقد تسهم في زيادة تواتر NEC في صيغة تغذية الرضع12،13. وتشمل المركبات الأخرى الموجودة في لبن الأم التي أظهرت أن تشارك في الحماية ضد لجنة الانتخابات الوطنية oligosaccharides اللبن البشري، ارجينين، الجلوتامين، و lactoferrin14،،من1516، 17،،من1819. هذه العناصر المفيدة من لبن الثدي تكشف عن ضرورة استخدامه في الوقاية من اللجنة الوطنية للانتخابات، ولكن أيضا التشديد على أهمية دراسة الآليات، مما يشير إلى مسارات، والتأثيرات الخلوية تشارك في كيف حليب الثدي هو التوسط للحماية من NEC .
من أجل إجراء مزيد من الدراسة الخصائص الواقية من لبن الثدي في نموذج الفأر من اللجنة الوطنية للانتخابات، قمنا بتطوير تقنية مبتكرة وسهلة الاستخدام عن طريق الماوس التي يمكن استخراج حليب الثدي من سد أنيسثيتيزيد استخدام الثدي البشري كهربائية مضخة11،12 . هذه الاستراتيجية للحصول على حليب الثدي الماوس مفيد، ليس فقط لأن مضخات الثدي البشري متاحة وفعالة في الحصول على حليب الثدي، بل أيضا لأن هذا الأسلوب يسمح بتحليل حليب الثدي إبلاغها. نتيجة لذلك نحن يمكن مقارنة آثار الماوس حليب الثدي حليب الثدي البشري المعرب عنها، فضلا عن المبستر المتبرع البشري الحليب من بنك حليب في نماذج إبلاغها. يسمح هذا الأسلوب لدراسة مكونات لبن الثدي فيما يتعلق بمساهمتها في منع اللجنة الوطنية للانتخابات. غيرها من المحققين قد وضعت أساليب استخراج حليب الثدي، ولكن هذه التقنيات اليدوية، وعادة ما تتطلب أكثر من مختبر الأعضاء20،،من2122. ويرد هنا أسلوب سهل التي يمكن استخدامها بواسطة تعديل مضخة الثدي كهربائية بشرية لجمع الحليب من ماوس. يمكن أيضا تطبيق هذه التقنية إلى أنواع أخرى.
استجواب الممرات مما يشير إلى المشاركة مع اللجنة الوطنية للانتخابات على نحو كاف، تلزم نظم نموذجية لتقييم جميع أنواع خلايا مختلفة من المعروف أن تتأثر في عملية المرض. هنا، نحن نناقش واحدة مثل هذا النظام النموذجي-انتيرويدس-وإنشائها من الماوس والأمعاء البشرية. انتيرويدس المعوية البشرية (هييس) وبخاصة تقديم وعود كبيرة، لأنها توفر مبتكرة ومتنوعة جينياً السابقين فيفو بشرية نموذجا للمساعدة في دراسة العمليات الفيزيولوجية المرضية التي تحدث في الجهاز الهضمي 23-انتيرويدس تم العثور على أن تكون مثقف طويل الأجل ويمكن أن تجمد ل استخدام لاحق23، وخلافا "البشرية أورجانويدس المعوية" (هيوس)، يتم وضع الذين الثقافات من الخلايا الجذعية pluripotent إيندوسيبلي، يتم إنشاء انتيرويدس من الخلايا الجذعية في24من الخبايا المعوية المعزولة. انتيرويدس تتطلب صيانة أقل، ويمكن أن تكون مصابة بسرعة25، ويمكن أن تنشأ بسهولة نظراً الخبايا المعوية هي أكثر تمايزاً من هيوس23. ولذلك، نقدم هيس العديد من المزايا على التقنيات الموجودة لأنه يمكن تطويرها ليحمل الخصائص التركيبية والوظيفية الخاصة بالمنطقة ل ظهارة المعدة والأمعاء البشرية23. استخدام انتيرويدس خيار فعال للغاية عندما تحتاج إلى نموذج الإنسان من الأمعاء، مع التقيد بالقيود الخاصة بالمنطقة وسهولة الاستخدام. هنا نظهر تقنية عزل والحفاظ على الأولية المستمدة من الخلايا الجذعية الصغيرة الأمعاء انتيرويدس من الفئران والإنسان الخدج.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Humulin N (Insulin)</td><td>Eli Lilly And Company</td><td>0002-8315</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>1x Advanced DMEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3537</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>100x N-2 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>50x B-27 Supplement Minus Vitamin A</td><td>Gibco</td><td>08-0085SA</td><td></td></tr><tr><td>100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse Wnt3a Protein</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1324-WN</td><td></td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse R-Spondin 1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3474-RS</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish</td><td>Eppendorf</td><td>0030700112</td><td></td></tr><tr><td>24-Well Cell Culture Plate</td><td>Eppendorf</td><td>0030722116</td><td></td></tr><tr><td>48-Well Cell Culture Plate</td><td>Eppendorf</td><td>0030723112</td><td></td></tr><tr><td>8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System</td><td>Thermo Scientific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical Tube</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;M Sterile Cell Strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;M Sterile Cell Strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2</td><td>Invitrogen</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum (NDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope Leica TCS SP8 X</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS6</td><td>Adobe Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>18 G 1.5 Inch Needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>Oxytocin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3251</td><td></td></tr><tr><td>Human Double Electric Breast Pump</td><td>Lansinoh</td><td>044677530163</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Round Bottom Test Tube</td><td>Corning</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Rubber Stoppers</td><td>Frey Scientific</td><td>560761</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 Antibody</td><td>Abcam</td><td>AB15580</td><td></td></tr><tr><td>Human Mki67 primer F: 5&#039;-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3&#039; R: 5&#039;-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3&#039;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

breast milk enhances growth of enteroids: an ex vivo model of cell proliferation

البشرية الصغيرة انتيرويدس المعوية مستمدة من الأقبية وعندما تزرع في خلايا الجذعية متخصصة تحتوي على جميع أنواع الخلايا الظهارية. القدرة على وضع انتيرويد البشر السابقين فيفو ثقافة نظم مهمان لنموذج المعوية الفيزيولوجيا المرضية ودراسة الاستجابات الخلوية خاصة المعنية. في السنوات الأخيرة، انتيرويدس من البشر والفئران التي تستزرع، باساجيد، وراهن بعيداً لاستخدامها في المستقبل في عدة مختبرات عبر العالم. يمكن استخدام هذا النظام الأساسي انتيرويد لاختبار آثار مختلف العلاجات والأدوية، وما هي الآثار التي تمارس على أنواع مختلفة من الخلايا في الأمعاء. هنا، على بروتوكول لإنشاء الأولية المستمدة من الخلايا الجذعية الصغيرة المعوية انتيرويدس المستمدة من الفئران حديثي الولادة ويتم توفيرها من الأمعاء البشرية سابقا لأوانه. وعلاوة على ذلك، استخدمت هذا النظام الثقافي انتيرويد لاختبار آثار حليب الثدي إبلاغها. حليب الثدي الماوس يمكن الحصول على كفاءة استخدام مضخة الثدي البشري معدلة ويمكن بعد ذلك استخدام الماوس أعرب الحليب لتجارب بحثية أخرى. نحن الآن إثبات آثار الماوس المعرب عنها، والبشرية، ولبن الثدي من معط على نمو وانتشار انتيرويدس المستمدة من الفئران حديثي الولادة أو الأمعاء البشرية سابقا لأوانه.

سعينا أولاً للتحقيق عما إذا كانت أعربت عن لبن الثدي البشري أو لبن الثدي من معط المبستر أثرا في انتيرويدس الأمعاء الصغيرة. وفي الواقع، حليب الأم ولبن الأم المانحة زيادة نمو الماوس الولدان (الشكل 1A) والسابق لأوانه المشتقة البشرية انتيرويدس (الشك...

Watch this Scientific Journal Video about Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation at JoVE.com

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

حليب الثدي يعزز نمو انتيرويدس: نموذج فيفو السابقين من تكاثر الخلايا

هذا البروتوكول يصف كيفية إنشاء نظام ثقافة انتيرويد من الماوس الولدان أو الأمعاء البشرية المبكرة، فضلا عن طريقة فعالة لجمع الحليب من الفئران.

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

breast-milk-enhances-growth-enteroids-an-ex-vivo-model-cell

Research

JoVE Journal

Medicine

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

19.4K Views.  Washington University School of Medicine. هذا البروتوكول يصف كيفية إنشاء نظام ثقافة انتيرويد من الماوس الولدان أو الأمعاء البشرية المبكرة، فضلا عن طريقة فعالة لجمع الحليب من الفئران.

Video: Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

تنظيم المغذيات عن طريق تغذية مستمرة لتوسيع نطاق واسع من خلايا الثدييات في الأجسام الشبه الكروية

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Bioengineering

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

ماماري الظهارية والبطانية الخلايا كرويدات كنموذج وظيفي محتمل في المختبر لأبحاث سرطان الثدي

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Cancer Research

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to digest solid food. This process is termed suckling-to-weaning transition and results in the replacement of neonatal epithelium with adult epithelium which goes hand in hand with metabolic and morphological adjustments. These complex developmental changes are the result of a genetic program that is intrinsic to the intestinal epithelial cells but can, to some extent, be modulated by extrinsic factors. Prolonged culture of mouse primary intestinal epithelial cells from late fetal period, recapitulates suckling-to-weaning transition in vitro. Here, we describe a detailed protocol for mouse fetal intestinal organoid culture best suited to model this process in vitro. We describe several useful assays designed to monitor the change of intestinal functions associated with suckling-to-weaning transition over time. Additionally, we include an example of an extrinsic factor that is capable to affect suckling-to-weaning transition in vivo, as a representation of modulating the timing of suckling-to-weaning transition in vitro. This in vitro approach can be used to study molecular mechanisms of the suckling-to-weaning transition as well as modulators of this process. Importantly, with respect to animal ethics in research, replacing in vivo models by this in vitro model contributes to refinement of animal experiments and possibly to a reduction in the use of animals to study gut maturation processes.

This protocol describes how to mimic suckling-to-weaning transition in vitro using mouse late fetal intestinal organoids cultured for 30 days.

خلاصه الرضاعة إلى الفطام الانتقالية في المختبر باستخدام الغدد المعوية الجنينية

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

Developmental Biology

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

جيل من الأرغن مامري الفسيفساء عن طريق التربسينات التفاضلية

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

إنشاء الإنسان الظهارية Enteroids وColonoids من الأنسجة كامل وخزعة

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

تقييم التنمية وظيفة الغدة الثديية في نماذج الماوس

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Biology

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell monolayers. Although they cannot completely model in vivo complexity, they retain some functionality of the original organ. In cancer models, organoids are commonly used to study tumor cell invasion. This protocol aims to develop and characterize organoids from the normal and irradiated mouse mammary gland tissue to evaluate the radiation response in normal tissues. These organoids can be applied to future in vitro cancer studies to evaluate tumor cell interactions with irradiated organoids. Mammary glands were resected, irradiated to 20 Gy and digested in a collagenase VIII solution. Epithelial organoids were separated via centrifugal differentiation, and 3D organoids were developed in 96-well low-adhesion microplates. Organoids expressed the characteristic epithelial marker cytokeratin 14. Macrophage interaction with the organoids was observed in co-culture experiments. This model may be useful for studying tumor-stromal interactions, infiltration of immune cells, and macrophage polarization within an irradiated microenvironment.

Organoids developed from mouse mammary glands were irradiated and characterized to assess epithelial traits and interactions with immune cells. Irradiated organoids can be used to better evaluate cell-cell interactions that may lead to tumor cell recruitment in irradiated normal tissue.

نمو وتوصيف العضوية المشعة من الغدد الثديية

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue architecture. In current layer-by-layer extrusion bioprinting, individual cells are extruded in a bioink together with complex spatial and temporal cues to promote hierarchical tissue self-assembly. However, this biofabrication technique relies on complex interactions among cells, bioinks and biochemical and biophysical cues. Thus, self-assembly may take days or even weeks, may require specific bioinks, and may not always occur when there is more than one cell type involved. We therefore developed a technique to directly bioprint pre-formed 3D breast epithelial spheroids in a variety of bioinks. Bioprinted pre-formed 3D breast epithelial spheroids sustained their viability and polarized architecture after printing. We additionally printed the 3D spheroids onto vascular endothelial cell networks to create a co-culture model. Thus, the novel bioprinting technique rapidly creates a more physiologically relevant 3D human breast model at lower cost and with higher flexibility than traditional bioprinting techniques. This versatile bioprinting technique can be extrapolated to create 3D models of other tissues in additional bioinks.

The goal of this protocol is to directly bioprint breast epithelial cells as multicellular spheroids onto pre-formed endothelial networks to rapidly create 3D breast-endothelial co-culture models which can be used for drug screening studies.

الطباعة الحيوية المباشرة لـ 3D Multicellular الثدي Spheroids على الشبكات السفحلية

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have recently emerged as a promising system to model gastrointestinal pathologies. However, currently utilized methods for enteroid manipulation either lack access to the apical surface of the epithelium (three-dimensional [3D]) or are time-consuming and resource-intensive (two-dimensional [2D] monolayers). These methods often require additional steps, such as microinjection, for the model to become physiologically translatable. Here, we describe a physiologically relevant and inexpensive protocol for studying NEC in vitro by reversing enteroid polarity, resulting in the apical surface facing outward (apical-out). An immunofluorescent staining protocol to examine enteroid barrier integrity and junctional protein expression following exposure to tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) or lipopolysaccharide (LPS) under normoxic or hypoxic conditions is also provided. The viability of 3D apical-out enteroids exposed to normoxic or hypoxic LPS or TNF-&#945; for 24 h is also evaluated. Enteroids exposed to either LPS or TNF-&#945;, in combination with hypoxia, exhibited disruption of epithelial architecture, a loss of adherens junction protein expression, and a reduction in cell viability. This protocol describes a new apical-out NEC-in-a-dish model which presents a physiologically relevant and cost-effective platform to identify potential epithelial targets for NEC therapies and study the preterm intestinal response to therapeutics.

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

This protocol describes an apical-out necrotizing enterocolitis (NEC)-in-a-dish model utilizing small intestinal enteroids with reversed polarity, allowing access to the apical surface. We provide an immunofluorescent staining protocol to detect NEC-related epithelial disruption and a method to determine the viability of apical-out enteroids subjected to the NEC-in-a-dish protocol.

في المختبر نموذج معوي قمي من التهاب الأمعاء والقولون الناخر

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. Epithelial barrier function requires the integrity of intestinal epithelial cells. While epithelial cell proliferation maintains a continuous layer of cells that forms a barrier, epithelial damage leads to barrier dysfunction. As a result, luminal contents can across the intestinal barrier via an unrestricted pathway. Dysfunction of intestinal barrier has been associated with many intestinal diseases, such as inflammatory bowel disease. Isolated mouse intestinal crypts can be cultured and maintained as crypt-villus-like structures, which are termed intestinal organoids or &ldquo;enteroids&rdquo;. Enteroids are ideal to study the proliferation and cell death of intestinal epithelial cells in vitro. In this protocol, we describe a simple method to quantify the number of proliferative and dead cells in cultured enteroids. 5-ethynyl-2&rsquo;-deoxyuridine (EdU) and propidium iodide are used to label proliferating and dead cells in enteroids, and the proportion of proliferating and dead cells are then analyzed by flow cytometry. This is a useful tool to test the effects of drug treatment on intestinal epithelial cell proliferation and cell survival.

The presented protocol uses flow cytometry to quantify the number of proliferating and dead cells in cultured mouse enteroids. This method is helpful to evaluate the effects of drug treatment on organoid proliferation and survival.

القياس الكمي للخلايا التكاثرية والميتة في Enteroids

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...